cáncer
Extracto
próstata es el cáncer más común de los hombres en el mundo occidental, y nuevos enfoques para la próstata se necesitan reducción del riesgo de cáncer. compuestos fenólicos derivados de plantas atenúan el crecimiento del cáncer de próstata en modelos preclínicos por varios mecanismos, que está en línea con los hallazgos epidemiológicos que sugieren que el consumo de dietas basadas en vegetales se asocia con un bajo riesgo de cáncer de próstata. El objetivo de este estudio fue evaluar los efectos de una nueva mezcla de lignanos-stilbenoid en células de cáncer de próstata humano PC-3M-luc2
in vitro Opiniones y en xenoinjertos ortotópico. De lignanos y el extracto rico en stilbenoid se obtuvo de pino silvestre (
Pinus sylvestris)
nudos. extracto de pino nudo, así como estilbenoides (pinosilvina metilo y pinosilvina), y lignanos (matairesinol y nortrachelogenin) presentes en el extracto de pino nudo mostraron una eficacia antiproliferativa y proapoptótico en ≥40 concentración de M
in vitro
. Además, pino estilbenoides derivadas de extracto de nudo mejorado de necrosis tumoral apoptosis ligando inductor de apoptosis (TRAIL) inducida relacionada con el factor ya en ≥10 M concentraciones. En ortotópico xenoinjerto PC-3M-luc2 teniendo ratones inmunocomprometidos, de tres semanas de exposición peroral con el extracto de pino nudo (52 mg de lignanos y estilbenoides por kg de peso corporal) fue bien tolerado y demostró una eficacia anti-tumorigénico, demostrado por el análisis multivariante combinando esencial marcadores de crecimiento del tumor (es decir, el volumen del tumor, la vascularización, y la proliferación celular). pinosilvina metilo, pinosilvina, matairesinol, nortrachelogenin, así como resveratrol, un metabolito de la pinosilvina, se detectaron en el suero a una concentración total de 7 a 73 mM, lo que confirma la biodisponibilidad de lignanos derivados de extracto de pino nudo y estilbenoides. En resumen, nuestros datos indican que el extracto de pino nudo es un nuevo y rentable fuente de resveratrol, pinosilvina metilo y otros lignanos bioactivos y estilbenoides. extracto de pino nudo muestra eficacia anticancerígena en el modelo preclínico cáncer de próstata, y nuestra
in vitro
datos sugieren que los compuestos derivados del extracto pueden tener potencial como nuevos quimiosensibilizadores a TRAIL. Estos hallazgos promover nuevas investigaciones sobre las aplicaciones relacionadas con la salud de productos bioquímicos de madera
Visto:. Yatkın E, L Polari, Laajala TD, Smeds A, C Eckerman, Holmbom B, et al. (2014) Novela lignanos y stilbenoid Mezcla Muestra anticancerígeno eficacia preclínica en PC-3M-luc2 próstata Modelo de cáncer. PLoS ONE 9 (4): e93764. doi: 10.1371 /journal.pone.0093764
Editor: Rajesh Agarwal, de la Universidad de Colorado en Denver, Estados Unidos de América
Recibido: 13 Enero, 2014; Aceptado: March 8, 2014; Publicado: 3 Abril 2014
Derechos de Autor © 2014 Yatkın et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este proyecto fue apoyada por la Bioeconomía Cluster FIBIC finlandés, el programa de BioRefine agencia finlandesa de financiación de tecnología e innovación, y la Academia de Finlandia. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (CaP) es el cáncer más común en los hombres de América del Norte, Europa occidental, Europa del Este y Escandinavia. La larga historia natural de CaP presenta una ventana de tiempo relativamente amplio para las intervenciones dietéticas o farmacológicas que podría manifestarse como una reducción en la incidencia, la recurrencia, la morbilidad o la progresión de la enfermedad [1]. Propuestas de los factores de riesgo modificables para el CaP que proporcionan objetivos potenciales para la prevención incluyen inflamación, hormonas esteroideas y sus receptores, la obesidad, la hipercolesterolemia y factores dietéticos [2]. compuestos fenólicos naturales, que poseen propiedades anticancerígenas, pueden ofrecer posibilidades interesantes para la reducción de la carga del cáncer [3], [4]. Sin embargo, más datos sobre su eficacia y mecanismos de acción es necesaria a partir de modelos preclínicos relevantes, con el fin de seleccionar los compuestos o mezclas óptimas para los ensayos clínicos y el desarrollo de productos.
