Extracto
altamente tumores aneuploides son comunes en los cánceres de ovario epitelial (EOC). Se investigó si la expresión de NuMA se asoció con este fenómeno.
niveles de proteína NuMA en tejidos normales y tumorales, líneas celulares de ovario y cultivos primarios de células malignas derivadas de los fluidos ascíticos de ovario se analizaron mediante el análisis de microarrays de Affymetrix, inmunotransferencia, inmunohistoquímica (IHC) e inmunofluorescencia (IF), con resultados correlacionados con los datos clínicos asociados. aneuploidía en cultivos primarios se determinó mediante análisis FACS.
datos de microarrays de Affymetrix indicaron que NuMA se sobreexpresa en el tejido tumoral, cultivos primarios y líneas celulares en comparación con tejido ovárico normal. IHC reveló baja a la expresión de NuMA débil en los tejidos normales. La expresión se regula positivamente en los tumores, con una asociación significativa con el estadio de la enfermedad en subtipos EOC mucinosos (p = 0,009), la afectación ganglionar (p = 0,03) y la edad del paciente (p = 0,04). Adicional análisis de datos discontinuos reveló que los niveles altos NuMA en tumores disminuyeron con el grado (p = 0,02), pero aumentó con el estadio de la enfermedad (p = 0,04) en la EOC serosa. NuMA expresión disminuida en la enfermedad tardía EOC etapa 4 endometrioide. Los niveles altos de NuMA disminuyeron con el aumento de la invasión del tumor en todos los subtipos (p = 0,03). IF de cultivos primarios reveló que los niveles altos NuMA en polos del huso mitótico se asociaron significativamente con una proporción reducida de las células en la citocinesis (p = 0,05), el aumento de binucleación (p = 0,021) y multinucleación (p = 0,007), y aneuploidía (p = . 0.008)
NuMA es altamente expresado en tumores de EOC y altos niveles de NuMA se correlacionan con aumentos en defectos mitóticos y aneuploidía en cultivos primarios
Visto:. Brüning-Richardson a, Bond J, R Alsiary , Richardson J, Cairns DA, McCormac L, et al. (2012) NuMA sobreexpresión en cáncer ovárico epitelial. PLoS ONE 7 (6): e38945. doi: 10.1371 /journal.pone.0038945
Editor: J.Christopher Unidos, Universidad de Louisville, Estados Unidos de América
Recibido: 26 Enero, 2012; Aceptado: 14 de mayo de 2012; Publicado: 14 Junio 2012
Derechos de Autor © 2012 Brüning-Richardson et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo y el Dr. Bruening-Richardson fueron financiados por el Cancer Research Yorkshire [L328]. La Universidad de Leeds es compatible con el Dr. Bond, Dr. Burns, el Dr. Hall y el Dr. Morrison. El Dr. Bell está apoyada por el Cáncer de Mama Campaña [2007NovPR53], el Dr. Alsiary por una beca de la Arabia Ministerio de Educación Superior, el Dr. Cairns Arabia por el Consejo de Investigación Médica del Reino Unido [G0802416], el Dr. McCormac por Oncolytics Biotech Inc, (Calgary, Canadá) y el Dr. Wilkinson y el Dr. Hutson por Leeds Teaching Hospitals NHS Trust. El Dr. Bond, Dr. Burns, el Dr. Wilkinson, el Dr. Morrison y el Dr. Campana tienen fondos de Yorkshire de Investigación del Cáncer, GDH de Investigación del Cáncer del Reino Unido, y el Dr. Burns y el Dr. Wilkinson de Bienestar de la Mujer. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la proteína 238 del aparato mitótico nuclear kDa (NuMA) es un componente del núcleo en interfase y la matriz de polo del huso mitótico [1]. NuMA tiene funciones en conjunto del husillo a través de su asociación con motores de microtúbulos [2], [3] y en el posicionamiento del cabezal durante la división celular asimétrica [4]. Un papel de interfase adicional como una proteína de andamiaje nuclear se ha propuesto [4] - [6]. NuMA se expresa de forma ubicua [6], [7]. Las localizaciones de polos nucleares y de cabezal de NuMA están bien caracterizados en el tejido normal [8], [9] y en los tejidos tumorales por inmunohistoquímica (IHC) en el Protein humano Atlas. El papel que las proteínas de la mitosis como NuMA podrían desempeñar en el cáncer se ha convertido recientemente en un tema de renovado interés que se ha hecho evidente que la aneuploidía es una característica común de los tumores que podrían conducir su progresión [10], [11].
