Extracto
Antecedentes
El factor de transcripción Snail 1 induce la transición epitelio-mesenquimal transición (EMT), un proceso responsable para la adquisición de capacidad de invasión durante la tumorigénesis. Varios estudios han informado de transcriptomic genes regulados-Snail1 en diferentes tipos de células, muchos de ellos implicados en la adhesión celular. Sin embargo, sólo unos pocos estudios han utilizado la proteómica como herramienta para la caracterización de las proteínas que median la EMT.
Metodología /Principales conclusiones
Se identificaron mediante análisis proteómico mediante electroforesis 2D-DIGE combina con MALDI TOF-TOF y de trampa de iones de espectrometría de masas ESI-lineal de un número de proteínas con funciones variables cuya expresión está modulada por snail1 en células de cáncer de colon humano SW480-ADH. La validación se realizó mediante análisis de transferencia de Western e inmunofluorescencia. Snail1 reprimida varios miembros de la familia 14-3-3 de proteínas de unión /fosfotreonina de fosfoserina y también la expresión de la proteína de proliferación asociada 2G4 (pa2g4) que se localiza principalmente en los cuerpos de Cajal nucleares. En contraste, la expresión de dos proteínas implicadas en el procesamiento del ARN, la escisión y la especificidad de poliadenilación subunidad del factor de 6 (CPSF6) y el factor de empalme prolina /ricos en glutamina (SFPQ), era mayor en las células que expresan Snail 1 que en los controles. La regulación de 14-3-3ε, 14-3-3τ, 14-3-3ζ y pa2g4 por snail1 se reproducen en células de cáncer de colon HT29. Además, se encontró una correlación inversa entre la expresión y 14-3-3σ snail1 en tumores colorrectales humanos.
Conclusiones /Importancia
Hemos identificado un conjunto de nuevas proteínas diana snail1 en el cáncer de colon que amplían los procesos celulares afectadas por Snail 1 y por lo tanto su relevancia para la función celular y el fenotipo
Visto:. Larriba MJ, Casado-Vela J, Pendás-Franco N, R Peña, García de Herreros a, MT berciana, et al. (2010) Novel SNAIL1 proteínas diana en cáncer de colon humano identificado por análisis proteómico. PLoS ONE 5 (4): e10221. doi: 10.1371 /journal.pone.0010221
Editor: Juan Valcárcel, Centro de Regulación Genómica, España |
Recibido: Marzo 4, 2010; Aceptado: March 26, 2010; Publicado: 20 Abril 2010
Derechos de Autor © 2010 Larriba et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Ciencia e Innovación de España (SAF2007-60341, BIO2006-07689, ISCIII-RETIC RD06 /0020/0009 y RD06 /0020/0040), Comunidad de Madrid (S-GEN-0266/2006) y la Unión Europea (MRTN-CT-2005-019496, NucSys). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el factor de transcripción Snail 1 regula la biología de fibroblastos y su regulación por incremento en las células epiteliales causa un cambio a un fenotipo mesenchymatic, un proceso conocido como epitelial-to-mesenquimal transición (EMT). Este es un cambio transdiferenciación en el que las células epiteliales pierden adherencia y la polaridad y adquieren la morfología característica husillo y capacidad migratoria de los fibroblastos como resultado de una alteración drástica del perfil de expresión génica [1], [2]. EMT desempeña importantes funciones fisiológicas durante la embriogénesis y cicatrización de heridas, y también es crucial para la adquisición de la invasividad tumoral, el paso inicial de la cascada metastásica en el cáncer [1], [2].
Snail1 parece tener una función de maestro en la EMT, aunque también se conocen varios otros factores como Snail2 (Slug), ZEB1 (δEF1), Zeb2 (Sip1), TWIST1, E47 y E2-2 para inducir o contribuir a la EMT en diferentes tipos de células [2 ], [3]. Estos factores promueven parcialmente diferentes perfiles de expresión de genes que tienen en común la represión de genes que codifican proteínas de adhesión (E-cadherina, ocludina y varios Claudins) y la inducción de marcadores mesenquimales tales como vimentina, fibronectina, y proteasas y factores que promueven el movimiento de las células [ ,,,0],3], [4]. Snail1 fue la primera represor caracterizado del gen supresor de la invasión
CDH1
que codifica para la proteína de adhesión fundamental E-cadherina [5], [6]. Además, Snail1 Recientemente se ha demostrado para activar Wnt /β-catenina de señalización y el factor nuclear
actividad kappa B
[7], [8], y se abroga la inhibición de la vía Wnt /β-catenina causada por el compuesto antitumoral 1α, 25-dihidroxivitamina D
3 [9].
