Extracto
Antecedentes
Suprimido en cáncer de hígado 1 (DLC1) sirve como una importante proteína proteína activadora de RhoGTPase (RhoGAP) que termina activa RhoA señalización en los cánceres humanos. aumento de la evidencia ha demostrado que la actividad supresora del tumor de DLC1 no sólo depende de la actividad RhoGAP, pero también se basa en la localización adecuada de adhesión focal a través de su interacción con proteínas de la familia tensina. Recientemente, hay informes que muestran que DLC1 también se encuentran en el núcleo; Sin embargo, la existencia y la actividad supresora tumoral relativa de DLC1 nuclear nunca han sido tratados con claridad.
Metodología y Principales conclusiones
en este documento proporcionamos nuevas evidencias de que la proteína DLC1, que predominantemente asociado con adhesiones focales y localizada en el citosol, transportados de forma dinámica entre citoplasma y núcleo. El tratamiento de células con bloqueador de exportación nuclear, Leptomycin B (LMB), retenido DLC1 en el núcleo. Para entender la entrada nuclear de DLC1, hemos identificado los aminoácidos 600 a 700 de DLC1 como una novela región que es importante para su localización nuclear. La actividad supresora de tumores de DLC1 nuclear se evaluó directamente mediante el empleo de una variante de fusión señal de localización nuclear (NLS) de DLC1 (NLS-DLC1) con localización nuclear preferencial. En las células de HCC SMMC-7721, la expresión de NLS-DLC1 no reprimir la formación de fibras de la formación de colonias y el estrés de actina
in vitro
. La actividad supresora de tumores de abrogada DLC1 nuclear se demostró por primera vez
in vivo fotos: por inyección subcutánea p53
- hepatoblastos RasV12 con expresión de NLS-DLC1 estable en ratones desnudos - /. Los hepatoblastos inyectados con expresión de NLS-DLC1 tumores formados de manera efectiva si se compara con el objetivo DLC1 no nuclear.
Conclusiones /Importancia
Nuestro estudio identificado una nueva región responsable de la entrada en el núcleo de DLC1 y demostrado la diferencia funcional de DLC1 en diferentes compartimentos celulares tanto
in vitro
y
in vivo
Visto:. Chan LK, Ko FCF, Sze KM-F, Ng IO -L, Yam PTC (2011) Nuclear orientados por Suprimido en cáncer de hígado 1 (DLC1) es menos eficiente en ejercer su actividad supresora tumoral ambos
in vitro
y
en Vivo
. PLoS ONE 6 (9): e25547. doi: 10.1371 /journal.pone.0025547
Editor: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: Junio 7, 2011; Aceptado: September 6, 2011; Publicado: 26 Septiembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Chan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Hong Kong Ayudas a la Investigación (HKU7798 /07M), Ayudas a la Investigación del Fondo de Investigación Cooperativa Consejo de Hong Kong (HKU 1 /06C y HKU 7 /CRG /09) y el Premio joven Investigador Sobresaliente (GTM a Yam). I.O.L. Ng es Loke Yew Profesor de Patología. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Suprimido en cáncer de hígado 1 (DLC1) fue clonado por primera vez por la hibridación de sustracción como un fragmento de gen que se ha eliminado con frecuencia en el carcinoma hepatocelular humano (HCC) [1]. La evidencia acumulada en la última década ha apoyado que se DLC1 underexpressed en diversos tipos de cánceres humanos, además de HCC [2], [3], [4], [5], [6], [7]. Restauración de DLC1 por la expresión ectópica en células con baja o ninguna expresión endógena de DLC1 retarda la proliferación celular, induce la apoptosis, se ralentiza el movimiento celular y se desintegra la estructura del citoesqueleto de actina
in vitro
[8], [9], [10 ]. Por el contrario, promueve la tumorigénesis DLC1 caída de un
in vivo
modelo de ratón hepatocarcinogénesis Myc impulsado con un fondo p53 nula [11]. La naturaleza de la disminución en la expresión patológica frecuente de la robusta actividad supresora de tumores experimentales DLC1 y ambos apoyan firmemente funciones DLC1 como un
de buena fe
supresor de tumores.