Los árboles son una fuente abundante de compuestos fenólicos, estructuralmente idénticos o similares a los de las plantas comestibles [5]. Estos compuestos pueden ser fácilmente aislados a partir de madera por extracción hidrófilo después de la eliminación de las sustancias extractivas lipófilos por extracción con hexano [6]. Madera-derivan extractos son, pues, una fuente rentable de compuestos fenólicos naturales, y una opción atractiva para el desarrollo de nuevos productos para la salud.
fenólicos vegetales, como los lignanos y estilbenoides, modulan varios procesos biológicos importantes en células de mamíferos [7], [8], y muestran propiedades anticancerígenas en modelos preclínicos con CaP. Centeno o dietas, que tienen un alto contenido de lignanos, así como una dieta suplementada con un derivado de la madera planta de lignanos, 7-hydroxymataresinol (HMR), inhibir el crecimiento de CaP en
in vivo
[que contiene linaza- ,,,0],9], [10], [11], [12]. Del mismo modo, se han reportado estilbenoides derivados de las plantas, el resveratrol (RV) y pterostilbeno para suprimir el crecimiento de CaP
in vivo
[13]. Existen varios mecanismos posibles, por lo que los lignanos y estilbenoides pueden ejercer sus acciones anticancerígenas en el CaP se han identificado, incluyendo la detención del ciclo celular y la inducción de la apoptosis [14], [15], la inhibición de la proliferación celular [16], [17], la vascularización del tumor [18], la modulación del perfil de citoquinas [19], y la sensibilización de las células cancerosas a la muerte celular programada [20], [21], [22].
factor de necrosis tumoral relacionada ligando inductor de apoptosis (TRAIL ) apoptosis mediada ha sido recientemente identificado como un objetivo interesante para los lignanos y estilbenoides. TRAIL es una proteína que funciona como un ligando, que activa una vía de la muerte de señalización especialmente en células de cáncer, con una toxicidad mínima a los tejidos normales [23]. La resistencia a TRAIL es común en el CP, y los compuestos que sensibilizan a CaP TRAIL están actualmente bajo investigación activa. Curiosamente, los lignanos, tales como matairesinol (MR), y nortrachelogenin (NTG), así como RV mejoran la actividad antitumoral de TRAIL en células de CaP [21], [22] o xenoinjertos [18].
Experimental así, los estudios sugieren que los lignanos naturales y estilbenoides atenúan crecimiento PCa a través de numerosos mecanismos de acción. Es, por lo tanto, plausible propongo combinación de los dos grupos de compuestos fenólicos puede ofrecer beneficios adicionales sobre el uso de compuestos individuales. Sin embargo, no hay datos publicados existe sobre los efectos combinados de los lignanos y estilbenoides en parámetros experimentales controladas. En este estudio, hemos demostrado efectos inhibidores del crecimiento de extracto de pino knotwood (PKE), rica en lignanos y estilbenoides, en PC-3M-luc2 células de CaP humanos
in vitro
y
in vivo
. Por otra parte, se confirmó la biodisponibilidad de los compuestos fenólicos derivados de PKE, y se identificaron los compuestos que puedan dar cuenta de los efectos anticancerígenos de PKE.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Animal cuidado y uso se llevó a cabo de acuerdo con la Ley finlandesa de Experimentación Animal de la UE y las leyes, directrices y recomendaciones. Todos los estudios fueron aprobados por el Consejo Nacional Experimental de Animales en Finlandia (número de licencia 1993 /04.10.03 /2011).
