Extracto
Antecedentes
El antígeno del cáncer de próstata 3 (
PCA3 /DD3)
gen es un biomarcador altamente específica aumentada en cáncer de próstata (CaP). Con el fin de comprender la importancia de
PCA3
en el CaP se investigó la organización y evolución de la
PCA3
locus del gen.
Métodos /Principales conclusiones
hemos empleado la síntesis de ADNc, RT-PCR y secuenciación de ADN para identificar los 4 nuevos sitios de inicio de la transcripción, sitios de poliadenilación 4 y 2 nuevos exones empalmados diferencialmente en una forma extendida de
PCA3
. Cebadores diseñados a partir de estos nuevos
PCA3
exones mejoran en gran medida la discriminación por motivos de RT-PCR entre metástasis del CP, el PCA y las muestras de HPB. análisis genómicos comparativos demostraron que
PCA3
ha evolucionado recientemente en una orientación antisentido dentro de un segundo gen,
BMCC1 /PRUNE2
. BMCC1 se ha demostrado previamente para interactuar con RhoA y RhoC, determinantes de la transformación celular y la metástasis, respectivamente. El uso de RT-PCR se demostró que cuanto más
BMCC1-1
isoforma - como
PCA3 CD - está regulada positivamente en los tejidos y metástasis ACC como en líneas celulares de CaP. Por otra parte
PCA3
y
BMCC1-1
niveles son sensibles al tratamiento dihidrotestosterona.
Conclusiones /Importancia
La regulación al alza de dos nuevas isoformas de PCA3 en los tejidos con CaP mejora discriminación entre CaP y HPB. La relevancia funcional de esta especificidad es ahora de especial interés dado
de PCA3 asociación superpuestas con un segundo gen
BMCC1
, un regulador de la señalización de Rho. La regulación positiva de
PCA3
y
BMCC1 Hoteles en CaP tiene potencial para mejorar el diagnóstico
Visto:. Clarke AR, Zhao Z, Guo AY, Roper K, L Teng, Fang ZM , et al. (2009) Nueva Estructura Genómica del Cáncer de Próstata PCA3 gen específico dentro BMCC1: Implicaciones para la detección de próstata y progresión del cáncer. PLoS ONE 4 (3): e4995. doi: 10.1371 /journal.pone.0004995
Editor: Baohong Zhang, de la Universidad de Carolina del Este, Estados Unidos de América
Recibido: 11 de noviembre de 2008; Aceptado: 5 Febrero 2009; Publicado: 25 Marzo 2009
Derechos de Autor © 2009 Lavin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La financiación es proporcionada por el Consejo de Investigación médica Nacional de Australia Salud y cáncer y el Consejo de Queensland. Zhongming Zhao es apoyado por una subvención del NIH (LM009598) de la Biblioteca Nacional de Medicina, el Thomas F. y el Fondo Fiduciario Kate Miller Jeffress Memorial, y la Beca de Investigación Institucional GRI-73-001-31 de la Sociedad Americana del Cáncer. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (CaP) es la neoplasia maligna interna más comúnmente diagnosticado en hombres y la segunda causa principal de muertes relacionadas con el cáncer. La etiología del CaP es incierto con factores ambientales, hormonales y hereditarios implicados. El inicio de la PCA (es decir. La formación de una lesión histológicamente identificable) es un evento común, su detección en series de autopsias en casi un tercio de los hombres mayores de 45 años [1]. Afortunadamente, la mayoría de estas lesiones no progresan a tumores clínicamente significativos. Sin embargo, en pacientes con enfermedad clínicamente detectado y que se considera que tienen su tumor localizado en la próstata, entre el 15% y el 40% de tener enfermedad diseminada, no puede ser identificada por métodos de imagen actuales, para los que hay actualmente ningún tratamiento curativo. Un diagnóstico de cáncer de próstata (a partir de biopsias de próstata) se inicia típicamente después de una elevación en mediciones en suero de antígeno específico de la próstata (PSA), una proteína secretada normalmente específicamente por las células epiteliales de la próstata para formar un componente de la eyaculación. PSA no es una prueba para el cáncer y no hay un nivel de umbral de esta enzima que proporciona una alta sensibilidad y especificidad con un continuo de riesgo para todos los valores de PSA [2]. Un PSA sérico tan a menudo comete hombres al procedimiento invasivo e impreciso de la ecografía transrectal (ETR) biopsias guiadas [3], [4]. Un auto de procesamiento adicional de las limitaciones del PSA en la detección de CaP es la disparidad entre los resultados de la biopsia ETR y los de la prostatectomía radical con la primera bajo-llamando a la patología [5].