La actividad supresora de tumores de DLC1 está estrechamente vinculada a RhoGAP su actividad intrínseca, que regula a la baja la respuesta biológica mediada por Rho. DLC1 se ha encontrado para ser RhoA-, B, C y CDC42-específico [12], [13]. localización de adhesión focal mediante la interacción con proteína de la familia tensina es una de las características de DLC1 y se asocia funcionalmente con su actividad supresora de tumores. Esto fue apoyado por la evidencia de que DLC1 mutante con dominio RhoGAP intacta pero no pudo ser dirigidos a las adhesiones focales mostraron actividad supresora de crecimiento reducido
in vitro
[10], [14]. Dado que la adhesión focal focalización sitios de solapamiento DLC1 con el sitio de unión de proteínas tensina, se ha aceptado que las parejas DLC1 con tensina y funciones que el complejo supresor tumoral en la terminación de la focal actividad Rho adherencia asociada [10], [14], [15 ].
Un estudio reciente ha sugerido la presencia de residuos básicos motivo rico en DLC1 se asemeja a la NLS [16]. Además, se ha sugerido que la serina /treonina quinasa específica proteína D fosforila DLC1 para crear un sitio 14-3-3 de acoplamiento. La formación de complejos con 14-3-3 secuestra DLC1 en el citoplasma y detiene su entrada en el núcleo [17]. Sin embargo, la existencia y la regulación de la DLC1 nuclear no se han explorado a fondo. Lo más importante, la actividad supresora de tumor relativo de DLC1 nuclear nunca ha sido abordado directamente. En este estudio, hemos proporcionado evidencia amplia que la proteína DLC1 lanzaderas constantemente entre el citoplasma y el núcleo. Hemos llevado a cabo la primera caracterización funcional de DLC1 dirigida nuclear para examinar su actividad básica y el tumor supresor tanto
in vitro
y
in vivo
. Mediante el estudio de la localización subcelular de diversos mutantes DLC1, hemos identificado una nueva región en el dominio RhoGAP que es importante y suficiente para esta importación nuclear.
Resultados
DLC1 venía entre citoplasma y núcleo
la expresión de etiquetado DLC1-Myc (Myc-DLC1) en las células SMMC-7721 reveló su existencia en las adhesiones focales, citoplasma y núcleo (Fig. 1A). examen cuantitativo de la expresión en células DLC1 mostró su localización citoplasmática dominante con puntiforme patrón de adhesión focal en la periferia de la célula. Para explorar el movimiento de DLC1 entre el citoplasma y el núcleo, la localización Myc-DLC1 en las células se estudió en células tratadas con bloqueador de exportin, LMB. El tratamiento con LMB dio como resultado la retención nuclear de Myc-DLC1 en SMMC-7721 y las células BEL7402 (fig. 1B,
panel izquierdo
). En particular, todavía se observó adhesión focal DLC1 localizada, lo que implica sólo el DLC1 localizada adhesión no focal fue transportado y retenido en el núcleo. fraccionamiento celular corrobora aún más la presencia de DLC1 en la fracción nuclear de lisado celular (Fig. 1B,
panel de la derecha
). observación similar se obtuvo con DLC1 GFP-etiquetados (GFP-DLC1) (datos no mostrados). Se observó el movimiento dinámico de DLC1 bajo la retirada de LMB en diferentes puntos de tiempo (Fig. 1C). Se produjo re-modelado de adhesión focal citoplasmática y dentro de las 24 horas. Hemos extendido nuestra investigación mediante el examen de la localización de DLC1 endógeno en diversas líneas celulares. Fraccionamiento subcelular de Hep3B, HLE y las células SK-HEP1 seguido por inmunotransferencia utilizando anticuerpos específicos DLC1 apoya la presencia de DLC1 en el núcleo (Fig. 1D). Inmunofluorescencia para DLC1 endógena en las células SK-HEP1 mostró localización subcelular similar en el citoplasma y el núcleo (Fig. 1E). Consistentemente, DLC1 endógeno en Hep3B fue retenido en el núcleo después del tratamiento LMB (Fig. 1F). Para apoyar la idea de que las lanzaderas DLC1 entre citoplasma y núcleo bajo condiciones fisiológicas, se realizó inmunohistoquímica contra DLC1 sobre un hígado no neoplásico humano (Fig. 1G). tinción positiva DLC1 se detectó tanto en citoplasma y núcleo, apoyando además que DLC1 está presente en el núcleo.