EOC es una enfermedad compleja que es difícil de tratar debido a la presentación tardía, recurrencia de la enfermedad después del tratamiento y las altas tasas de quimio-resistencia. La biología de EOC es poco conocida y mejoras en el diagnóstico y la terapia son altamente deseables [12]. carcinomas de ovario a menudo se caracterizan por cariotipos con aneuploidía grave debida a la inestabilidad cromosómica (CIN) y triploidización [13]. Se ha propuesto que la aneuploidía es una característica de los primeros aberraciones en EOC [14]. tumores aneuploides no responden tan favorablemente al tratamiento de los tumores diploides, lo que lleva a reducir las tasas de supervivencia [15]. El
NUMA1
mapas de genes en el cromosoma 11q13 [16], una región amplificada comúnmente en el cáncer de ovario [17]. Sin embargo, hasta donde sabemos no hay publicaciones han relacionado la expresión NUMA aneuploidía en EOC. Se analizaron los niveles de NuMA en cultivos primarios de células malignas derivadas de los fluidos ascíticos de ovario, en sus tejidos tumorales asociados, en los tejidos de los tumores primarios de ovario no relacionados y en el tejido ovárico normal utilizando el análisis de Affymetrix array, blotting ranura, IHC e inmunofluorescencia (IF). Se encontró expresión NuMA ser aumentada en muestras tumorales en comparación con los controles normales. Si el análisis de cultivos primarios identificó una asociación entre el aumento de cantidades de NuMA en los polos del huso y las tasas de binucleación y multinucleadas, mientras que el análisis FACS reveló una correlación positiva entre el aumento de la expresión NuMA y aneuploidía. Este estudio demuestra por primera vez que la expresión está regulada positivamente en NuMA EOC y que esto está asociado con la aneuploidía se ve en este tipo de cáncer.
Resultados
Affymetrix análisis de microarrays
Examen de Affymetrix datos de microarrays de un panel de líneas celulares de cáncer de ovario, cultivos primarios y tejidos tumorales mostraron que NuMA fue consistentemente sobre-expresado en un nivel transcripcional en comparación con tejido ovárico normal. Sólo dos muestras ascíticos tenían niveles más bajos de expresión en comparación con un control normal interna (N) (Figura 1A). Este trabajo inicial sugirió que un nuevo estudio de la expresión NuMA en los EOC estaba justificado.
A. Affymetrix datos muestran NuMA sobre-expresión en 6 líneas de ovario de células (JAMA-2, IOVE (línea celular adicional inmortalizada epitelial de ovario), Skov-3, TR175, OVCA-433 (además) y 1847 (todas las barras de color gris, designado CL) , 38 muestras de células primarias cultivadas a partir de líquido ascítico (barras negras, designados - a, incluyendo algunas muestras con colecciones consecutivas o pasajes) y 4 cultivos primarios establecidos a partir de tejido tumoral (designados -T1 a - T4) A1, A2 y A4 son. tejido tumoral (T1, T2, T4) muestras de ascitis asociados. los valores de intensidad obtenidos para las muestras se normalizaron a un control interno (normal epitelial de tejido de ovario (N)) y la expresión de genes niveles se muestran como la relación de los niveles de intensidad /controlar el nivel de intensidad como un valor log10. B. NuMA niveles en los lisados celulares. un ejemplo representativo de un lisados analizados para la expresión Numa por transferencia en ranura asterisco indica Negro líneas celulares de ovario (1847, TR175, JAMA-2), Asterix marrón de la línea celular de neuroblastoma SH SY5Y, Asterix rosa la línea celular de adenocarcinoma de colon SW480, Asterix azul de la línea celular de cáncer cervical HeLa, y asterisco amarillo la línea celular de cáncer de mama MCF7. Todas las otras muestras son lisados de cultivos primarios de ovario. C. Histograma comparar los niveles de NuMA en líneas celulares de ovario, una línea celular primaria deriva de un trastorno benigno ginecológica (1153-A1) y cultivos primarios después de la normalización contra α-tubulina. D. Sección de normal (N) epitelial de ovario y tejido estromal y cáncer de ovario emparejado (Ca) en x10 y x40 de aumento después de NuMA inmunotinción. Las flechas indican las células epiteliales. Niveles bajos a medios de tinción nuclear NuMA se puede ver en las células epiteliales normales, con niveles más altos de tinción NuMA nuclear en las células epiteliales de cáncer de ovario. E. Análisis de un pequeño TMA de ovario muestra que la intensidad de tinción NuMA aumenta con el grado en el tejido del tumor de ovario.