Preparación y caracterización química de PKE
nudos de pino silvestre se obtuvieron de una economía industrial proceso de celulosa (la llamada trampa de piedra) (UPM Tervasaari, Valkeakoski, Finlandia). Los nudos se molieron, se tamizan (& lt; 2 mm), se liofilizó, y se extrajeron secuencialmente con
n
hexano a 90 ° C (3 × 5 min) y etanol-agua (95:5 por vol .) a 100 ° C (3 × 5 min) utilizando extracción con solvente acelerado. El PKE se caracterizó químicamente mediante la detección de ionización GC-llama (FID), GC-MS y mediante cromatografía de exclusión por tamaño de alto rendimiento con detección de dispersión de luz evaporativo (HPSEC-ELSD). La GC-FID, GC-MS, y HPSEC-ELSD se realizaron análisis como se describe anteriormente [24]. GC-FID se utilizó para la cuantificación de los componentes en el extracto que eluyeron de la columna de GC. La cuantificación se basó en el análisis de triplicado del mismo extracto. ácido heneicosanoico fue utilizado como patrón interno, con factores de la respuesta 1.00. Los compuestos individuales detectados por GC-FID fueron identificados por GC-MS, utilizando comercial y propias bibliotecas espectrales del laboratorio. La distribución de la masa molar de los componentes PKE se determinó por HPSEC-ELSD
Los principales grupos de compuestos de la PKE eran:. Lignanos (16%), estilbenoides (17%), ácidos de resina oxidado (20%), ácidos de resina (24%), y compuestos de mayor masa molar (550 a 4000 Da, 18%). Las concentraciones (% en peso de extracto seco) de los principales compuestos fenólicos GC-detectable en el PKE se pinosilvina monometil éter (MEPS, 10,2%), NTG (7,0%), pinosilvina (PS, 4,0%), MR (1,5%) , ácido abiético (1,5%), y pinostilbene (0,4%). Los ácidos de resina GC-detectable representaron el 21,8% del peso seco de la PKE. Se encontraron de lignanos HMR, ácido conidendric, secoisolariciresinol y todolactol Un
Referencia y compuestos de prueba
La preparación y purezas del HMR lignanos, MR; cantidades menores (0,1-0,5% & lt). , NTG, secoisolarici-, larici-, cyclolarici-, 7-oxomatai-, Pino-, y medioresinol, α-conidendrin, enterolactona, 7-hydroxyenterolactone, MR
d
6, y enterolactone-
d
6 se han descrito anteriormente [25], [26]. El PS y MEPS estilbenos y el ácido deshidroabiético ácido de resina (purezas & gt; 95%) se prepararon en el laboratorio de la Madera y la química del papel de la Universidad Abo Akademi por el aislamiento de la madera y la purificación por cromatografía flash (Biotage 40i) con columnas de sílice. RV y enterodiol fueron de Sigma-Aldrich Co, pinostilbene de TCl Pharma Chem., Inc (Vaughan, ON, Canadá) y
O
ácido -methylpodocarpic, ácido neoabiético y ácido abiético de Helix Biotech Corp. (CanSyn Chem Corp., Toronto, Canadá).
con el fin de estudiar los efectos combinados de (LS mezcla pura lignanos derivados PKE-y estilbenoides
in vitro
, preparamos una mezcla de lignanos-estilbeno) que contiene los cuatro más abundantes compuestos derivados de PKE en relaciones molares similares a PKE (Tabla 1).
Cultura y la proliferación celular, la apoptosis y el ciclo celular Ensayos
células PC-3M-luc2 (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) se cultivaron en fenol medio de Eagle modificado libre de rojo de Dulbecco suplementado con 50 IU /ml de penicilina, 50 mg /ml de estreptomicina, 2 mM L-glutamina, y suero bovino fetal inactivado por calor al 10% ( Invitrogen, Paisley, Reino Unido). Las células se mantuvieron en un humidificado 5% CO
2 /atmósfera de aire a 37 ° C.
Para el ensayo de proliferación de células, las células PC-3M-luc2 fueron sembradas en una placa de 96 pocillos (1500 células por pocillo). Dimetil sulfóxido soluciones stock de PKE (1-100 mg /l), compuestos purificados (1 a 100 mM) o controles de sulfóxido de dimetilo preparada en medio de cultivo se añadieron a los pocillos (seis repeticiones). Después de 48 horas, la proliferación celular se midió con la proliferación celular kit ELISA de BrdU de inmunoensayo (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Para el ensayo de apoptosis, las células PC-3M-luc2 fueron sembradas en un 96 -bien placa. Cuando se eliminó 60-80% confluentes medio del medio y se reemplaza con el medio que contiene los compuestos derivados de la madera (concentraciones finales 1-40 mg /l). Después de 48 horas, las células se separaron con tripsina y se rompieron con tampón de citrato 0,4 M en PBS que contenía 0,3% de Triton-X (Sigma Life Sciences, St. Louis, MO). Los núcleos y los fragmentos nucleares se marcaron con yoduro de propidio (Sigma). Para determinar la fracción de eventos sub-G0 /G1, las muestras se analizaron con citómetro de flujo (BD LSR II, BD Biosciences, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE.UU.). Para la evaluación de la sensibilidad TRAIL, las células fueron tratadas con la combinación de compuestos derivados de la madera (como arriba) y TRAIL humano /Apo2L (cat. No. C-63600, Promokine, Heidelberg, Alemania) a concentraciones de 3, 25, 50, y 100 . ng /ml
xenoinjertos PC-3M-luc2 ortotópico en ratones atímicos
HSD: atímicos Nude - Foxn1
nu ratones machos (5-6 semanas de edad) comprados a Harlan Laboratories (Horst, Países Bajos) fueron alojados en condiciones asépticas en el Laboratorio central Animal de la Universidad de Turku. Los ratones se aclimataron durante dos semanas; siempre con la dieta ingrediente natural libre de la soja (RM3, SDS, Essex, Reino Unido) y agua del grifo
ad libitum
.