células SMMC-7721 (A) se transfectaron transitoriamente con DLC1 etiquetado-Myc. DLC1 se visualizó con anticuerpo anti-Myc seguido de anticuerpo secundario conjugado con FITC. Núcleo se contratinción con DAPI. patrón de localización subcelular de DLC1 de 241 células transfectadas se contó DLC1 y clasifica en el grupo A a E como se indica. (B) SMMC-7721 y BEL7402 células fueron transfectadas transitoriamente con DLC1 etiquetado-Myc y se sometieron a un tratamiento LMB seguido por tinción de inmunofluorescencia con anticuerpos anti-Myc anticuerpos (
panel izquierdo
). Las células transfectadas se fraccionaron en porciones citoplasmáticas y nucleares, seguido por inmunotransferencia contra Myc para DLC1 exógeno, tubulina (marcador citoplásmico), LaminB y c-Jun (marcador nuclear) (
panel de la derecha
). las células (C) SMMC-7721 se transfectaron transitoriamente con DLC1 etiquetado-Myc, seguido de tratamiento LMB durante 6 horas. Después del tratamiento LMB (que fue designado como t = 0), las células se cultivaron con medio fresco y se fijaron en el punto de tiempo indicado. DLC1 exógeno se visualizó por el anticuerpo anti-Myc. (D) Hep3B, las células HLE y células SK-HEP1 se fraccionaron en porciones citoplasmáticas y nucleares, seguido de inmunotransferencia usando anticuerpos contra DLC1 endógeno, tubulina, LaminB y c-jun. (E) endógena DLC1 en las células SK-HEP1 se visualizó por el anticuerpo anti-DLC1 policlonal, seguido de anticuerpo secundario conjugado con FITC. Para servir como control negativo, las células SMMC-7721 sin expresión DLC1 se tiñeron con el anticuerpo anti-DLC1 polycloncal. El anticuerpo DLC1 sólo pudo detectar señal en las células SMMC-7721 con sobreexpresión DLC1 exógena, pero no las células no transfectadas. células (F) Hep3B fueron tratados con LMB durante 6 horas. entonces DLC1 endógena se visualiza por el anticuerpo anti-DLC1 policlonal, seguido de anticuerpo secundario conjugado con FITC. (G) Una sección del hígado no neoplásico humano fue immunostained para DLC1 (Brown). Los núcleos se counterstained por hematoxilina (azul). Células que muestran tinción positiva DLC1 nuclear fueron indicados por las flechas de sólidos de cabeza. núcleo de la célula que muestra tinción DLC1 negativo se indica por las flechas de cabeza hueca. Barra de escala:. 10 micras
DLC1 600-700 residuos cooperaron con NLS en la regulación de la entrada DLC1 nuclear
Las proteínas de gran tamaño molecular poseen señales de transporte nuclear para el transporte activo a través de la envoltura nuclear con la ayuda de complejo de transporte nuclear. Se ha propuesto que una NLS monopartite (423-431) [17] y NLS bipartita (415-431) [16] están presentes en DLC1 que facilitan la entrada nuclear de DLC1. Para tratar específicamente la localización de DLC1 sin las NLS propuestos por tratamiento LMB, se construyó DLC1Δ415-431 mutante que carece específicamente la propuesta NLS (Fig. S1A y S1B). La expresión de DLC1Δ415-431 en las células SMMC-7721 mostró la misma localización subcelular como DLC1 de tipo salvaje. Sorprendentemente, DLC1Δ415-431 todavía era sensible al tratamiento LMB y se retuvo en el núcleo tan eficazmente como wildtype DLC1 (Fig. S1C). También se ha informado de que la fosforilación en la serina-431 (S431) de DLC1 por la proteína quinasa D (PKD) [17] facilita la unión entre DLC1 y proteínas 14-3-3, evitando así la entrada nuclear de DLC1. Sin embargo, encontramos que DLC1 S431 mutante fosfo-defectuoso, S431A mostró grado similar de retención nuclear después del tratamiento LMB (Fig. S1D). Tomados en conjunto, no hemos podido proporcionar pruebas suficientes para apoyar la funcionalidad de la NLS propuesto, así como el papel de la fosforilación de S431 en la regulación del transporte nuclear de DLC1.