Slot Blotting
Un total de 35 muestras se analizaron mediante transferencia de ranura. Esta cohorte consistió en 7 líneas celulares establecidas (JAMA-2, TR175, 1847, SW480, MCF-7, HeLa y SH-SY5Y), una muestra benigna (1153-A1) y 25 cultivos primarios. También se incluyeron lisados obtenidos a partir de 2 tejidos de tumor de ovario cultivadas en cultivo de tejidos (BE4163-T1 y AQ70880-T1). Un ejemplo representativo de una imagen slot blot de algunas de las muestras de se muestra en la Figura 1B. Normalización contra un control interno α-tubulina confirmó que no había variación en los niveles de proteína NuMA entre las muestras analizadas (Figura 1C). Entre las líneas celulares de 1847 tuvo el mayor nivel de expresión NuMA, seguido de TR175 y JAMA-2. La muestra benigna 1153-A1 tenía un nivel NuMA medio, mientras que hubo una variación entre las culturas primarias con ascitis 3 (1141-A1, 1134-A1 y AE6792-A1) que expresa los más altos niveles de Numa todas las muestras. No se observó ninguna asociación significativa entre los resultados de inmunotransferencia NuMA y los datos clínicos asociados. De modo tranquilizador, los niveles de proteína NuMA en general se corresponden bien con los niveles de expresión de ARN visto en los cultivos primarios y líneas celulares de ovario examinados por el análisis de microarrays de Affymetrix.
La inmunohistoquímica
La inmunotinción indicó que la expresión NuMA en las secciones enteras de tejido ovárico normal era variable, desde muy bajo a niveles débiles en estromal y núcleos de las células epiteliales (n = 7) (Figura 1D). Para los 5 casos de tejido normal con tejido tumoral asociado, se identificó un claro aumento en la expresión de NuMA en 40% (2/5) de las muestras tumorales. Hasta el 95% de los núcleos en los tumores primarios se muestra media a fuerte tinción NuMA (Figura S1a-d). NuMA también se observó en los polos del huso mitótico de las células tumorales (Figura S1b flecha). El análisis de una pequeña cáncer de ovario en-casa generado TMA reveló que 95% de los núcleos de las células tumorales se tiñeron positivamente para NUMA en 24 de 25 núcleos. Sorprendentemente, el análisis de los datos después de la aplicación de un sistema de puntuación que subdivide muestras en baja NuMA (todas las puntuaciones negativas, muy débiles y débiles) y niveles altos NuMA (puntuaciones medias y altas) mostró que los niveles altos NuMA fueron detectados sólo en tumores de grado 3 (33%; Figura 1E). La tinción de un TMA de ovario más grande confirmó la expresión de bajo y alto NuMA entre los núcleos (Figura 2). El análisis inicial de los datos globales, independientemente de subtipo de cáncer mostró que los niveles altos NuMA aumentaron con el grado del tumor (de 20,3% para los tumores de grado 1 a 24,1% para los tumores de grado 3,
p
= 0,0016) y estadio de la enfermedad (una aumentar del 19,6% para la etapa 1 a la del 33,3% para la etapa 4,
p = 0,0077
) (datos no mostrados). El análisis de los datos continuos para el grado del tumor y el estadio de la enfermedad, lo que incluye la subdivisión en los tipos de cáncer para los que se dispone (seroso, mucinoso y endometrioide) suficientes datos, se indica que la expresión NuMA correlacionado con el aumento del grado en el subtipo mucinoso (
p
= 0,009) (Figura 3A). Existe una correlación significativa con el compromiso de los ganglios linfáticos (
p
= 0,03) (Figura 3B) y la edad (
p
= 0,04) (Figura 3C) se observó en todos los subtipos. Un análisis más detallado de los resultados como datos discontinuos (bajo NuMA vs alta NUMA) reveló una asociación estadísticamente significativa adicionales. La proporción de las muestras con altos niveles de NuMA disminuyó con el grado (
p
= 0,02) (Figura 3D) y el aumento en la etapa tardía de la enfermedad en EOC serosa (
p
= 0,04) (Figura 3E) . En los EOC mucinosos, los niveles aumentaron NuMA con el grado (
p
= 0,005) (Figura 3F). A finales de los EOC endometrioides etapa, la expresión de NuMA disminuyó (Figura 3G) y alta NuMA disminuyó con un aumento en el estado de la invasión tumoral (
p
= 0,03) (todos los subtipos) (Figura 3H). NuMA baja expresión se observó en toda la población de la muestra de 13 EOC de células claras, independientemente de la etapa de la enfermedad.