Snail 1 está regulada positivamente en varios cánceres humanos y se asocia con frecuencia con capacidad de invasión, metástasis y mal pronóstico [3]. Snail1 ARN es indetectable en la mucosa del colon normal, pero se convierte en upregulated en el 60-70% de los cánceres de colon [10] - [12]. Un estudio reciente ha demostrado que la proteína Snail 1 se expresa en el 79% de los tumores de colon, por lo general en la interfase tumor-estroma. Snail1 se encuentra tanto en el tejido del tumor epitelial y del estroma adyacente en 56% de los tumores de colon, mientras que en 21% de los casos sólo está presente en las células del estroma con fenotipo fibroblástico [13].
Un número de estudios se han centrado en el análisis transcriptomic de la EMT promovido por snail1 y otros factores de transcripción, o por genes o agentes tales como Ras oncogénico o transformar β factor de crecimiento que los indujeron [4], [14] - [17]. Sin embargo, sólo unos pocos estudios han utilizado la proteómica como herramienta para la caracterización de las proteínas de la mediación de la EMT [18]. La mayoría de estos estudios han empleado 2D-PAGE seguido por MALDI-TOF espectrometría de masas para identificar las proteínas diferencialmente expresadas-en los tejidos tumorales y /o líneas de células [18] - [20]. Unos pocos estudios han utilizado la tecnología iTRAQ seguido de separación 2D-LC de péptidos y espectrometría de masas [18], [21], [22]. Aquí, hemos utilizado la tecnología 2D-DIGE seguido por MALDI-TOF-TOF y espectrometría de masas de trampa de iones ESI-lineal. La combinación de estas técnicas es un enfoque más sensible y fiable para la identificación de pequeñas diferencias en la expresión de proteínas entre las células de cáncer de colon humanos con niveles bajos o altos de Snail1. Estas técnicas nos han dado la oportunidad de tomar una visión más profunda de los cambios proteómicos asociados a la sobreexpresión de Snail 1. En este estudio, hemos identificado una serie de proteínas previamente desconocidos como objetivos snail1 en células de cáncer de colon humano. Algunos de ellos están implicados en el control de la expresión génica y el fenotipo celular, y son mediadores probables de la acción tumorigénico de snail1.
Resultados
La mayoría de los genes caracterizados previamente regulada en la membrana plasmática de codificación snail1 proteínas implicadas en los componentes de adhesión celular o citoesqueleto. Para ampliar nuestro conocimiento de los efectos snail1 en cáncer de colon humano, se empleó una estrategia de integración para identificar proteínas nucleares regulados por Snail1 en esta neoplasia (Figura 1A). Se utilizó electroforesis 2D-DIGE combinado con MALDI-TOF-TOF y de trampa de iones ESI-lineal espectrometría de masas para comparar el patrón de las proteínas presentes en los extractos nucleares de células SW480-ADH de cáncer de colon humano que expresa un transducidas con retrovirus-(células SNAIL1) snail1 cDNA con la de las células infectadas (células Mock). Un subconjunto de las proteínas identificadas se validó mediante inmunotransferencia de tipo Western y análisis de inmunofluorescencia de células de cáncer de colon humano, y por inmunohistoquímica de biopsias de cáncer de colon humano. Anteriormente hemos caracterizado el modelo celular utilizada en este estudio [7], [10] y se encontró que snail1 sobreexpresión promueve la adquisición de una morfología más células estrelladas (Figura 1B), la represión de los marcadores epiteliales E-cadherina, ocludina y Claudin -7, y la inducción de la proteína mesenquimales Lef-1 (Figura 1C).