Se analizó si, aparte del motivo de la orientación nuclear sugeridos por lo demás, región adicional en DLC1 está implicado en la localización nuclear de DLC1. Para hacer frente a esto, hemos clonado y expresado mutantes de deleción GFP-DLC1 y examinamos su localización después del tratamiento LMB en células HeLa (Fig. 2A). Se encontró que DLC1 Δ292-646 deleción interna mutante mostró una reducción significativa de localización nuclear en el tratamiento LMB (Fig. 2B y 2C). Por otro lado, la retención nuclear de DLC1 1-807 C-terminal mutante de deleción no se vio afectada en comparación con los de tipo salvaje tras el tratamiento DLC1 LMB. Curiosamente, 1-807 mutante que contenía la propuesta de adhesión focal focalización región (región 200-500) [18] podría no estar dirigida de manera eficiente a las adhesiones focales y difusa se expresa en el citoplasma.
(A) Diagrama esquemático que muestra la estructura de DLC1 de tipo salvaje (WT DLC1) y sus mutantes de deleción (Δ292-646 y 1-807). (B) Las células HeLa fueron transfectadas transitoriamente con la expresión DLC1 GFP-etiquetados construye como aparece en (A), seguido de tratamiento LMB. adhesiones focales fueron contrastados con el anticuerpo anti-vinculina. La localización subcelular de DLC1 se registró contando al menos 100 células transfectadas por muestra. (C) Gráfico de barras que resume la localización subcelular de DLC1 y sus mutantes en (B) con o sin el tratamiento LMB. Los resultados representan un duplicado de dos experimentos independientes. También se destacaron los porcentajes de adhesión focal DLC1 positiva en el grupo individual.
Se ha propuesto que la región N-terminal de DLC1 regula negativamente su entrada en el núcleo [16]. Un número de potencial señal de exportación nuclear (NES) se ha mapeado en el 62-71, 764-773 y 792-801 residuos de DLC1 por
in silico
de búsqueda (Fig. S2A). La importancia de estas secuencias de señal en la regulación de la localización citoplasmática a continuación, se evaluó por inmunofluorescencia. La funcionalidad de NES en 764-773 y 792-801 residuos fueron excluidos por la expresión citoplasmática de 1-291 y 1-400 mutantes (Fig. S2B). Desde 609-parada y 648-839 mutantes visualizan mejoradas de localización nuclear, el papel de la NES en 62-71 residuos se analizó adicionalmente mediante la creación de un DLC1 Δ62-71 mutante. Este mutante mostró DLC1 característica de localización de adhesión focal similar a la de tipo salvaje, sin mostrar ningún aumento en la retención nuclear (Fig. S2B). Para aclarar la ausencia de retención nuclear no fue debido a la fuerte asociación de adhesión focal, DLC1 1-807Δ62-71, un mutante no se localice en las adhesiones focales se expresó. Sin embargo, también se encontró que este mutante a ser localizados predominantemente en el citoplasma. Tomados en conjunto, hemos encontrado que la eliminación de la NES previstos en el extremo N-terminal de DLC1 no afectó a su distribución nucleocytoplasmic.
Tras poner de relieve la región de direccionamiento al núcleo de la región centro de DLC1, se realizó la primera localización detallada análisis de un panel de mutantes de GFP-DLC1 (Fig. 3A). Curiosamente, hemos encontrado que la expresión de 350-807 mutante mostró una localización predominante nuclear. Similar prominente de localización nuclear se observó en Myc-DLC1 291-807 (datos no mostrados). El examen de 600-807 mutante reveló la localización nuclear similar, mientras 700-807 mutante localizada tanto en citoplasma y el núcleo en las células HeLa (Fig. 3B y 3C). El aumento de la localización nuclear de 600 a 807 mutante también fue apoyada por la expresión DLC1 más fuerte en la fracción nuclear obtenido en el ensayo de fraccionamiento bioquímico cuando se compara con los otros mutantes DLC1 (Fig. 3D). Tomados en conjunto, encontramos que la región DLC1 600-700 en el dominio RhoGAP también estuvo implicado en la entrada nuclear de DLC1.
