Extracto
resistencia de las células del cáncer a la anoikis impulsados por la señalización aberrante sostenida por el microambiente tumoral confiere un alto potencial invasivo y resistencia terapéutica. Hemos generado recientemente un nuevo derivado de Doxazosin® a base de quinazolina de plomo, DZ-50, lo que perjudica el crecimiento del tumor y la metástasis a través de anoikis. análisis de todo el genoma de la línea celular de cáncer de próstata humano DU-145 identificados objetivos downregulated primarias de DZ-50, incluidos los genes implicados en la integridad de adhesión focal (fibronectina, integrina α6 y Talin), la formación de uniones estrechas (claudina-11), así como factor de crecimiento de insulina proteína de unión 3 (IGFBP-3) y la trombospondina angiogénesis modulador 1 (TSP-1). La microscopía confocal demostró alteración estructural de los dos adhesiones focales y uniones estrechas por la regulación a la baja de estos objetivos de genes, lo que resulta en una disminución de la supervivencia celular, la migración y la adhesión a la matriz extracelular (ECM) componentes en dos líneas celulares de cáncer de próstata humano independiente de andrógenos, PC-3 y DU-145. La estabilización de las interacciones célula-ECM por la sobreexpresión de Talin-1 y /o células a un entorno rico en fibronectina exponer mitigado el efecto de la DZ-50. La pérdida de expresión de los efectores de señalización de adhesión focal intracelular talina-1 y la integrina vinculado quinasa (CIC) sensibilizado cáncer de próstata humano a la anoikis. Nuestros hallazgos sugieren que la DZ-50 ejerce su efecto antitumoral por la orientación de las interacciones intercelulares funcionales clave, adhesiones focales y las uniones estrechas, apoyando la importancia terapéutica de este fármaco para el tratamiento del cáncer de próstata avanzado
Visto:. Hensley PJ , Desiniotis a, C Wang, Stromberg a, Chen CS, Kyprianou N (2014) Novela farmacológica focalización de uniones estrechas y adhesiones focales en células de cáncer de próstata. PLoS ONE 9 (1): e86238. doi: 10.1371 /journal.pone.0086238
Editor: Lucía R. Languino, Thomas Jefferson University, Estados Unidos de América
Recibido: 4 de noviembre de 2013; Aceptado: December 12, 2013; Publicado: 31 Enero 2014
Derechos de Autor © 2014 Hensley et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una beca de los Institutos nacionales de Salud, R01-GRANT00491815 y por el Centro Nacional de Recursos para la investigación y el Centro Nacional para el Avance de Ciencias de transferencia, UL1RR033173. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Tenga en cuenta que los autores han declarado lo siguiente COI: A medida que el autor correspondiente, Natasha Kyprianou afirma que sirve como un editor académico de PLOS ONE Consejo Editorial, pero confirma que esto no altera su adhesión a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales, como se detalla en la guía para los autores. Por otra parte, existe una patente relacionada con material pertinente en este artículo, es decir, la generación del nuevo fármaco, DZ-50, por los autores Dr. Chen y el Dr. Kyprianou. Declaran esta patente, llamado: "Los nuevos agentes antitumorales y métodos de su uso en la focalización del cáncer de próstata", Universidad de Kentucky /Universidad Estatal de Ohio conjunta invención, la patente de EE.UU. S. N. 12 /323.073. (Ching-Shih Chen y Natasha Kyprianou, coinventores.) Los autores confirman que la propiedad /invención de esta patente no altera su adhesión a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales, como se detalla en la guía para autores.
Introducción
el cáncer de próstata es el segundo cáncer más común entre los hombres, con 206,640 hombres diagnosticados y 28.088 mueren de cáncer de próstata en 2012 [1]. La orientación del eje de quimioterapia en el cáncer de próstata andrógeno señalización ha contribuido a la mejor tasa de supervivencia del cáncer en los hombres. Sin embargo, un subconjunto de pacientes se vuelven refractarios a la terapia de ablación de andrógenos al no apoptosis y progresando a cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC) [2]. células epiteliales glandulares prostáticas tienen una necesidad intrínseca de las señales de supervivencia impartidas por interacciones intercelulares (ECM) y de células extracelular de matriz. adhesiones focales son vitales tanto para la señalización dependiente de contacto normales por las células normales y la invasión, la migración y la metástasis de las células malignas.