(a) Esquema del flujo de trabajo seguido en este estudio. (B) Micrografías representativas de contraste de fase (paneles superiores) e imágenes de inmunofluorescencia confocal láser que muestran la tinción de actina F (paneles inferiores) de las células SW480-ADH Mock y SNAIL1. Barra de escala, 20 micras (paneles superiores) y 10 micras (paneles inferiores). (C) Análisis de transferencia de Western de extractos de células enteras de SW480-ADH Mock y células SNAIL1 que muestran snail1 sobreexpresión y su efecto sobre la expresión de marcadores epiteliales (E-cadherina, ocludina y claudina-7) y mesenquimales (LEF-1). β-tubulina se utilizó como control de carga.
análisis de la expresión diferencial de proteínas de las fracciones nucleares de células de cáncer de colon humanas con expresión alta o baja snail1
Los extractos nucleares a partir de SW480-ADH Mock y células snail1 se analizaron mediante 2D-DIGE tal como se describe en Materiales y Métodos. cambios en el patrón de proteínas fueron cuantitativa y estadísticamente analizados utilizando el software V.6.5 DeCyder teniendo en cuenta los 12 mapas de puntos incluidos en el estudio. La Figura 2 muestra un mapa 2D representante de las proteínas SW480-ADH nucleares. Cada gel fue analizado individualmente para calcular las relaciones de volumen entre las muestras individuales y la piscina interior, que se utilizó como el estándar de referencia. Entonces, todas las imágenes se combinaron y analizaron juntos utilizando el módulo de BVA. Se observaron algunas variaciones en la abundancia de proteínas entre las células Mock y SNAIL1. Un emparejado
t-test
se utilizó para seleccionar 22 puntos cuya expresión variación entre ambos tipos de células fue estadísticamente significativa (de Student
t-test
,
p Hotel & lt; 0,05) . Estos puntos fueron seleccionados como puntos de interés y anotados en el maestro de gel (Figura 2). Identificación de proteínas se realizó mediante dos métodos: (1) de huellas másicas de péptidos utilizando MALDI-TOF-TOF y (2) de trampa de iones ESI-lineal y secuenciación de péptidos MS /MS (aplicación de un tipo restrictivo falso positivo descubrimiento (FDR) de corte, FDR≤1%). En ambos casos, la identificación con más de un péptido era un requisito. Mediante el uso de este doble enfoque, 19 proteínas se identificaron en 17 de 22 puntos (Tabla 1). Sólo cinco proteínas se identificaron mediante MALDI-TOF-TOF debido a los bajos niveles de expresión. Dieciocho proteínas se identificaron mediante la trampa de iones ESI lineal, con dos manchas que contienen más de una proteína. En esos casos, las proteínas se enumeran de acuerdo con el número de péptidos identificados. Cuatro proteínas se identificaron mediante ambas técnicas (Tabla 1).
Los extractos nucleares a partir de SW480-ADH Mock y las células fueron marcadas diferencialmente SNAIL1 con tintes Cy3 y Cy5. Un estándar interno combinación de proteínas a partir de ambos extractos se incluyó en todos los geles después de marcar con colorante Cy2. 3-10 tiras IPG NL se utilizaron para el IEF y el estándar de SDS-PAGE de la segunda dimensión. Representante imagen 2D muestra el mapa de puntos que corresponde al patrón interno, que es común a todos los geles analizados. Spots indicadas con flechas eran informativos para la identificación de proteínas por espectrometría de masas (véase la Tabla 1 para la asignación de código). spots seleccionados mostraron una variación estadística de los ratios de volumen dentro del nivel de confianza 95ª (de Student
t-test
,
p Hotel & lt; 0,05).
el análisis de proteínas ontología de las proteínas identificadas
Entre las proteínas alteradas por la sobreexpresión de Snail 1 identificamos α-catenina (CTNNA1), la PI3K de la subunidad α de regulación (PIK3R1), Caldesmon (CALD1), la escisión y el factor de especificidad de poliadenilación subunidad 6 (CPSF6), y vimentina (VIM) como proteínas upregulated; y la proliferación asociada a la proteína 2G4 (pa2g4, también conocida como proteína de unión a ErbB3-1 o EBP1), proteína GTPasa-activado-Ran específico (RanBP1), y varios miembros de la familia de proteínas 14-3-3 (ywhae, YWHAH y ywhaq ) entre las proteínas downregulated (Tabla 1). A pesar de trabajar con extractos nucleares, sólo 7 de 19 proteínas fueron asignados al compartimento nuclear (CPSF6, WTAP, ENO1, pa2g4, HNRNPH3, RanBP1 y ppia), mientras que los restantes eran preferentemente citosólico o asociadas al citoesqueleto. Sin embargo, no podemos descartar que las últimas proteínas fueron parcial o temporalmente presente en el compartimento nuclear. En cuanto a la función biológica, varias proteínas estaban implicados en la adhesión celular (CTNNA1) o los componentes del citoesqueleto (CALD1, VIM y LASP1). Sin embargo, la mayoría de las proteínas estaban implicados en la transducción de señales (PI3KR1, RanBP1 y los miembros de la familia 14-3-3) y el procesamiento del ARN (CPSF6, WTAP y HNRNPH3) (Tabla 1). Algunas de estas proteínas fueron seleccionados para su validación. Dada la alta homología existente entre las proteínas 14-3-3 y entre algunos de los péptidos identificados (es decir -VISSIEQK- para 14-3-3τ y -VLSSIEQK- para 14-3-3σ, que los hace prácticamente indistinguible), se decidió incluir todos los miembros de la familia en la validación análisis.