patrones de tinción NuMA bajos y altos observados en los núcleos de serosa, mucinoso, de endometrio y carcinomas de células claras de ovario en un gran escala TMA. x10 aumentos.
A. El análisis estadístico de la gran cáncer de ovario TMA que muestra la expresión NuMA aumenta con la etapa de la enfermedad en el subtipo mucinoso. B. Expresión NuMA se asocia con afectación de los ganglios linfáticos (T3cN1MO) (todos los subtipos). C. expresión NuMA se asocia con la edad del paciente (todos los subtipos). D. Los altos niveles de NuMA disminuyen con el grado del tumor en el subtipo seroso. los niveles de E. alta NuMA están asociados con la enfermedad en estadio 4 en EOC serosas. niveles F. alta NuMA aumentan con el grado del tumor en los EOC mucinosos. G. niveles de alta NuMA disminuyen con el estadio de la enfermedad en la EOC endometrioide. H. niveles de alta NuMA disminuyen con el estado de la invasión tumoral (T1 a T3) (todos los subtipos).
Los análisis de inmunofluorescencia
Si el análisis reveló la existencia de un patrón de tinción nuclear NuMA en la interfase todas las líneas celulares, uno cultivo primario adaptado como una línea celular (GYNA0089) y 23 cultivos primarios (Figura 4A, B). En la mitosis NuMA fue encontrado en los polos del huso (Figura 4C) en todas las líneas celulares y cultivos primarios examinados. número suficiente de células mitóticas para el análisis adicional se identificaron en 16 cultivos primarios. En estas muestras se examinaron las células en división para la estadificación mitótico y la presencia de defectos mitóticos específicos. Por último, una encuesta de indicadores de interfase de aneuploidía se realizó en todas las muestras.
A. Ejemplos de núcleos en interfase con baja (a-d) y alta (e-h) los niveles de NuMA, y husos mitóticos con bajo (i-l) y alta (m-p) niveles de NuMA en polos del huso. Verde - Numa rojo - a-tubulina, azul - DAPI. Barra de escala = 5 micras. B. Histograma comparando NuMA fluorescencia nuclear intensidades de tinción en cuatro líneas celulares de ovario, una línea celular establecida a partir de un cultivo primario (GYNA0089) y 23 cultivos primarios derivados de líquido ascítico. C. Histograma comparando las intensidades de tinción NuMA en los polos del huso en el subconjunto de líneas celulares y culturas en las que un número suficiente de células mitóticas eran para su análisis.
intensidades de tinción diferían entre las muestras (Figura 4). Se observó que algunas muestras se componen de células con tinción bajo nivel NuMA en núcleos en interfase y en los polos del huso mitótico (Figura 4A, una d e i-l; 4B, C) y algunas muestras estaban compuestas de células con alta tinción NuMA intensidades (Figura 4A, e-h y m-P; Figura 4B y C). También observamos que cada muestra difiere con respecto a la proporción de células en cada fase mitótica y que exhibe una amplia gama de defectos mitóticos. Estos defectos en metafase incluidos como husillos tripolares y multipolares (Figura 5A, a-d) y husillo de desalineación (Figura 5A, e); anafase defectos tales como los cromosomas menos y puente cromosómica (Figura 5B, a-c); y defectos cytokinetic incluyendo puente de cromátidas y la generación de células hijas de tamaño desigual (Figura 5C, a-d). Binucleación, multinucleación y la presencia de micronúcleos eran defectos comunes en células de la interfase (Figura 5D, a-c). Los ejemplos mostrados en la Figura 5E fueron los errores mitóticos más comunes observados.