El trabajo de este laboratorio identificó nueva acción antitumoral ejercida por los medicamentos utilizados clásicamente para el tratamiento de benigna hiperplasia prostática (quinazolina-α antagonistas
1-adrenoceptores) a través de la inducción de la cascada de apoptosis extrínseca (activación del receptor de muerte, caspasa-8 de escisión y la inhibición de AKT señalización de supervivencia) [3], [4], [5]. Optimización estructural condujo a la generación de nuevos compuestos capaces de la inducción anoikis y la inhibición de la angiogénesis [6], [7]. Anoikis, la muerte celular por apoptosis consecutiva a la insuficiencia de las interacciones célula-ECM, es un componente crítico de la angiogénesis y la metástasis [8]. Las células tumorales agresivas subvierten este mecanismo, el mantenimiento de la supervivencia mediante la difusión y la siembra en órganos distantes [9]. anoikis resistencia está estrechamente vinculado con el aumento potencial metastásico en muchos tumores malignos humanos, incluyendo el cáncer de próstata [10], carcinoma de células renales [11], el cáncer de mama [12], así como los tumores de origen mesenquimal [13].
Metástasis requiere la interrupción de las interacciones celulares con el microambiente tumoral, el aumento de capacidad migratoria y la invasión y la capacidad de superar las señales pro-apoptóticas impartidas por disminución intercelulares y célula-ECM interacciones [14]. El ECM comprende una red diversa de citoquinas que afectan el crecimiento celular, la motilidad y la angiogénesis que pueden estar disponibles para el uso celular por digestión enzimática y remodelación [15]. integrinas transmembrana se caracterizan por la señalización bidireccional. La oligomerización de proteínas de integrina sobre un sustrato ECM induce cambios conformacionales que se transmiten a través de la membrana plasmática para modular la afinidad de efectores de señalización intracelular en las colas de la integrina citosólicas [16]. Los agregados de proteínas, conocidas colectivamente como el complejo de adhesión focal (FAC), incluyen proteínas de unión a actina (Talin-1, vinculina, vimentina, paxillin, filamin, ect.) Que estabilizan el citoesqueleto y quinasas (quinasa de adhesión focal [FAK], la integrina quinasa -vinculada [CIC], y SRC no receptor de tirosina quinasa) que se propagan de señalización intracelular al núcleo. Esta mediada por la integrina "afuera hacia adentro" señalización de control en cascada los procesos vitales para la función celular y el crecimiento como la progresión del ciclo celular y la diferenciación [17].
A medida que la red del citoesqueleto de actina se remodela /organización dinámica, los induce integrina agrupación "dentro a fuera" de señalización para aumentar la afinidad de las integrinas a la ECM, que se establece de manera efectiva una adhesión focal [18]. Tras la insuficiencia de las interacciones integrina-ECM, las células downregulate miembros de la anti-apoptótica de Bcl-2 familia y upregulate ligando Fas (FasL), la inducción de anoikis través de la vía extrínseca apoptosis [19], [20]. Talin-1 contribuye funcionalmente a la anoikis-resistencia y la metástasis del cáncer de próstata mediante la mejora de la formación de adhesión focal y la señalización Akt-supervivencia. Recientemente hemos demostrado una correlación significativa entre Talin-1 sobreexpresión y la metástasis en un modelo de ratón de la tumorigénesis de próstata y en la progresión del cáncer de próstata humano [10].
explotación farmacológica de los doxazosin® antagonista α1-adrenoreceptor ha llevado a la generación de nuevos compuestos a base de quinazolina, con el agente de plomo, DZ-50, que tiene efectos anoikis inductores potentes contra las células del cáncer [6]. DZ-50 suprime el crecimiento de xenoinjertos de cáncer de próstata humano e inhibe su potencial metastásico
in vivo fotos: por alterar la angiogénesis, la migración y la invasión [7] a través de la orientación del eje focal [11] señalización adherencia. El presente estudio investigó las dianas celulares de DZ-50 en células de cáncer de próstata humano independiente de andrógenos. análisis de todo el genoma identificó efectores críticos de adhesión focal y las interacciones de unión estrecha, que son el objetivo de la novela agente de quinazolina.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y reactivos
El andrógeno líneas celulares de cáncer de próstata humano PC-3 -independiente y DU-145 se obtuvieron de la American Type Tissue Culture Collection y se cultivaron en RPMI 1640 (Invitrogen) que contenía suero bovino fetal al 10% (Invitrogen) y antibióticos (PenicilinG /estreptomicina, 50 mg /ml). células DU-145 fueron transfectadas con pEGFP o Talin-1 plásmidos y se clonaron en virtud de selección G418 (Life Technologies Bethesda Research Laboratories). Para silenciar talina-1 de expresión, se utilizó el vector shRNA talina-1 (GIPZ shRNAmir talina-1) a partir de Abrir Biosystems (Hunsville, AL) y shRNA talin1 DU-145 células de cáncer de próstata fueron seleccionados en virtud de puromicina. poblaciones policlonales se combinaron bajo selección, y las líneas celulares estables se caracterizaron por inmunotransferencia. PC-3 células fueron transfectadas de forma estable con el vector que contiene pTRIPZ TRE-CIC shRNA (Thermo Scientific). Se indujeron PC-3 células shILK con 2 mg /ml de doxiciclina (Enzo Life Sciences) durante dos días. DZ-50, un derivado de doxazosina primera generación (Shaw et al, 2004;.. Garrison et al, 2007), se utilizó a una concentración de 5 mM disueltos en DMSO para todos los tratamientos. DMSO estéril se utiliza para muestras de control /no tratados.