validación de proteínas diana candidatos
para obtener una estimación cuantitativa de la expresión de las proteínas diana candidato en SW480-ADH Mock y snail1 células, se analizaron por tres extractos nucleares de transferencia de Western preparados independientemente (N1, N2, N3). Además, los extractos citosólicos de uno de los experimentos (C1) se incluyeron en el análisis (Figura 3A). regulación a la baja Variable (20% a 70%) de 14-3-3 β, ε, σ, se encontró que las proteínas tau y zeta en el núcleo de las células snail1. Para todos ellos, excepto 14-3-3σ la regulación a la baja fue más débil en el citosol que en el núcleo (Figura 3A). Hemos sido capaces de detectar la expresión 14-3-3η ni en el núcleo ni en el citosol, mientras que la de 14-3-3γ no fue afectado por la sobreexpresión Snail1 (datos no mostrados). expresión pa2g4 también fue inferior en ambos núcleo y el citosol de SW480-ADH Snail1 que en las células Mock (Figura 3A).
(A) análisis de transferencia de Western de la expresión de proteínas seleccionadas en citosólico (C) y nuclear ( N) extractos de células SW480-ADH Mock y sNAIL1. HNRNPH3 isoformas (1-4) se indican. Los números debajo de los geles indican la cuantificación de la variación en la expresión entre Snail1 y células Mock después de la normalización de ß-tubulina o Lamin B (citosólica y control nuclear, respectivamente). La significación estadística de los cambios de expresión nucleares promovidas por Snail 1 fue evaluada por dos colas de Student no pareada
t-test
. Fue
p
& lt; 0,001 para 14-3-3ε, 14-3-3σ, 14-3-3ζ, CPSF6 y las isoformas 3 y 4 de HNRNPH3;
p Hotel & lt; 0,01 para 14-3-3τ; y
p Hotel & lt; 0,05 para 14-3-3β y pa2g4. La regulación de SFPQ (
p
= 0,057) y se observó que de las isoformas 1 + 2 de HNRNPH3 (
p
= 0,058) no alcanzó la significación estadística, pero una tendencia clara. (B) Análisis de transferencia Western de la expresión de proteínas seleccionadas en citosólico (C) y las fracciones nucleares (N) de células HT29 Mock y SNAIL1. Los números debajo de los geles indican la cuantificación de la variación en la expresión entre Snail1 y células Mock después de la normalización de ß-tubulina o Lamin B (citosólica y control nuclear, respectivamente). estudio (C) RT-PCR cuantitativa de expresión pa2g4 en SW480-ADH y células HT29 Mock y SNAIL1. expresión 18S rRNA se utilizó para la normalización. La significación estadística se evaluó mediante dos colas de Student no pareada
t-test
, solo asterisco indica
p
. & lt; 0,05
Por el contrario, el nivel de CPSF6 fue mayor en las células snail1 que en las células Mock (Figura 3A). También hemos analizado la expresión del factor de empalme prolina /rica en glutamina (SFPQ), una proteína que se encuentra regulada al alza de 1,59 veces en el análisis proteómico, pero ausente en la Tabla 1, ya que sólo se identificó con un péptido en lugar de 609. Así lo hicimos porque tanto SFPQ y CPSF6 están involucrados en el procesamiento de pre-ARNm y localizados en paraspeckles nucleares [23], lo que sugiere un posible efecto coordinado de snail1. De hecho, se encontró que el aumento de expresión snail1 SFPQ nuclear y también el bajo nivel de SFPQ detectó en el citoplasma (Figura 3A).