células PC-3M-luc2 utilizados en el experimento de xenoinjertos ortotópico se cultivaron en RPMI 1640 fenol medio libre de rojo suplementado con 50 UI de penicilina /ml, 50 mg /ml de estreptomicina, 2 mM L-glutamina, y suero bovino al 10% inactivado por calor fetal. Las células se mantuvieron en un humidificado 5% de CO
2 /atmósfera de aire a 37 ° C. células PC-3M-luc2 (1 × 10
6 células en 20 l llano medio RPMI 1640) se inocularon en la próstata dorsolateral través de una incisión abdominal bajo anestesia con isoflurano. Para aliviar el dolor, los ratones recibieron buprenorfina (Temgesic, 0,05-0,1 mg /kg
sc
.) Y carpofen (Rimadyl, 5 mg /kg
sc
.) Antes y después de la operación, respectivamente. El crecimiento tumoral fue seguido de imágenes de bioluminiscencia con IVIS lumina II, equipado con XGI-8 Sistema de Gas anestesia (Caliper Life Sciences, Runcorn, UK). Los ratones fueron anestesiados con isoflurano, inyectados
ip
con 150 mg /kg de D-luciferina (Xenogen cat. No. XR-1001, Oregon, EE.UU.) 10 min antes de la imagen, y la bioluminiscencia se cuantificó usando 4.09A LivingImage software de carbono (Xenogen).
Una semana después de la inoculación, los animales libres de tumor fueron identificados por imágenes de bioluminiscencia y excluidos del estudio. ratones portadores de tumores se asignaron en el vehículo (control), dosis baja (32 mg /kg) o una dosis alta (160 mg /kg) grupos PKE. dosis baja y alta contenía aproximadamente 5,0 y 5,4, y 25 y 27 mg de lignanos y estilbenoides, respectivamente. PKE se disolvió en un vehículo que contiene 10% (v /v) de etanol absoluto y 90% (v /v) de aceite de maíz. Tanto el vehículo y PKE se gavaged
p.o..
Diaria. Los ratones se pesaron semanalmente, y imágenes de bioluminiscencia se llevó a cabo dos veces a la semana.
Durante la tercera semana de tratamiento de muestras de orina de 24 h se recogieron en jaulas metabólicas (5-6 ratones por jaula). Se recogió la orina en frascos que contienen azida de sodio 0,15 M y ácido ascórbico 0,56 M como conservantes. Las muestras de orina se centrifugaron y se almacenaron en -20 ° C hasta su análisis.
Después del tratamiento de tres semanas, los ratones se sacrificaron con CO
2 asfixia seguido por dislocación cervical. La sangre se recogió mediante punción cardíaca, se centrifugó, y el suero se separó y se mantuvo en -70 ° C hasta su análisis. Los tumores se diseccionaron y se pesaron, y el tamaño del tumor se midió con un calibre en tres dimensiones. El volumen del tumor se calculó usando la fórmula: volumen (mm
3) = (longitud x anchura x altura) x π /6. Los tumores fueron fijadas en 10% formalina tamponada neutra y se procesaron para la inclusión en parafina y se usan para análisis inmunohistoquímico.