(A) Diagrama esquemático que muestra la estructura de un panel de fragmentos DLC1 terminado en el aminoácido 807 y una serie de mutantes de deleción DLC1 interno de mapeado el sitio clave de orientación nuclear. Las estructuras de tipo salvaje y DLC1 Δ292-646 también se enumeran para la comparación. (B) Las células HeLa fueron transfectadas transitoriamente con las construcciones de expresión DLC1 GFP-etiquetados indicados. adhesiones focales fueron contrastados con el anticuerpo anti-vinculina. La localización subcelular de DLC1 se registró contando al menos 100 células transfectadas por muestra. gráfico (C) Bar resume el porcentaje de células con la localización citoplasmática y nuclear de DLC1 y sus mutantes en (B). Los resultados representan un duplicado de dos experimentos independientes. (D) células HeLa fueron transfectadas transitoriamente con las construcciones de expresión DLC1 GFP-etiquetados indicadas seguido de fraccionamiento subcelular. Los lisados citoplásmicos y nucleares fraccionados se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpos contra GFP, tubulina (marcador citoplasmática) y c-Jun (marcador nuclear). las células (E) HeLa fueron transfectadas transitoriamente con las construcciones de expresión DLC1 GFP-etiquetados indicados, seguido de tratamiento LMB. gráfico (E) Bar resume el porcentaje de células con la localización citoplasmática y nuclear de DLC1 y sus mutantes en (D). Los resultados representan un duplicado de dos experimentos independientes. Barra de escala:. 10 micras
Para confirmar aún más la importancia de esta nueva región, hemos suprimido región de 601 a 689 en DLC1 y se evaluó su localización. Curiosamente, encontramos una marcada reducción en la localización nuclear de DLC1Δ601-689 mutante después del tratamiento LMB (Fig. 3E y 3F). Como se ha demostrado por la Δ415-431Δ601-689 mutante en el que la reportada previamente NLS y nuestro sitio asignada se suprimieron, la supresión de 415 a 431 no se reduce aún más la retención nuclear mucho después del tratamiento LMB. Nuestros resultados sugieren que el nuevo sitio de mapeado juega un papel importante en la orientación de DLC1 en el núcleo.
Nuclear DLC1 perdió su actividad inhibidora en la supresión de la formación de colonias y la formación de fibras de actina estrés
in vitro
Hasta la fecha, no existe un estudio para evaluar la asociación funcional directa entre la localización nuclear y la función biológica de DLC1. Para medir la capacidad funcional de DLC1 nuclear
in vitro
, creamos y confirmó la expresión de un DLC1 dirigida nuclear (NLS-DLC1) (Fig. 4A y 4B). Por inmunofluorescencia, se confirmó que NLS-DLC1 fue predominantemente localizados en el núcleo de las células SMMC-7721. Un mutante DLC1 RhoGAP impulsada por el NLS, NLS-K714E también podría estar dirigida al núcleo tan eficientemente como el DLC1 de tipo salvaje (Fig. 4C). A continuación, examinó la integridad de las fibras de estrés de actina en las células SMMC-7721 transfectadas transitoriamente por estos mutantes. A diferencia del desmontaje de las fibras de estrés de actina en las células transfectadas DLC1, NLS-DLC1 sólo podía suprimir parcialmente la formación de fibras de estrés de actina (Fig. 4D). Como control negativo, las células transfectadas con DLC1 K714E muestran las fibras de estrés de actina intactas. Se observó patrón similar en células que expresan NLS-K714E más el apoyo a que nuestro sistema de focalización nuclear no ejerció efecto no específico en la formación de fibras de estrés de actina. actividad RhoGAP de DLC1 se ha demostrado que estar estrechamente asociado con su actividad supresora de crecimiento. A continuación realizó ensayo de formación de colonias para evaluar la
vitro
actividad supresora de crecimiento en de NLS-DLC1 tanto en SMMC-7721 y las células HeLa (datos no mostrados). De acuerdo con el efecto sobre la formación de fibras de estrés, NLS-DLC1 mostró que la actividad supresora de crecimiento en gran medida reducida en comparación con DLC1 (Fig. 4E) Tomando en conjunto, se encontró que DLC1 nuclear pierde la capacidad para suprimir el crecimiento celular.