A. mitótico defectos observados en la metafase incluyen (a) husillos bipolares asimétricas (b) polos múltiples husillos, (c) husillos tripolar, (d) los husillos bipolares con múltiples polos del huso (e) células con husos fuera de lugar y mal alineados (periferia de la célula se indica). B. defectos observados en la anafase de la mitosis incluyen los cromosomas menos y anafase puente (un -c). C. defectos observados durante la telofase de la mitosis y la citocinesis incluyen (a) husillos anormales, (b) la citocinesis anormal con formación de micronúcleos, (c), puente de cromátidas y (d) la formación de células hijas de tamaño desigual. D. Ejemplos de (a) binucleación, (b) multinucleación y (c) micronúcleos en cultivos primarios. Verde - Numa rojo - a-tubulina, azul - DAPI en todos los paneles. La barra de escala en A y B = 5 micras. La barra de escala en C y D = 10 micras. gráfico de E. Pie que ilustra la frecuencia global de defectos mitóticos observados en los cultivos primarios.
Se realizó una comparación de los perfiles de tinción NuMA a mitótico datos. Los altos niveles de NuMA en núcleos en interfase se asociaron significativamente con una pequeña proporción de células en la telofase (
p = 0,012
) y una alta proporción de células que muestra una placa de metafase suelto (
p = 0,032
) (Figura 6A y B). Los altos niveles de NuMA en los polos huso mitótico se correlacionaron significativamente con altos índices de binucleación (
p = 0,021
) y multinucleadas (
p = 0,007
) (Figura 6 C y D) y de nuevo con metafase suelta placas (
p = 0,041
) (Figura 6E). Los bajos niveles de NuMA en los polos del huso correlacionaron significativamente con una alta proporción de células en la citocinesis (
p = 0,05
) (Figura 6F). Curiosamente, los niveles intermedios de NuMA en los polos del huso correlacionaron significativamente con bajos índices de error en la citocinesis. (
p = 0,01
) (Figura 6G). A fin de verificar los datos observados en el análisis de inmunofluorescencia de los cultivos primarios que inmunotiñeron secciones enteras de tejido tumoral sólido a partir de los 23 pacientes cuyos fluidos ascítico se usaron para generar las culturas. Esto confirmó que los tumores sólidos que muestran altos niveles de tinción NuMA generaron cultivos primarios de ascitis donde las células muestran altos niveles de expresión NuMA (Figura S1 a-d). Para cerciorarse de que la interfase observada y mitótico defectos eran también una característica común de los tejidos tumorales asociadas se analizaron 23 secciones tumorales disponibles para nosotros Numa inmunotinción y H & amp; E tinción IHC. Hemos observado que los mismos defectos en interfase y mitosis estaban presentes en estos tumores como en las muestras de ascitis. Imágenes representativas y un resumen de los defectos observados entre las muestras se muestran en la Figura S2A-D. Además, se encontraron cultivos de células con un alto índice mitótico para mostrar una alta actividad mitótica en el tejido tumoral asociada (Figura S3). Por último, se exploró la relación entre NuMA niveles de expresión en cultivos primarios y la supervivencia del paciente. Esto sugiere que los pacientes con moderada a fuerte inmunotinción NuMA en los polos del huso en cultivos primarios tienen una tasa de supervivencia menor que los pacientes con una débil inmunotinción NuMA, aunque estos datos preliminares no alcanzaron significación estadística (Figura S4), quizás debido al reducido tamaño de la muestra.
NuMA expresión nuclear fuerte se asoció con (a) la menor proporción de células telofase y (B) la mayor proporción de células con una placa de metafase difusa. etiquetado polo NuMA husillo fuerte se asocia con altas tasas de (C) binucleación, (D), multinucleadas (E) una placa de metafase difusa y (F) la menor proporción de células en la citocinesis. (G) tinción polo del huso intermedio se asoció con la menor proporción de células que presentan un defecto citocinesis. (H) FACS análisis reveló que sólo las células con altos niveles de NUMA aneuploides.
FACS
análisis FACS indicó que sólo las células de cultivos primarios con alta intensidad de la tinción NuMA polo del huso eran aneuploides (Figura 6H), una observación estadísticamente significativa (
p = 0,008
).