La regulación por snail1 fue compleja en el caso de la heterogénea nuclear ribonucleoprotein H3 (HNRNPH3) , que presenta varias isoformas resultantes de splicing alternativo [24]. Los péptidos utilizados en el estudio proteómico para identificar HNRNPH3 indican que el punto de downregulated solamente puede corresponder a las isoformas 1, 2 o 3. El análisis por transferencia Western demostró que la expresión de isoformas 1 y 2 (predijo MW 36,9 y 35,2 kDa, respectivamente) se upregulated por snail1, mientras que la de las isoformas 3 y 4 (31,5 MW predicho y 22,3 kDa, respectivamente) fue fuertemente downregulated en ambos núcleo y el citosol de las células snail1 (Figura 3A). Por lo tanto, la proteína identificada en el análisis proteómico debe ser isoforma 3 de HNRNPH3.
La represión de 14-3-3ε, 14-3-3τ, 14-3-3ζ y pa2g4 por snail1 en extractos nucleares fue reproducido en dos experimentos independientes en otra línea celular de cáncer de colon humano, HT29 (Figura 3B). Además, cuantitativa RT-PCR análisis reveló una disminución del nivel de ARN pa2g4 tanto en células HT29 que expresan Snail 1 SW480-ADH y en comparación con sus respectivas células Mock (Figura 3C).
Distribución subcelular de las proteínas diana SNAIL1
La expresión de algunas de las proteínas diana snail1 validados por Western blot se estudió adicionalmente por inmunofluorescencia y análisis de microscopía confocal. Como se muestra en la Figura 4, el nivel de 14-3-3 β, ε y σ fue mucho menor en ambos núcleo y el citosol de las células SW480-ADH snail1 que en las células Mock. En los tres casos la expresión fue mayor en el citosol que en el núcleo con una relación variable: β & lt; σ & lt; ε. El análisis de inmunofluorescencia también mostró una reducción tanto de la expresión nuclear y citosólico de pa2g4 en células snail1 comparación con las células Mock (Figura 5A). La expresión de pa2g4 tenía un patrón puntiforme bien en ambos núcleo y el citosol, y fue particularmente fuerte en algunos redondo y claramente definida focos nucleares de aproximadamente 0,5 m de diámetro (Figura 5). Doble tinción utilizando anticuerpos contra Coilin (marcador de los órganos Cajal), el TMG-cap de snARNs spliceosomal (marcador de Cajal órganos y manchas nucleares de factores de empalme), Fibrillarin (marcador de nucléolo) y el PML (marcador de cuerpos PML) indicó que la focos nucleares pa2g4 positivos corresponden a los órganos Cajal (Figura 5B). Este resultado se confirmó en las neuronas (datos no mostrados), el tipo de célula donde los cuerpos de Cajal son más prominentes [25]. La función se entiende mejor de los órganos Cajal es la biogénesis de los pequeños nuclear y nucleolar RNPs (snRNPs, snoRNPs) que participan en pre-mRNA de empalme y el procesamiento de pre-rRNA, respectivamente [25], [26]. Los experimentos de tinción doble también mostraron una tinción débil de pa2g4 en el nucleolo (véase la Figura 5B, pa2g4 y Fibrillarin co-tinción), como se ha descrito anteriormente [27].
imágenes de microscopía confocal representativo que muestra la expresión y localización de 14-3-3 β, ε y σ (rojo) en las células SW480-ADH Mock y sNAIL1. la expresión de GFP (verde) no fue modificado por Snail1 y se utilizó como control. Barra de escala, 10 micras.
(A) Imágenes de microscopía confocal representativas que muestran la expresión y localización de pa2g4 (rojo) en las células SW480-ADH Mock y SNAIL1. la expresión de GFP (verde) no fue modificado por Snail1 y se utilizó como control. Barra de escala, 5 micras. (B) Imágenes de microscopía confocal representativo que muestra el doble inmunomarcación para pa2g4 (rojo) y de marcadores moleculares (azul) de los órganos Cajal (Coilin), los órganos Cajal y manchas nucleares de factores de empalme (TMG-cap), nucléolo (Fibrillarin), y PML cuerpos (PML) en las células SW480 Mock-ADH. El color rosa en las imágenes de combinación indica la existencia de colocalización. Barra de escala, 5 micras.