Análisis de lignanos y estilbenoides ratón suero y orina
Serum (50 l) y la orina ( 300 l) muestras se hidrolizaron y se extrajeron en fase sólida como se ha descrito previamente con algunas modificaciones [25], [27]. Para la hidrólisis, se añadió una β-glucuronidasa /-sulphatase recién preparada en 10 mM de tampón de acetato de sodio (pH 5,0) a muestras de suero y orina y se incubó durante 19 horas a 37 ° C. Después de la hidrólisis, se agregaron las normas internas de las muestras: MR
d
6 para los lignanos y estilbenos vegetales, EL-
d
6 para enterolignanos (concentraciones finales ~ 1 mg /ml), y
O
ácido -methylpodocarpic para los ácidos de resina (concentración final ~ 3 mg /ml). La fase sólida se extrae y se evapora en suero y orina muestras [25] se redisolvieron en 150 l y 500 l de metanol /0,1% de ácido acético 20:80 (v /v), respectivamente. Los componentes PKE y sus metabolitos se cuantificaron usando HPLC-MS /MS con monitorización de iones múltiples en el modo de ion negativo tal como se describe anteriormente [24]. Las múltiples transiciones de monitoreo de iones optimizadas fueron el ión molecular desprotonado y los siguientes fragmentos en MS
2 (
m /z
); PS 169 18; MEPS 182 20; RV 143, 22; pinostilbene 225. Los ácidos de resina formada no hay fragmentos en la EM
2. Los voltajes de cono usadas fueron 40 V para los estilbenos y 48 V para los ácidos de resina. Las energías de colisión fueron alrededor de 20 eV para los estilbenos y 5,0 eV para los ácidos de resina. Los parámetros ms para el lignanos analizados se han descrito anteriormente [26]. Las cuantificaciones se realizaron utilizando soluciones estándar que contienen los estándares internos y seis niveles de concentración de los analitos como se describe anteriormente [26].
La inmunohistoquímica y la detección de células apoptóticas en muestras de tumores
Para Von Willebrand el factor (vWF, la dilución: 1:4000, ab6994-100, Abcam, Cambridge, Reino Unido) y fosfo-histona H3 (H3-pH, dilución: 1:200, Ser10, señalización celular) inmunohistoquímica, sección de tejido fueron deparaffinized, rehidratada, y se incubaron en Tris-EDTA 10 mM pH 9 (para la tinción de vWF) o en 10 mM de citrato de sodio pH 6 (para pH-H3 tinción) buffer, en un horno de microondas para la recuperación de antígeno. La actividad de la peroxidasa endógena fue bloqueada con el 3% de H
2O
2. Después de enjuagar con PBS, las secciones se incubaron con albúmina de suero bovino 3% (BSA) durante 10 minutos, y se marcaron con vWF o anticuerpos pH-H3 durante 60 minutos a temperatura ambiente (RT) o durante la noche a + 4 ° C, respectivamente. anti-conejo (DAKO sistema Envision, Dako) peroxidasa de rábano picante polímero marcado se utilizó como anticuerpo secundario. Diaminobencidina (Dako), se aplicó a las secciones seguido de hematoxilina y montaje de Mayer.
El desoxinucleotidil transferasa biotina-dUTP nick etiquetado extremo terminal se utilizó el método (TUNEL) para determinar células apoptóticas en secciones de tumores. El análisis se realizó utilizando ApopTag peroxidasa in situ Kit Apoptosis Detección (Chemicon International, Hampshire, Reino Unido) según las instrucciones del fabricante. Las secciones se desparafinaron, se rehidrataron y se trataron con tampón citrato 10 mM de sodio en microondas para la recuperación de antígeno. La actividad de la peroxidasa endógena fue bloqueada con el 3% de H
2O
2. Para el control positivo, una sección se incubó con DNasa I (Invitrogen) durante 30 minutos a + 37 ° C. Para el TUNEL, las secciones se incubaron con 0,8 U /l TdT mezcla de reacción de: tampón TdT, 4 U /transferasa l, CoCl 25 mM
2 (transferasa terminal, Roche, Mannheim, Alemania), biotina-16-dUTP (Roche ) y agua Milli-Q; y para el control negativo, una sección se incubó con TUNEL mezcla de reacción sin transferasa durante una hora a + 37 ° C. reacción TUNEL se paró con NaCl 300 mM, citrato de sodio 30 mM en dH
2O (15 min a RT). Los sitios no específicos se bloquearon con 3% de BSA /PBS durante 30 min a TA. ExtrAvidine®-peroxidasa 1:500 (Sigma) se aplicó en 1% BSA /PBS durante 30 minutos a + 37 ° C, después de lo cual se aplicó diaminobencidina y las secciones se tiñeron con hematoxilina de Mayer y se montó.