Discusión
En este estudio tuvo como objetivo investigar
NuMA1
expresión en EOC y relacionar esto con la aneuploidía se encuentra en este tipo de cáncer. Una búsqueda Oncomine inicial indicó que la expresión está regulada positivamente en NuMA EOC. Nuestros datos experimentales generados por Affymetrix de perfiles también sugirieron que
NuMA1
expresión se upregulated en el cáncer de ovario. Se confirmó esta observación a nivel de proteínas por IHC, señalando que NuMA nuclear estaba presente en niveles bajos en los núcleos de estroma ovárico normal y el epitelio mientras que los tumores primarios de ovario tenían niveles elevados NuMA. Los altos niveles de NuMA se asociaron con el grado del tumor, estadio de la enfermedad, y la afectación ganglionar y la inversa de la invasión tumoral. Sin embargo, la expresión NuMA difirió entre los cuatro subtipos principales de EOC. Considerando que los niveles NuMA disminuyeron con el grado del tumor y aumentó con la etapa de la enfermedad en el subtipo seroso, que aumentaron con el grado del tumor en el subtipo mucinoso y disminuyeron con el estadio de la enfermedad en el subtipo endometrioide. En el subtipo de células claras sólo se observaron niveles bajos de NuMA. Estas diferencias pueden reflejar la heterogeneidad molecular de los EOC. Recientemente, los EOC han sido reclasificados de acuerdo con sus características moleculares en tipo I (de bajo grado seroso, endometrioide de bajo grado, todos los carcinomas mucinosos y de células claras) y (carcinomas de alto grado serosas y endometrioide) tipo II con mutaciones principalmente en
KRAS
y
Hoteles en PTEN tipo I y las mutaciones en
TP53
en [25], [26] de tipo II. NuMA niveles en nuestro estudio fueron más altas en los EOC tipo I (tipos de cáncer seroso y mucinoso de bajo grado), lo que sugiere NuMA sobreexpresión podría ser un evento temprano en la carcinogénesis.
Las células malignas derivadas de los fluidos ascíticos se han utilizado en el pasado para generar una gran cantidad de información acerca de la inmunología y la terapéutica en EOC y se ha propuesto que su uso podría complementar los procedimientos de diagnóstico convencionales [27]. En este caso, el estudio si los cultivos primarios permitió una novela y un examen detallado de las pruebas de aneuploidía mediante la identificación de ambos mitótico defectos específicos y las consecuencias de interfase de tales defectos. Curiosamente, encontramos que los niveles altos NuMA en los polos del huso se asociaron con altos niveles de binucleación y multinucleadas. El desarrollo de tetraploidía como resultado de la citocinesis no representa un potencial evento temprano en el desarrollo de la inestabilidad cromosómica (CIN) y cariotipos aneuploides finalmente en células tumorales [10]. Los defectos mitóticos que hemos observado en nuestros cultivos primarios, tales como husillos multipolares y defectos en la citocinesis, podría explicar la incidencia de células binucleadas y multinucleadas en estas muestras. En consonancia con esto, también se encontró una correlación estadísticamente significativa entre la aneuploidía y altos niveles de NuMA en los polos del huso en nuestras culturas.
Una vez establecido que los niveles de proteína NuMA están regulados por incremento en EOC y que esto está asociado con aneuploidía, el siguiente paso será determinar la complicidad funcional de NuMA en el desarrollo de esta aneuploidía. El trabajo de otros investigadores ha demostrado que la expresión condicional de NuMA en un mieloides de ratón resultados de la línea celular en la aneuploidía y la apoptosis [28]. Se sugirió que la sobreexpresión NuMA por sí sola no era suficiente para impulsar la transformación maligna de las células leucémicas sino que puede contribuir a la inestabilidad cromosómica, lo que permite eventos genéticos que promueven la progresión del ciclo celular o la protección de la apoptosis que se produzca. Uno de estos eventos podría ser la adquisición de mutaciones de p53, tales como los observados en los carcinomas serosos de alto grado [29]. Alternativamente, NuMA interactúa con la proteína dineína motor durante la mitosis y se ha sugerido que la saturación de la actividad dineína por NuMA sobreexpresión podría antagonizar vías que las células cancerosas utilizar para resolver problemas tales como los husos multipolares. Estos normalmente surgen debido a la presencia de los centrosomas supernumerarios, lo que lleva a un aumento en la inestabilidad genómica impulsado por defectos en la mitosis [30]. Esta hipótesis puede ser aplicable a EOC ya que las consecuencias biológicas de divisiones celulares multipolares son consistentes con los resultados observados en nuestro trabajo de inmunofluorescencia. amplificación centrosomal También se ha observado previamente en las células de EOC y se ha relacionado con la aneuploidía y pobres resultados del paciente en serosa EOC. Este fenómeno parece ser causada por la sobreexpresión de Aurora-A, un miembro de la familia de serina /treonina quinasa que participan en eventos de la mitosis [31], [32].