Análisis de los tumores de colon humanos
La represión de varios miembros de la familia 14-3-3 por un factor de transcripción asociado a un tumor que nos llevó a estudiar snail1 la expresión de estas proteínas en cáncer de colon humano. Como 14-3-3σ era el miembro cuya expresión fue más fuertemente reprimida por snail1 tanto en el núcleo y en el citoplasma, se seleccionaron para el estudio de muestras humanas. En primer lugar, analizamos la expresión 14-3-3σ por inmunohistoquímica en una matriz de tejido que contiene pares de muestras normales y tumorales de 46 pacientes con cáncer colorrectal, y se encontró que 14-3-3σ fue altamente expresado tanto por las células epiteliales normales y tumorales, pero no por estromal células (Figura 6A). Como este patrón de expresión de 14-3-3σ era coherente con su represión por parte de un inductor de EMT como nos Snail 1, se decidió realizar un estudio más detallado de 14-3-3σ y expresión snail1 en cortes consecutivos de cinco biopsias de tumores de colon. De acuerdo con estudios anteriores [13], encontramos principalmente snail1 inmunoreactividad en el núcleo de las células con fenotipo mesenquimal dentro del tumor (Figura 6B). Estas células podrían corresponder a las células epiteliales tumorales que han sido sometidos a EMT y /o fibroblastos que han sido activados por el microentorno del tumor [13]. En consecuencia con los datos obtenidos de la matriz de tejido, 14-3-3σ se expresó en ambos núcleo y el citosol de las células epiteliales tumorales, pero estaba ausente en las células del estroma (Figura 6B). Por lo tanto, 14-3-3σ y snail1 tienen patrones de expresión opuestos (epiteliales y del estroma, respectivamente) en el cáncer de colon. Además, la expresión 14-3-3σ se parece mucho a la de la meta de genes Snail 1
CDH1
/E-cadherina y, tal como se propone para este gen, es posible que reprime la expresión snail1 14-3-3σ en mesenquimales las células. inmunohistoquímica imágenes
(a) que muestran la expresión 14-3-3σ en muestras normales y tumorales de colon representativas de los 46 analizados en la matriz de tejido. Las barras indican la ampliación. Las secciones fueron contrastadas con hematoxilina. imágenes (B) muestra la expresión inmunohistoquímica 14-3-3σ y snail1 en dos cortes consecutivos de un tumor del cáncer de colon representante de los cinco analizados. Las barras indican la ampliación. Las secciones fueron contrastadas con hematoxilina. paneles de la derecha son un 3X magnificación de la región indicada en paneles de la izquierda.
Discusión
La identificación de proteínas reguladas por snail1 amplía el conocimiento actual sobre la biología de este factor de transcripción y arroja nueva luz sobre los mecanismos de la EMT y la progresión del cáncer. Elegimos el cáncer de colon como un sistema de trabajo debido a snail1 está regulada positivamente tanto a nivel de ARN y proteínas en esta neoplasia y contribuye a su malignización [10] - [13]. Anteriormente, los perfiles de expresión génica inducida por Snail1 en diferentes sistemas habían sido estudiados por análisis transcriptomic, y la mayoría de los genes diana snail1 identificados codificados para proteínas implicadas en la adhesión celular, matriz extracelular y el citoesqueleto [4], [15], [28] . En este estudio, se realizó un análisis proteómico de extractos nucleares destinados a identificar nuevas proteínas reguladas por snail1 que podrían mediar sus amplios efectos sobre la fisiología celular y el fenotipo.
Nuestro estudio muestra una notable conservación en el patrón global de la energía nuclear la expresión de proteínas en células de cáncer de colon humano que expresan niveles altos o bajos de snail1. Aún así, se han identificado una serie de proteínas snail1 reguladas previamente no caracterizados implicados en diversas funciones celulares. No se encontraron veintidós puntos como desregulado significativamente entre ambos tipos de células con un
p Hotel & lt; 0,05 (de Student
t-test
). Se identificaron diecinueve proteínas diferentes, la mayoría de ellos utilizando el instrumento de trampa de iones ESI-lineal en combinación con un nano-HPLC. Sólo cinco proteínas se identificaron mediante MALDI-TOF-TOF, probablemente debido a la baja expresión de las proteínas presentes en las manchas. Dos puntos (1419 y 1926) contenían más de una proteína. Sin embargo, en lugar de 1419, vimentina fue significativamente más abundante (basado en el número de péptidos identificados) que las otras proteínas y que asigna a que las diferencias en la expresión. En lugar de 1926, el número de péptidos identificados fue bastante similar entre LASP1 y HNRNPH3, lo que hace más difícil la asignación de la expresión diferencial.