Ensayo de viabilidad celular
La viabilidad celular se evaluó después del tratamiento con 5 mM DZ-50 utilizando el MTT colorimétrico (3- [4,5-dimetiltiazol - 2-il] -2,5 difeniltetrazolio) de ensayo (1 mg /ml de MTT en PBS), y se cuantificó usando una medida espectrofotométrica. El análisis estadístico de 3 experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado, se expresa en relación al control sin tratar.
Migración Celular Ensayo
Hiriente fue infligido usando una punta de pipeta estéril en monocapas de células confluentes en 6- y placas. Después de la incubación durante 12-48 horas en la presencia de DZ-50 (5 M), áreas heridas se examinaron por microscopía de luz (Axiovert 10, Zeiss). Las células que migran a las áreas heridas se contaron bajo un microscopio. potencial de migración se determinó como el número medio de células en tres de alta potencia al azar (400 ×) Campos /pocillo. Los datos numéricos se obtienen a partir de tres experimentos independientes realizados por triplicado y se expresaron en relación con los controles no tratados.
ensayo de adhesión celular
Los cultivos de sublíneas de PC-3 y DU-145 se trataron (24 horas) con DZ-50 (5 M) y se recogieron. Las células (1 × 10
5 /pocillo) se añadieron a placas de 6 pocillos revestidas con fibronectina (5 g /ml, BD Biosciences) y después de una incubación de 30 min a 37 ° C, las células se fijaron con 100% ( v /v) de metanol frío y se sometieron a análisis de imagen. El número de células adheridas se contó en tres campos representativos /pocillo (400 ×). Los datos numéricos representan la media de tres experimentos independientes realizados por triplicado y se expresan en relación a los controles no tratados.
análisis de transferencia Western
células de cáncer de próstata humano, DU-145 y PC-3, se trataron con DZ-50 (5 M) durante períodos de tiempo y los lisados celulares secuencial se generaron en tampón de lisis (150 mmol /L de NaCl, 50 mmol /L Tris (pH 8,0), ácido desoxicólico al 0,5%, 1% de NP40 con 1 mmol /L fenilo fluoruro de metilo-sulfonilo, pH 7,4). Las muestras de proteína se sometieron a SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de Hybond-C (Amersham Pharmacia Biotechnology). Las membranas se incubaron durante la noche a 4 ° C con los anticuerpos primarios específicos: Akt (Cell Signaling Technology), Akt fosforilada Ser 473 (Cell Signaling Technology), GSK-3β (Cell Signaling Technology), fosforilados GSK Ser 9 (Cell Signaling Technology), ILK-1 (Cell Signaling Technology), ZO-1 (Invitrogen), claudin-11 (Santa Cruz Biotechnology), Talin-1 (Millipore) o actina (Calbiochem). Después de la incubación con el respectivo anticuerpo primario, las membranas se expusieron a rábano picante anticuerpos secundarios marcados con peroxidasa y se detectó señal con SuperSignal West Dura sustrato extendido Duración (Pierce) y se expusieron en una película de rayos X. El análisis densitométrico se realizó utilizando el software ImageJ y los valores se expresan en relación con los controles.
Gene (qRT-PCR) Análisis
RNA fue aislado de lisados de células utilizando el reactivo TRIzol (Ambion) y ARN Enlace Pure Kit Mini (Invitrogen) de acuerdo con el fabricante. Después de la homogeneización y la separación de fases por centrifugación (12000 g, 4 ° C), el ARN se precipitó con isopropanol. Las muestras se centrifugaron (12.000 g, 4 ° C) y se sintetizó ADNc utilizando ARN (1 g) y el Sistema de Transcripción Inversa (Promega). matriz de análisis de ADN se llevó a cabo en el Centro de Microarray Core Universidad de Kentucky utilizando Affymetrix GeneChip tecnología. Las transcripciones fueron evaluados por ABI 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems Inc.); cada tratamiento (5 M DZ-50, 9 horas) se realizó por triplicado.