Cuantificación de proliferación y apoptosis índices, y la densidad de vasos sanguíneos y Longitud
Las secciones teñidas fueron escaneados con un microscopio virtual (virtual Microscope digital, Soft Imaging System, Olympus, Alemania). El número y la longitud de los vasos vWF-positivos se cuantificó en tres o cuatro áreas seleccionadas mediante el uso de la herramienta de medición del programa de dotSlide (Soft Imaging System). La cuantificación de pH-H3 y de células TUNEL positivas en secciones de tumores se llevó a cabo con funciones personalizadas desarrolladas para el análisis de imágenes de tejidos por QUVA Ltd (Tampere, Finlandia). En primer lugar, las imágenes obtenidas a partir de diapositivas escaneadas se normalizaron para las variaciones de intensidad y de color. Procesamiento se continuó por umbralización imagen, que detecta áreas con color adecuado para ser considerados como las células objetivo marcadas positivamente. Por último, las detecciones extraños fueron filtrados por el tamaño y forma de la información, y las células resultantes se visualizaron en manchas rojas sobre la imagen original.
Análisis estadísticos
Los análisis univariados se realizaron utilizando GraphPad Prism versión 4.00 para Windows (GraphPad Software Inc., San Diego, CA). En los datos distribuidos normalmente, se utiliza el análisis unidireccional de varianza y la prueba post-hoc de Tukey; de lo contrario, se utilizó la prueba de Kruskal-Wallis o t-test no paramétrico. Todos los datos se presentan como media del grupo ± SEM. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a
p
. & Lt; 0,05
comparaciones por pares de variables múltiples medias de los grupos (por ejemplo μ1 y μ2) fueron probados con la distancia de Mahalanobis (MD) :( 1)
distancia de Mahalanobis es una estadística multivariante bien conocido, que incorpora las correlaciones lineales de las covariables a través de la matriz de covarianza-varianza
S
, con dimensión igual al número de covariables [28]. Mediante la acumulación de información complementaria de factores relacionados entre sí y que tienen sensibilidad a los patrones que difieren de las grandes tendencias [29], MD es una estadística adecuado para probar los efectos del tratamiento más sutiles potencialmente perdidos por las pruebas univariantes. En casos especiales, MD reduce a la distancia euclídea estandarizada, si
S
es una matriz diagonal, y con la distancia euclídea ordinaria, si
S
es una matriz unitaria, y por lo tanto, está íntimamente relacionado con
t
prueba estadística convencional de los marcadores de crecimiento tumoral independientes. La significación estadística de la distancia
D
se evaluó por permutación aleatoria de las etiquetas de clase en las pruebas de dos muestras (Vehículo vs dosis baja o alta de vehículo frente a la dosis) [30]. Las distribuciones nulos fueron obtenidos mediante la ejecución de 100.000 simulaciones de tales distancias generadas al azar y los empíricos
p-valores
se define como la proporción de distintas distancias mayores o iguales a la distancia observada
D
.
resultados
PKE y su proliferación de células componentes Inhibición PC-3M-luc2 e inducir la apoptosis
in vitro
PKE significativamente atenuada PC-3M-luc2 la proliferación de células en ≥40 mg /l (Fig. 1A), demostrada por incorporación reducida de BrdU. En línea con esto, los principales constituyentes de PKE, estilbenoides (MEPS y PS), así como los lignanos (MR y NTG) cada una proliferación celular significativamente inhibido en la concentración de 40-100 mm (fig. 1B). Además, la combinación de estos cuatro compuestos (MEPS, PS, MR, y NTG), en la misma proporción que presente en PKE (lignano-estilbeno, LS, mezcla), la reducción de la incorporación de BrdU en una manera similar al extracto original (Fig. 1C). PKE (40 mg /l) y la mezcla de LS (40 M), tanto mayor tasa de apoptosis, demostrado por el análisis de citometría de flujo (Fig. 2A). PKE la detención del ciclo celular inducida, es decir, aumentó la fracción de células no apoptóticas en G0 /G1 (Fig. 2B), y, respectivamente, la disminución de la fracción de células en S y G2 /M fases. la apoptosis inducida por TRAIL-3M luc2 PC-células Por otra parte, PKE (10 y 40 mg /ml) sensibilizados a (Fig. 3A). mezcla LS y todos los probados compuestos derivados-PKE (MEPS, NTG, PS, MR, y RV), excepto el ácido abiético, mejora de forma significativa la apoptosis mediada por TRAIL (Fig. 3B), PS, MEPS, y el Sr. mostrando los efectos más pronunciados .