Nuestros resultados están de acuerdo con el papel represor transcripcional de snail1, como en 12 de la 17 puntos con proteínas identificadas la expresión fue menor en las células que en las células que expresan Snail 1 Mock, mientras que sólo en cinco de ellos la expresión fue mayor en las células sNAIL1. La represión de las proteínas downregulated podría ser un efecto directo de Snail 1, especialmente en el caso de pa2g4 cuyo nivel de ARN también se redujo en Snail1. Por el contrario, la inducción de la expresión de proteínas por Snail1 debe ser indirecta, mediada por otros factores de transcripción, como se ha informado de las metaloproteasas de la matriz 2 y 9 [29], [30]. Además, se encontró que Snail1 altera el patrón de empalme de HNRNPH3 en las células SW480-ADH. Esto está en línea con los estudios que describen esa snail1 cambia el patrón de corte y empalme de p120-catenina y
zonula occludens
-1 por mecanismos no caracterizados [31], [32].
De acuerdo con la anterior los estudios de transcriptómica, se muestra aquí que snail1 cambia la expresión de las proteínas implicadas en la adhesión celular y el citoesqueleto (CTNNA1, CALD1, VIM y LASP1). Además, y según nuestro conocimiento, por primera vez, nos informan de que snail1 regula las proteínas implicadas en otras funciones celulares como la maduración del ARN (CPSF6, HNRNPH3 y SFPQ) y la señalización intracelular (PI3KR1, RanBP1 y 14-3-3 familia de proteínas). El efecto represivo casi general de Snail 1 sobre la expresión de miembros de la familia 14-3-3 es sorprendente y está de acuerdo con el papel protector de cáncer recientemente propuesto de algunas de estas proteínas [33], [34]. Las proteínas 14-3-3 han sido durante mucho tiempo conocida como proteínas de unión a fosfoserina /fosfotreonina capaces de unirse y modular la interacción entre las proteínas y que participan en los procesos celulares como la señalización, control del ciclo celular, apoptosis, el tráfico intracelular, la estructura del citoesqueleto y la transcripción [34 ], [35]. Sólo en los últimos años varios miembros de la familia 14-3-3 se han relacionado con una variedad de procesos de cáncer. Mientras 14-3-3σ ha sido propuesta como un gen supresor de tumor que está silenciada o inactivada durante la progresión de melanoma y de mama, gástrico, hepatocelular, carcinomas de células escamosas y de ovario [33], [36] - [40]; se ha encontrado sobreexpresado en el cáncer de páncreas [41]. Además, un análisis proteómico mostró que la expresión 14-3-3σ es downregulated en los carcinomas de células de transición invasivas de la vejiga urinaria de someterse a EMT [19]. Esto está de acuerdo con nuestros datos de biopsias de cáncer de colon humano que muestran un patrón de expresión opuesto de 14-3-3σ y Snail1. Cabe destacar que 14-3-3 ε, ζ y η pueden formar un complejo ternario con Chibby y β-catenina facilitar exportación nuclear de β-catenina, antagonizando así su actividad transcripcional que es un factor importante en el cáncer de colon [42]. Por el contrario, 14-3-3ζ coopera con ErbB2 para promover la EMT y la progresión de los carcinomas de mama ductal invasivo para el cáncer [43], y sus asociados con la sobreexpresión de la recurrencia del cáncer de mama [44]. En este estudio, hemos identificado 14-3-3 β, ε, σ, τ y ζ como downregulated después de la expresión Snail 1 en células de cáncer de colon humano. La acción de las proteínas 14-3-3 puede ser modulada por la interacción con diferentes socios de una manera espacial y temporalmente y también se somete a regulación por fosforilación. Por lo tanto, el mismo miembro de la familia 14-3-3 puede tener múltiples e incluso opuestas papeles haciendo que el análisis del efecto de las proteínas 14-3-3 individuales muy complejas y dependen de la integración de señales adicionales [45]. Por lo tanto, es difícil predecir el papel de estas proteínas en la acción snail1 en el cáncer de colon, que pueden estar relacionados con las mutaciones típicamente presentes en esta neoplasia.