( a) diagrama esquemático que muestra la estructura de la DLC1 objetivo nuclear (NLS-DLC1) utilizado para el experimento de expresión transitoria. La secuencia de ADN que codifica la NLS monopartite que consiste en cinco aminoácidos básicos KKKRK se insertaron en frente del marco de lectura abierto de DLC1 etiquetado-Myc. Traducción de la construcción de expresión manipulado codificado Myc-tagged NLS-DLC1. (B) lisados HEK293T con overexpressed DLC1 etiquetado-Myc o NLS-DLC1 se inmunotransfirieron con anticuerpo anti-Myc. las células (C) SMMC-7721 se transfectaron transitoriamente con los constructos de la mutante RhoGAP (K714E) DLC1 de tipo salvaje se indica o. La proteína marcada con Myc se visualizó por el anticuerpo anti-Myc seguido de anticuerpo secundario conjugado con FITC. La localización subcelular de DLC1 se registró contando al menos 100 células transfectadas por cada muestra. gráfico de barras que indica el porcentaje de células con tinción DLC1 nuclear. Los resultados representan un duplicado de dos experimentos independientes. (D) células SMMC-7721 se transfectaron transitoriamente con los constructos etiquetados DLC1-Myc indicados y las fibras de estrés de actina se tiñeron con faloidina conjugada con TRITC 1 hora después de la inducción de suero. El asterisco (*) marca las células DLC1 transfectadas. (E) El gráfico de barras que muestra la eficiencia relativa de la formación de colonias de células SMMC-7721 se transfectaron con las construcciones indicadas DLC1 y el vector pEGFP-C1 que llevan el gen resistente a la neomicina en relación de 10:01. Se seleccionaron las células transfectadas con G418 durante 2 semanas. Las colonias formadas se visualizaron por tinción con violeta cristal y cuantificada. Se encontró que la diferencia media entre el grupo indicado para ser estadísticamente significativa (***
P Hotel & lt; 0,005; no apareado
t-test
). Barra de escala: 10 micras
Nuclear DLC1 no suprimió
in vivo
tumorigenicidad
Para evaluar la actividad supresora de tumores de DLC1 nuclear
in vivo
, se realizó la expresión retroviral estable de objetivo DLC1 ratón marcado con Myc nuclear en un p53 nulos hepatoblastos de ratón con la activación constitutiva RasV12 [11]. DLC1 estaba dirigida al núcleo mediante la inserción de una repetición en tándem de tres NLSs monopartite (NLS3) delante del codón de inicio de DLC1 ratón en el constructo de expresión retroviral (Fig. 5A). Después de la selección con puromicina, los clones resistentes se expandieron y se encontraron clones resistentes a más de un 95% para ser GFP positiva, lo que confirma la alta eficiencia de la transducción retroviral (Fig. 5B). También confirmó el éxito de direccionamiento nuclear DLC1 ratón por tinción de inmunofluorescencia para la proteína de fusión NLS3-DLC1. Se encontró que más del 90% de las células NLS3-DLC1 transducidas mostró tinción nuclear en comparación con la tinción citoplásmica en las células transducidas DLC1. La tinción de fondo con anticuerpo anti-Myc fue apenas detectable en las células de vector (Fig. 5B). Además, confirmó las proteínas DLC1 nivel de expresión por inmunotransferencia (Fig. 5C). Para confirmar aún más que la propiedad de vaivén nucleocytoplasmic se conserva en nuestra DLC1 sobreexpresan modelo hepatoblast, se trataron las células que expresan DLC1 con LMB, seguido por inmunofluorescencia. Se encontró que el tratamiento con LMB podría conservar constantemente DLC1 en el núcleo (Fig. 5D). Esta observación apoya, además, que la propiedad de vaivén nucleocytoplasmic se conserva en los ortólogos DLC1 humanos y de ratón. El
in vivo
tumorigenicidad de estos clones estables se examinó mediante inyección subcutánea en los ratones desnudos. Consistentemente, DLC1 exhibió efecto de supresión de la formación de tumores, mientras que DLC1 nuclear mostró una reducción significativa en la supresión de la tumorigenicidad
in vivo
(Fig. 5E y 5F).