) las células
a fueron tratados con PKE o una mezcla de sus principales lignanos y estilbenoides (mezcla LS) durante 48 horas. B) Las células se trataron con compuestos individuales PKE derivados durante 48 horas. tasa de proliferación de la célula expresa como porcentaje de control se midió con el ensayo BrdU. Los datos son la media de tres experimentos independientes ± SEM. La significación estadística se determinó mediante la prueba t no paramétrico para cada tratamiento en comparación con el tratamiento con vehículo respectivo (Ctrl). * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt;. 0.001
tasas de apoptosis y número de células en la fase G0 /G1 se expresan en relación con el control de vehículo (Ctrl = 1). Las células se trataron con compuestos de ensayo durante 48 horas y la tasa de apoptosis y el ciclo celular de fase se determinó con citómetro de flujo. LS, mezcla de lignanos y estilbenos principales PKE; MEPS, pinosilvina monometil éter; NTG, nortrachelogenin; PS, pinosilvina; MR, matairesinol; Ab, ácido abiético; RV, el resveratrol. Los datos son la media de tres experimentos independientes ± SEM. La significación estadística se determinó mediante la prueba t no paramétrico para cada tratamiento en comparación con respectiva Ctrl. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt;. 0.001
) Células A tratado con PKE en combinación con concentraciones crecientes de TRAIL humano (0-100 ng /ml), los valores son porcentajes de la fragmentación nuclear. B) Las células tratadas con PKE, mezcla LS, o con compuestos PKE individuales en combinación con TRAIL humano (25 ng /ml), los valores son las tasas de apoptosis relativos (Ctrl = 1). Las células se trataron con compuestos de ensayo durante 48 horas y la fragmentación nuclear se determinó con citómetro de flujo. LS, mezcla de lignanos y estilbenos principales PKE; MEPS, pinosilvina monometil éter; NTG, nortrachelogenin; PS, pinosilvina; MR, matairesinol; Ab, ácido abiético; RV, el resveratrol. Los datos son la media de tres experimentos independientes ± SEM. La significación estadística se determinó mediante la prueba t no paramétrico para cada tratamiento en comparación con el tratamiento con vehículo respectivo (Ctrl). * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001
Efecto de PKE en ortotópico PC-3M-luc2 xenoinjerto de volumen, la proliferación celular y la angiogénesis
. de tres semanas de la ingestión diaria de PKE fue bien tolerado, y no se observaron signos de efectos adversos en cualquier punto de tiempo. PKE redujo significativamente el índice de proliferación (Fig. 4A) y la longitud de los vasos sanguíneos (es decir, el perímetro) en los tumores PC-3M-luc2 (Fig. 4B). Se observó una tendencia a la reducción de la bioluminiscencia y el volumen del tumor CaP en la dosis más alta PKE grupo (160 mg /kg) (Fig. 4C y D). No se observaron cambios significativos en el índice de apoptosis, tal como se cuantifica a partir de secciones de tumor teñidas con TUNEL (datos no mostrados). La comparación multivariante del volumen del tumor extirpado, los índices de bioluminiscencia tumor transformado-log, la apoptosis y la proliferación, y la densidad de los vasos sanguíneos y la longitud se realizó mediante la estadística de MD (Ec. 1). Cuando la respuesta se puso a prueba en términos del efecto combinado de estas 6 covariables (Fig. S1), había una diferencia significativa entre los grupos PKE de vehículos y de dosis alta (p = 0,0051, Fig. 5A), mientras que el vehículo y el PKE grupos de dosis bajas fueron similares (p = 0,4195, Fig. 5B). Curiosamente, la evaluación combinada de las covariables y sus interacciones separa claramente el vehículo y grupos PKE de dosis alta (Fig. 5C, con las 3 características más importantes visualizaron). La inferencia obtenida de este análisis combinado era profundamente diferente de los análisis univariados independientes (Fig. 4); por ejemplo, el enfoque multivariado detectó que algunos tumores se habían reducido vascularización (
Vaso de longitud
), mientras que otros habían reducido tamaño (
tumor volumen
), y por lo tanto dio una visión multidimensional de los efectos del tratamiento . Las mediciones de tumor original se muestran en el material complementario como bivariante (Fig. S1) y parcelas univariados (Fig. S2). La estructura de varianza-covarianza calculada
S, España después de escalar a la matriz de correlación, se muestra en la Fig. S3. Como era de esperar, los factores relacionados, tales como el volumen del tumor y la bioluminiscencia tumor o densidad de los vasos y la eslora del buque, están altamente correlacionados, y sus distancias se agruparon de manera efectiva en el análisis MD (Fig. S3).