Se encontró que el Snail 1 también reprime la expresión pa2g4 en el cáncer de colon humano Células. Esta proteína interactúa con el dominio citoplasmático del receptor ErbB3 la regulación negativa de la transducción de señales ErbB y atenuar el crecimiento impulsado por heregulina de células de cáncer de mama [46], [47]. Pa2g4 se encuentra no sólo en el citosol, sino también en el núcleo donde se comporta como una proteína pleiotrópica que interactúa con un número de proteínas y ARN implicados en la regulación de la transcripción y de control de la traducción [48], [49]. Por lo tanto, inhibe pa2g4 E2F1- y la transcripción mediada por el receptor de andrógenos a través de su interacción con la proteína de retinoblastoma, receptor de andrógenos, varias histonas desacetilasas y Sin3A [50] - [53]. La localización de pa2g4 en los órganos Cajal que ahora hemos reportado sugiere que esta proteína multifuncional también está implicado en la maduración de snRNA y ARNsno. Por otra parte, pa2g4 sobreexpresión induce la diferenciación de las células de cáncer de mama humano [54], inhibe la proliferación de los fibroblastos humanos, y suprime el crecimiento y la metástasis de las células salivales carcinoma adenoide quístico [55]. De todos estos estudios es concebible que la represión pa2g4 puede contribuir a la acción tumorigénico de Snail1.
Curiosamente, Snail1 upregulates la expresión de proteínas CPSF6 y SFPQ implicados en la poliadenilación de ARN y de empalme, respectivamente [56], [57 ]. Ambas proteínas se han encontrado recientemente que estar presente en paraspeckles, un compartimento subnuclear propuso para ser sitio para el procesamiento de pre-ARNm y la retención [23]. Es de destacar que tanto CPSF6 y SFPQ son socios de la fusión de las tirosina quinasas en neoplasias hematológicas [58]. Snail1 también altera el patrón de empalme de HNRNPH3, otra proteína implicada en el proceso de empalme [24]. Curiosamente, las isoformas HNRNPH3 inducidos por Snail1 contienen dos copias de un dominio (motivo de reconocimiento de RNA) de unión al ARN que se encuentran comúnmente en las proteínas que se unen RNA de cadena simple, mientras que las isoformas reprimidos por Snail1 contienen sólo un [24]. Sin embargo, la consecuencia funcional de esta diferencia es desconocida. Por lo tanto, nuestro estudio indica que Snail 1 puede modular varias etapas en la maduración del ARN, como la poliadenilación y empalme, y la estabilidad de modo ARNm y la traducción. En conjunto, estos datos sugieren que además de su actividad de represión de la transcripción reconocidas, Snail1 puede regular la expresión génica post-transcripcionalmente mediante la modulación del nivel de proteínas implicadas en el procesamiento de pre-mRNA y la ubicación.
En conclusión, nuestros hallazgos implican snail1 como un regulador de las funciones celulares previamente imprevistos, además de la adhesión intercelular y la morfología celular. El estudio en profundidad de los mecanismos de acción de las proteínas diana SNAIL1 recientemente identificados contribuirá a definir la actividad biológica compleja precisa de Snail 1 y así los puntos de vista del proceso de la EMT durante la embriogénesis y la tumorigénesis.
Materiales y métodos
declaración de Ética
Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con los principios expresados en la declaración de Helsinki. El estudio fue aprobado por el Comité Ético del Instituto de Salud Carlos III (Madrid, España) y el Comité Ético de Investigación Clínica del Instituto Municipal de Asistencia Sanitaria (Barcelona, España). Todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito para la recogida de muestras y su posterior análisis.
Cultivo de células
células de cáncer de colon humano
SW480-ADH y HT29 que expresan de forma estable Snail 1 (células SNAIL1) o un vector vacío ( simulacros de células) fueron generados por transducción retroviral usando vectores pRV-Snail 1-IRES-GFP (células sNAIL1) o pRV-IRES-GFP (células Mock) como hemos informado anteriormente [10].