Para el análisis RT-PCR, el ARN (1 g) se sometió a transcripción inversa utilizando el sistema de transcripción inversa (Promega). Los siguientes cebadores se diseñaron (Sigma) para el sistema Verde cuantitativa en tiempo real PCR (QRT-PCR) SYBR: La fibronectina-1 (F: 5'-TCATGAGGCAACGTGTTATGATG-3 ', R: 5'-CGAGATATTCCTTCTGCCACTGT-3'), TALIN- 1, (F: 5'-GCAGAAGGGAGAGCGTAAGATC-3 ', R: 5'-TGAGAGAACGGGCTAGCTTCA-3'), integrina α6 (F: 5'-CAGAAAGTGTGCATGGAGGAAA-3 ', R: 5'-TGGGAATGGGACGCAGTT-3'), y ZO-1 (F: 5'-GGAGCTGCGCTTACCACACT-3 ', R: 5'-TTTGCTCCAACGAGATAATTTGG-3'). Se obtuvieron los siguientes cebadores para el sistema TaqMan qRT-PCR (Invitrogen): 18 s ribosomal RNA (rRNA), trombospondina-1, IGF-BP3, claudin-11, Snail. cDNA se utilizó para el análisis de QRT-PCR de acuerdo con respectiva SYBR Green y protocolos TaqMan (Bio-Rad). Para los experimentos de QRT-PCR, cada muestra se analizó por triplicado y los datos representan valores medios de tres experimentos independientes. Los datos numéricos para los niveles de transcripción se normalizaron a 18 s rRNA en los controles y expresaron en relación con los controles no tratados.
Análisis de inmunofluorescencia
células cultivadas en placas en portaobjetos de cámara de 4 pocillos revestidas con fibronectina (5 mg /ml , BD Biosciences) fueron expuestos a DZ-50 de tratamiento (5 M) durante 12 horas. Las células fueron fijadas en 100% (v /v) de metanol, y después de bloquear a 4 ° C (5% NGS, 0,3% de Triton X), se expusieron al anticuerpo primario (4 ° C, durante la noche). Se utilizaron los siguientes anticuerpos específicos: ILK-1 (Cell Signaling Technology), ZO-1 (Invitrogen), claudin-11 (Santa Cruz Biotechnology), Snail (Cell Signaling Technology), Talin (Millipore). Las células fueron incubadas con el anticuerpo secundario conjugado a un fluorocromo (Invitrogen) (2 horas, temperatura ambiente) y se sometieron a microscopía confocal usando un v1.21 Olympus FV1000 Microscopio Confocal. y la versión de software 3.1 FV10-ASW.
Análisis de microarrays
shTalin o vector DU-145 células de cáncer de próstata humano fueron tratados con DZ-50. Las muestras de ARN de las células antes o después (9 horas) el tratamiento se presentaron a la facilidad de la base Universidad de Kentucky de microarrays para el análisis de Affymetrix Human Gene 1,0 ST arrays (Affymetrix, Santa Clara, CA). El experimento en cada condición se realizó por duplicado.
Análisis estadístico
Microarray datos se normalizaron mediante el uso de RMA y analizados mediante el uso de dos vías de análisis de varianza (ANOVA) modelos, con el genotipo (shTalin o vector) y tratamiento (antes o después) como los dos factores. Contrastes fueron generados para evaluar los cambios en la expresión de ARNm entre los tratados frente a no tratados en las células del vector. tasa de falso descubrimiento (FDR) y los valores de q asociadas se calcularon utilizando el método en el REF. 1,5; genes expresados diferencialmente se determinaron sobre la base de FDR & lt; 20% y un doble cambio & gt. Los análisis estadísticos de los datos de todos los demás experimentos se llevaron a cabo sobre la base de un ejemplo o dos pruebas t de muestras según el caso. En P & lt; 0,05 se consideraron los valores estadísticamente significativa
Resultados
Novel quinazolina DZ-50 induce la próstata Cáncer de células Anoikis
El efecto inductor de la anoikis del compuesto quanazoline plomo DZ. -50 se investigó en líneas celulares de cáncer de próstata humano de forma variable que expresa las proteínas del CAA, Talin-1 y ILK. La transfección estable de las células DU-145 dio lugar a la precipitación de Talin (DU-145 shTalin) y la sobreexpresión de Talin (DU-145 Talin +) (Figura 1, panel A). las células PC-3 que expresan un vector inducible shILK demostraron regulación a la baja efectiva del CIC tras la inducción con doxiciclina durante 48 horas (Figura 1, panel A). Hubo una disminución dependiente del tiempo en la viabilidad celular en respuesta a DZ-50 (Fig.1, panel B). La pérdida de expresión de ILK y talina en DU-145 células de cáncer de próstata PC-3 y dio como resultado, respectivamente, en una mayor sensibilidad a DZ-50, mientras que la sobreexpresión talina anoikis suprimida. Los datos en el panel C (Fig. 1) muestran que en respuesta a DZ-50, la migración ell cáncer de próstata ha aumentado significativamente. La pérdida de cualquiera de ILK (células PC-3), o Talin (DU-145 células), la migración celular inhibida, mientras que mejora aún más el efecto de la DZ-50. La pérdida de cualquiera de ILK o talina llevó independientemente a una reducción significativa en la adhesión celular a la fibronectina (Fig.1, el panel D).