A) PKE disminuye el índice de proliferación celular. se muestran imágenes representativas de pH-H3-immunostainings. B) PKE disminuye la longitud de los vasos sanguíneos. se muestran imágenes representativas de vWF immunostainings. C) La bioluminiscencia de los tumores, cuantificado cada dos semanas por
in vivo
imágenes. volúmenes D) del tumor en el sacrificio. Los ratones fueron tratados diariamente con vehículo (n = 11), PKE 32 mg /kg BWT (n = 10) o PKE 160 mg /kg BWT (n = 11) durante tres semanas. Los datos se expresan como media ± SEM. La significación estadística se determinó mediante análisis unidireccional de varianza y la prueba post-hoc de Tukey. * P & lt; 0,05. Las barras de escala, se detectaron 100 micras.
C) El volumen del tumor, la extensión y proliferación de vasos índice como los factores más importantes de las diferencias en el análisis multivariado. El hiperplano indica que dos de los grupos (vehículo en dosis negro y alta en verde) eran separables linealmente cuando los tres factores se consideran en conjunto. (Hyperplane: 100,55 = 0,104 × tumor índice de volumen + 0,895 × proliferación + 21,1 x longitud del buque)
con el fin de evaluar aquellos factores que fueron más esencial para distinguir el grupo de dosis alta PKE del grupo control, se realizó una prueba exhaustiva de la MD para diferentes combinaciones de las 6 covariables. Se detectaron los efectos más prominentes como una combinación del volumen del tumor, el índice de proliferación y la eslora del buque. La investigación de las interacciones entre estos tres marcadores reveló que incluso si las covariables individuales por sí solas no eran lo suficientemente informativo para distinguir los dos grupos, cuando se consideran en conjunto, los vehículos y altas dosis de grupos PKE eran separables linealmente con un hiperplano (Fig. 5C). Por otra parte, si bien el vehículo y la diferencia entre los grupos de dosis baja no fue estadísticamente significativa, la tendencia general en los tres grupos sugiere un efecto antitumoral aumentado con un nivel de dosis crecientes (como se ve en el orden de las nubes negras, rojas y verdes en la Fig. 5C).
las concentraciones de compuestos fenólicos en el suero y la orina de los ratones portadores de tumores
se detectaron concentraciones micromolares de NTG, y MEPS en el suero de los animales expuestos a la dosis más alta de PKE ( Tabla 2). ácidos de resina que estaban presentes en el PKE no se detectaron en las muestras de suero u orina. Curiosamente, concentraciones significativas de RV, que es el metabolito monohidroxilado de PS, así como pinostilbene, un metabolito de MEPS, se detectaron en el suero y la orina de los ratones alimentados con la PKE (Tabla 2). Además, las concentraciones de RM y HMR y sus metabolitos enterolactona, enterodiol y 7-hydroxyenterolactone así como las concentraciones de MEPS, PS, NTG y pinostilbene aumentó significativamente en comparación con el control (Tabla 2). Estilbeno y lignanos metabolitos estaban presentes en el suero de 15 min-3 h después de la última administración (datos no mostrados), y las concentraciones más altas se midieron en 2 h (Tabla 2). El perfil de metabolitos en la orina (colección de 24 horas) era muy similar a la del suero (datos no mostrados).
Discusión
epidemiológicos y estudios preclínicos sugieren una relación inversa entre el consumo de alimentos ricos en polifenoles y la incidencia de enfermedades crónicas como el cáncer [3], [7], [31]. En particular, los lignanos y estilbenos, y sus metabolitos, son candidatos atractivos para la reducción del riesgo CaP. En este estudio, hemos demostrado efectos anticancerígenos del extracto de pino silvestre nudo (PKE), una mezcla rica en lignanos y estilbenoides,
e in vitro
in vivo
en un modelo ortotópico de xenoinjertos CaP