El antígeno tumoral acrosina proteína de unión (ACRBP) /OY-TES-1, se ha demostrado que interactúan con NuMA. Una relación co-dependiente con un papel en la resistencia paclitaxel en EOC se ha propuesto [33]. Se sugirió NuMA sobreexpresión de causar perturbaciones mitóticas necesarios para la plasticidad del genoma preneoplásicas, con co-evolución de la sobreexpresión de ACRBP como tumores impulso del progreso de la adquisición de los rasgos para la normalización de estos primeros perturbaciones que de otro modo podría ser desventajoso para la proliferación de células de cáncer mediante la promoción catástrofe mitótica. El mismo estudio también reveló que la enfermedad más agresiva entre una cohorte de pacientes con EOC se asoció con altos niveles combinados de ACRBP y de Numa. La posibilidad de que la sobreexpresión NuMA actúa sinérgicamente con Aurora-A y la sobreexpresión ACRBP promover la aneuploidía, la supervivencia pobre y quimio-resistencia en EOC es intrigante y digno de mayor investigación. Como parte de esto, nuestros datos preliminares que sugieren que los niveles de expresión NuMA están asociados con la supervivencia en EOC será explorado más en una muestra más grande, establecido para determinar si este fenómeno es estadísticamente significativa.
En conclusión, nuestros datos demuestran de la primera vez que se sobreexpresa en NuMA EOC y que los niveles altos NuMA se correlaciona con el aumento de los defectos de la mitosis y la aneuploidía en cultivos derivados de ascitis de pacientes con tumores de ovario.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y primaria Los cultivos de células malignas de ovario derivados de líquido ascítico
Las líneas celulares utilizadas en este proyecto incluyen cuatro líneas celulares de cáncer de ovario (JAMA-2, Skov-3, TR175 y 1847), una línea celular de neuroblastoma (SH-SY5Y) , una línea celular de adenocarcinoma de colon (SW480), una línea celular de cáncer de cuello uterino (HeLa) y una línea celular de cáncer de mama (MCF7). Las líneas celulares se obtuvieron de Investigación del Cáncer del Reino Unido, la ECACC y la Colección Biología Celular ATCC. Se establecieron cultivos primarios de células derivadas de los fluidos ascíticos de ovario (GYNA0089), tejidos de tumor de ovario (BE4163-T1 y AQ70880-T1) o tumores benignos (1153-A1) tal como se describe anteriormente [18]. La información del paciente y los datos clínicos de los fluidos ascíticos de ovario se han descrito anteriormente [18].
Normal de ovario y el tumor de tejido
especímenes patológicos de formalina fijo, tejidos embebidos en parafina que consisten en secciones de ovárica normal tejidos y tumores primarios (incluyendo tumores que producen la ascitis de la que estaban dispuestos cultivos primarios) se obtuvieron del hospital Universitario de Histopatología del archivo de St. James, de Leeds. Siete tejidos normales estaban disponibles, las muestras tumorales 5 de los cuales también se habían asociado. Se obtuvieron un total de 23 tejidos tumorales emparejan cultivos primarios derivados de células malignas. Se identificaron otros 25 tumores primarios de ovario no relacionadas adicionales con los datos clínicos asociados y se utilizan para crear un mini-microarrays de tejidos en-casa (TMA). El TMA compone de 9 adenocarcinomas serosos, 6 carcinomas endometrioide, 2 mucinosos, 2 mixta de Müller, 5 mixta endometrioide y seroso, y el 1 de adenocarcinoma. Un TMA cáncer de ovario de alta densidad que consta de 280 casos de adenocarcinoma de ovario (seroso, mucinoso y endometrioide), 13 de carcinoma de células claras, un carcinoma de células transicionales, 20 de tejido normal adyacente y 8 tejidos normales por duplicado, con el escenario y la información de grado, se obtuvo de array Networks tejidos (Tissue OV6161, matriz de red). datos clínicos que se acompañan incluyen la edad del paciente, compromiso de los ganglios linfáticos, invasión tumoral y la metástasis.
se establecieron los datos del paciente
detalles clínicos asociados para pacientes en los que los cultivos primarios de células malignas derivadas de los fluidos ascíticos de ovario, se describe anteriormente [18].