(A) Diagrama esquemático que ilustra la retroviral vectores usados para conducir la expresión estable de DLC1 ratón marcado con Myc y la DLC1 ratón dirigido al núcleo (NLS3-DLC1). (B) hepatoblastos infectadas con vector, DLC1 o NLS3-DLC1 retrovirus se fijaron y la expresión de la proteína Myc-etiquetados se visualizó por el anticuerpo anti-Myc seguido de anticuerpo secundario de Texas Red conjugado. (C) Los lisados de hepatoblastos infectados con vector, DLC1 o retrovirus NLS3-DLC1 se sometieron a inmunotransferencia utilizando anticuerpos contra Myc, DLC1 y GFP. β-actina se sirvió como control de carga. (D) hepatoblastos infectadas con el retrovirus DLC1 fueron sometidos a un tratamiento LMB. Las células fueron fijadas y la localización de la DLC1 etiquetado-Myc se visualizó por el anticuerpo anti-Myc seguido de anticuerpo secundario de Texas Red conjugado. gráfico de barras que indica el porcentaje de células con tinción DLC1 nuclear. Los resultados representan un duplicado de dos experimentos independientes. (E) La tumorigenicidad de los hepatoblastos retroviral indicada transducidas se evaluó mediante la inyección subcutánea ratones desnudos. 1 × 10
5 hepatoblastos se inyectaron por vía subcutánea a día 0 y se controló el volumen del tamaño del tumor diariamente desde el día 4. Todos los ratones fueron sacrificados en el día 14. En el día 14, los ratones se sacrificaron y se diseccionaron los tumores. (F) Los tumores diseccionados se pesaron y se registraron sus masas. Barra de escala:. 10 micras
Se ha informado de que la expresión ectópica de DLC1 en células negativas DLC1 podría inducir la apoptosis [19]. Para probar si NLS3-DLC1 exhibió actividad biológica diferencial en la inducción de apoptosis, se estableció y se analizaron las células HEK293T que expresan de forma estable DLC1 nuclear mediante citometría de flujo para la población de células subG1 (Fig. S3B). Para evitar cualquier posible efecto clonal, dos clones de cada grupo se recogieron para el análisis. Encontramos que las células que expresan DLC1 mostraron un aumento de pico subG1 cuando se compara con el vector y las células que expresan NLS3-DLC1. DLC1 células que expresan también mostraron una reducción G1, pero aumentó la población S (Fig. S3 B). explicación plausible para esto podría ser que las células que expresan DLC1 pueden pasar más tiempo en la fase S, una vez que entran en el ciclo celular. Estas observaciones demuestran una vez más que NLS3-DLC1 era menos robusto en la inducción de la apoptosis y la atenuación de la progresión del ciclo celular en comparación con el tipo salvaje DLC1.
Discusión
En silico análisis de la secuencia tiene
puesto de manifiesto una serie de aminoácido básico rico potencial NLS bipartita en DLC1 [16]. La presencia de estos motivos nos llevó a preguntar si existe DLC1 como una proteína nuclear. En este estudio, hemos demostrado que DLC1 era una proteína continuamente transportados entre el citoplasma y el núcleo en diferentes líneas celulares. Esta observación proporciona una explicación equilibrada la presencia de DLC1 nuclear y apoya su intrínseca localización citoplasmática como se ha demostrado por diferentes estudios [10], [18], [20], [21], [22]. Es de destacar que en el tratamiento con LMB, adhesión focal DLC1 localizada todavía era detectable. Esta observación sugiere que sólo no específica, DLC1 citoplasmática fue retenido en el núcleo después del tratamiento. De adhesión focal DLC1 localizada era relativamente estática en la naturaleza. Esta observación es compatible con la tinción nuclear parcial observada para el DLC1 de adhesión focal localización mutante defectuoso, Y442F en un modelo de pulmón de células [10]. Aunque la tinción nuclear positiva se pudo encontrar en el hígado no neoplásica normal en la tinción inmunohistoquímica, sería interesante observar si hay una diferencia distinguible de la tinción DLC1 nuclear entre los HCC normales de tejido hepático y DLC1-positivo (o de otros tipos de cáncer).