Panel A, derecha, Western blot revela que las células PC-3 shILK transfectantes presentan pérdida total de CIC-1 de expresión de proteínas en relación con las células de control de vector tras la inducción con doxiciclina (48 horas). A la izquierda, DU-145 células en las que ha sido talina silencio (shTalin) o sobreexpresa (Talin +), muestran una reducción significativa o marcada sobreexpresión de los niveles de proteína talina, respectivamente, en relación con células parentales DU-145. Panel B, DZ-50 tratamiento conduce a una disminución significativa de la viabilidad celular de cáncer de próstata de una manera dependiente del tiempo. La pérdida de ILK1 mejora la pérdida inducida DZ-50 de la viabilidad celular; en contraste sobreexpresión talina confiere resistencia a DZ-50 la muerte celular inducida. Panel C, DZ-50 reduce significativamente la migración de células de cáncer de próstata. La pérdida de Talin en una reducción significativa de la migración de células de cáncer de próstata en comparación con los de control parental células DU-145. En respuesta a DZ-50, la sobreexpresión talina restaura célula capacidad migratoria a los niveles de las células no tratadas. Panel D, la pérdida funcional de la ILK en células PC-3 de cáncer de próstata y Talin pérdida en células DU-145 deteriora significativamente la capacidad de las respectivas células de cáncer de próstata a adherirse a la fibronectina (ECM). Talin sobreexpresión mejora notablemente la adhesión de células de cáncer de próstata a la fibronectina, en comparación con las células DU-145 shTalin parental DU-145 y. La significación estadística se fijó en p *. & lt; 0,05
La identificación de dianas moleculares de plomo quinazolina
Genoma en todo el análisis de la expresión génica en la línea celular de cáncer de próstata humano DU-145 se se utiliza para identificar objetivos principales de DZ-50 (Fig. 2). El mapa de calor a partir del análisis conjunto de genes después del tratamiento de células de cáncer de próstata con DZ-50 (de 9 horas) se muestra en la figura 2 (panel A). DZ-50 dio lugar a una regulación a la baja significativa de los genes que codifican proteínas asociadas a la membrana plasmática, incluidos los reguladores de ECM (
fibronectina
y
integrina α
6
), y las uniones estrechas (
claudin-11
), factor de crecimiento tipo insulina proteína 3 (unión
IGFBP-3
), así como el mediador de la angiogénesis trombospondina 1 (
TSP-1
). Para validar el panel de objetivos de genes candidatos identificados por el perfil molecular conjunto de genes, que posteriormente se realizó un análisis cuantitativo de PCR en tiempo real (QRT-PCR) (Fig. 2, panel B). La exposición de células DU-145 a DZ-50 (3 y 9 horas) dio lugar a una inhibición significativa de la expresión para un gen seleccionado firma identificado la matriz de análisis (Figura 2, panel A), incluidos los genes que codifican para los efectores de señalización de adhesión focal clave , de forma intracelular (Talin) y extracelular (fibronectina) y las proteínas de unión estrecha (Claudín-11 y ZO-1). Un mediador transcripcional de la EMT,
caracol, España también se reduce por DZ-50. La estructura química del compuesto a base de quinazolina DZ-50, se muestra en el panel C (Fig. 2).
Panel A, mapa de calor de los genes expresados diferencialmente en 145 DU-células de cáncer de próstata humanos antes y después tratamiento con DZ-50 (9 horas). Se identificaron 17 genes regulados negativamente marcadamente después del tratamiento con DZ-50 (9 horas), incluidos los genes que codifican para los reguladores de ECM
fibronectina
y
integrina α6
, apretado nudo mediador
Claudín-11
y señalización de la angiogénesis efector
trombospondina 1