Affymetrix Profiling
Los datos para las líneas celulares de ovario, cultivos primarios y muestras de tumores asociados fue recuperado a partir de un análisis de la expresión génica de microarrays, generado con GeneChip HG-U133 Plus 2.0 arrays (Affymetrix) que se normalizó el uso MAS 5,0 como se ha descrito anteriormente [18].
Los anticuerpos
El NuMA anticuerpo monoclonal Ab-2 (clon 107-7, Calbiochem) se usan en este estudio . Este previamente se ha utilizado ampliamente para el Western blotting, inmunofluorescencia y IHC [19], [20]. Por si los estudios de rata anti-α-tubulina de anticuerpos (1/500, MCA77G, Serotec) se utilizó para identificar los microtúbulos y 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI 5 g /ml, Sigma-Aldrich) utiliza para teñir ADN .
se realizó ranura secante
Blot ranura de lisados de células como se ha descrito anteriormente [18]. 0,01 mg de muestra se cargó en cada pocillo y el anticuerpo monoclonal NuMA Ab-2 se utilizó a una dilución 1/400.
TMA construcción
Para la creación de un ovario TMA en la casa un protocolo descrito por Abd el-Rehim
et al
[21] fue seguido. Manual golpes Arrayer tejido con un diámetro de 0,6 mm (Beecher Instruments, Inc) se utilizaron para crear los núcleos.
La inmunohistoquímica
Las diapositivas que contienen secciones enteras o núcleos de TMA se bloquearon con 3% de H
2O
2 en metanol después de-encerado y rehidratación. La recuperación del antígeno se realizó mediante diapositivas-cocción a presión durante 2 minutos en la solución de antígeno desenmascarar (pH bajo, Vector Laboratories). Después de tres lavados de 5 minutos en TBS-Tween-20 (0,2%) los portaobjetos se bloquearon durante 10 minutos con 10 × caseína (Vector Laboratories) diluida 1:02 en agua destilada. Después de tres lavados de 5 minutos con TBS Tween-20 los portaobjetos que contenían secciones enteras se colocaron en unidades Sequenzer Shandon mientras portaobjetos que contenían secciones de TMA se colocaron plana dentro de una cámara de incubación humidificada para la incubación con el anticuerpo primario. NuMA anticuerpo Ab-2 diluido en solución de anticuerpos (Zymed) se aplicó a 1/300 para las secciones enteras y 1/100 para las diapositivas TMA. Las láminas fueron incubadas durante la noche a 4 ° C. Después de tres lavados de 5 minutos cada uno con TBS-Tween-20 los portaobjetos se incubaron en 100 l de HRP de conejo /ratón REAL ™ Envision ™ (DAKO) durante 30 minutos en la cámara de incubación o unidades Sequenzer. Después de tres lavados finales con TBS durante 5 minutos, se añadió solución de revelado (tampón de cromógeno DAB + /sustrato, Dako) durante un máximo de 10 minutos hasta que el color se había completado. La tinción se intensificó en 0,5% CuSO4 (en 0,9% de solución salina) durante 5 minutos. Después de la contratinción en hematoxilina durante 2 minutos, las secciones se deshidrataron y se montaron en DPX (Sigma). TMA imágenes fueron escaneados y analizados mediante el software Aperio ImageScope Visor. Las diapositivas que contienen secciones enteras fueron vistos con un microscopio Olympus BX61 con la cámara y el software Colourview CellP®. Se utilizó un sistema de puntuación de etiquetado, que aplica dos criterios de puntuación, [22]. En primer lugar, se contó el número de núcleos teñidos y se expresó como un porcentaje del número total de núcleos dentro de la sección de tejido o núcleo. En segundo lugar, la intensidad de la expresión predominante nuclear se puntuó como 0 - sin manchas, 1 - trace, 2- débil, medio y 3- 4- fuerte. La puntuación final se calcula como el porcentaje de núcleos teñidos, multiplicado por la intensidad de expresión predominante.