Aunque la presencia de DLC1 nuclear se ha discutido anteriormente, su actividad supresora de tumores en el núcleo no se ha abordado con claridad. Para investigar directamente la actividad supresora del tumor de la DLC1 nuclear, que forma transitoria o estable expresamos NLS-DLC1 en líneas celulares de HCC, seguido de una serie de caracterización funcional. Se utilizó este enfoque en lugar de estudiar el mutante DLC1 que carecen de la señal de direccionamiento nuclear asignada (600-700 residuos se solapan con el dominio RhoGAP) como predijimos que la eliminación de esta señal podría interrumpir su actividad intrínseca RhoGAP y hacer la comparación con el tipo salvaje DLC1 imposible . Además, el tratamiento a largo plazo LMB para producir DLC1 nuclear también es desfavorable y que bloquea globales de exportación de proteínas nucleares y plantea el estrés de las células [23]. Mientras que la nueva función de DLC1 nuclear que queda por explorar, confirmamos que NLS-DLC1 fue menos eficaz en la supresión del crecimiento de las células, desintegrando la formación de fibras de estrés de actina mediada por RhoA, y la inducción de la muerte celular
in vitro
. NLS-DLC1 también era menos eficaz en la supresión de crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto de ratón. Especulamos mislocalization nuclear puede ser un mecanismo potencial en la actividad de anulación DLC1 en el cáncer humano con la expresión DLC1 intacta.
Funcionalmente, nuestros hallazgos son coherentes con la conclusión hecha por los informes anteriores. Yuan et al. demostrado translocación nuclear de DLC1 puede inducir la apoptosis y facilitar su función supresora tumoral en un modelo expresado transitoriamente DLC1 negativo no pequeñas de cáncer de pulmón de células humanas (CPNM) línea celular [16]. Sin embargo, nuestro modelo de expresión DLC1 nuclear estable con hepatoblastos de ratón y células humanas HEK293T no falló ni en la mejora de la inducción de apoptosis subpoblación como se indica por el análisis de citometría de flujo. explicación plausible incluye la expresión transitoria produce un nivel muy alto de DLC1 que pueden causar toxicidad para las células; mientras que nuestro sistema celular estable puede haber sufrido algún tipo de adaptación durante la selección celular estable, que permite a las células que se propagan con la expresión de DLC1 nuclear. Además, los efectos dependientes de tipo de célula y la línea celular en contribuir a la diferencia en la actividad DLC1 de inducir apoptosis y detención del crecimiento tienen que ser considerados [11], [16], [24]. Por otro lado, Scholz et al han demostrado que DLC1 S327AS431A mutante es incapaz de complejo con 14-3-3 en el citoplasma y es biológicamente más activo que DLC1 de tipo salvaje. Desafortunadamente, los autores encontraron que la introducción de residuos de carga negativa en los sitios antes mencionados no puede imitar la conformación de unión a 14-3-3 constitutivamente activa. La falta de un mutante favorable dificulta la evaluación de cómo estos 14-3-3 vinculante residuos afectan a la sensibilidad de LMB DLC1 [17]. Al asumir el DLC1 S327AS431A es menos probable que se secuestrado en el citoplasma, se puede predecir que este mutante se puede transportó en el núcleo más a menudo. Sin embargo, actualmente se desconoce si la hiperactividad de este mutante es el resultado del aumento de la entrada nuclear de corto plazo o se debe al cambio de conformación que favorece la función DLC1 RhoGAP. Es posible que el aumento de la entrada en el núcleo de un DLC1 hiperactivo biológica puede servir como un mecanismo regulador negativo para regular a la baja la DLC1 hiperactiva en un largo plazo.
Dos estudios independientes han intentado dar a conocer la NLS en DLC1 [16] , [17]. Yuan et al sugirió la DLC1 415-431 es la supuesta NLS, mientras Scholz et al sugieren que el transporte nuclear DLC1 requiere sólo la última mitad del mismo sitio que implica los residuos 428 y 429. Sin embargo, se encontró que los mutantes que carecen de la DLC1 toda propone NLS aún podría ser retenido de manera efectiva en el núcleo, lo que indica secuencia estructural extra en DLC1 puede estar implicada en este transporte nuclear. Para solucionar esto, se realizó un examen detallado localización subcelular de mutantes de deleción de GFP-DLC1. Se encontró que DLC1 Δ292-646 mutante era menos sensible a la LMB. Consistentemente, se encontró que la expresión de fragmentos que representan sólo la región centro de DLC1 mostró localización nuclear. La observación implica que la alteración en ambos extremos de DLC1 puede exponer elementos que están impulsando la localización nuclear de DLC1. A partir de estos datos, aún más proponemos y confirmamos que la región 600 a 700 en el dominio RhoGAP es importante en la dirección de la localización nuclear de DLC1.