Para mejorar la detección y el tratamiento del CaP, las investigaciones tienen estado en curso para identificar los genes implicados en la iniciación y progresión de la enfermedad. Los factores hereditarios son considerados para jugar un papel más importante en la génesis de CaP que en cualquier otro cáncer. Los estudios de asociación genómica a escala y pantallas de genes candidatos indican que la herencia implica múltiples asociaciones pequeñas que la gran mayoría de los cuales siguen siendo desconocidos, además de, posiblemente, complejos epigenéticos o interacciones gen-gen. [6] - [12]. la tecnología de visualización diferencial ha sido utilizado con éxito para identificar los cambios en el nivel de expresión de genes asociados con la transición de normal a tumor, que incluyen genes implicados en la señalización de lípidos y el metabolismo; la síntesis de ácidos grasos; la regulación del ciclo celular; la adhesión celular y la regulación del estroma; angiogénesis; regulación canal iónico, y de transducción de señales [13], [14]. Por medio de Visualización Bussemakers diferenciales et al [15] identificó un ADNc, posteriormente llamado antígeno de cáncer de próstata 3 (
PCA3 /DD3
), que se upregulated en 53 de 56 cánceres de próstata en comparación con el tejido de próstata no maligno. La
PCA3
gen (25 kb - figura 1A), que está empalmada diferencialmente, tiene una alta frecuencia de codones de terminación en todos los marcos de lectura que sugirió que era un ARN no codificante (ncRNA). Además, no había pruebas para la expresión de una proteína de PCA3 [16]. Upregulation de los principales ~ 2 kb
PCA3
transcripción, que excluye el exón 2 (Fig 1A), ha demostrado ser un marcador sensible y específico para el diagnóstico de CaP [15], [16]. La expresión de los transcritos poliadenilados de
PCA3
sugerido que puede tener un papel funcional que se apoya en cierta medida por su localización en el núcleo y el fracaso para ser detectado en el citoplasma [16]. Hasta la fecha ningún papel en el cáncer se ha descrito para
PCA3
pero se ha sugerido que puede funcionar en la regulación de la expresión génica o participar en empalme de genes [16]. ncRNAs se han encontrado recientemente en abundancia sorprendente, con nuevas clases y roles inesperados que median la evolución, la organización de dominios cromosómicas, remodelación de la cromatina y la regulación transcripcional (tanto la activación y supresión) [17], [18]. Además de
PCA3
, las comparaciones entre hipoplasia benigna de próstata (HBP) y las muestras de CaP mostraron 14 de los otros 51 ncRNAs que son expresados diferencialmente también se upregulated en el CaP [19], [20]. También está bien establecido que una clase de muy pequeño ncRNAs conocido como microRNAs se alteran en diferentes tipos de tumores y puede actuar como oncogenes o genes supresores de tumores [19], [21], [22].
(A ) parcial
PCA3
estructura genética como se informó originalmente por Bussemakers et al. [15] con 4 exones (cajas abiertas ~ no a escala) con corte y empalme alternativo del exón 2 y tres sitios de terminación de la transcripción alternativos en el exón 4. 5 'RACE experimentos (Fig complementario. S1) identificaron 4 novela
PCA3
sitios de iniciación de la transcripción (isoformas 1-4 marcados por flechas verticales que apuntan hacia abajo con la secuencia de nucleótidos por debajo de 1.150 pb situado, 699 pb, 640 pb y 136 pb aguas arriba del sitio de inicio original (renombrado aquí isoforma 5). 3 'RACE identificó cuatro novela de poliadenilación sitios (7 en total) * situados en el exón 4. el tamaño del exón 1 se expande desde el original de 120 pb a 1270 pb. isoforma 4 (
PCA3-4
) es la más alta expresión de la novela de cuatro isoformas. Cuatro ORF superpuestos inician desde el sitio de inicio una única 'ATG' (flecha vertical hacia arriba) dentro de
PCA3-4
y terminar dentro de uno de los exones empalmados alternativamente (2a o 2b o 2c) o en el exón 3 . (B) amplificación por RT-PCR de la HBP, el CP y las muestras de metástasis CaP usando un cebador directo desde el interior de la novela
PCA3-4
la transcripción sitio web inicial y un cebador inverso de la novela exón 2a. (C) Estructura completa de la
PCA3
gen. El sombreado identifica las regiones recientemente identificados de la
PCA3
gen que tiene 6 exones con splicing alternativo del exón 2a (93 pb) y 2b exón (93 pb) y 2c exón (exón 2 original, 165 pb). y (D) la amplificación RT-PCR de PCA3 usando el mismo cebador directo y un cebador inverso de la novela 2b exón y amplificación (E) RT-PCR de PCA3 usando un cebador directo de
PCA3-5F
(dentro de la la transcripción original de sitio de inicio) y un cebador inverso que abarca los exones 1 y 3 [15].
con el fin de entender mejor la importancia de la
PCA3
gen en el CaP se realizó un mayor investigación detallada de este gen y su locus cromosómico. La presente investigación apunta a una unidad transcripcional considerablemente más complejo para
PCA3
que lo reportado por primera vez [15], [16] incluyendo los exones novedosos adicionales. Describimos una serie de novela
PCA3
variantes de empalme con la expresión más específica en los tejidos y metástasis CaP. También demuestran que
PCA3
está incrustado en el intrón de un segundo gen,
BMCC1
, un gen implicado en el control de la transformación oncogénica [23] y que ambos genes mostraron una mayor expresión en el CP y metástasis .
resultados
identificación de nuevas transcripciones de PCA3 y la experiencia en el CP
La ausencia de un elemento caja TATA dentro de un promotor del gen humano se ha asociado con la iniciación de la transcripción promiscua. El
PCA3
gen no contiene una secuencia TATA aguas arriba y era, por tanto, de interés para determinar si existían sitios adicionales para la iniciación de la transcripción
PCA3 gratis (Figura 1A, parte superior). Hemos llevado a cabo 5 'RACE utilizando tejido CaP expresando
PCA3
que debe buscar sitios de inicio adicionales.
Este enfoque demostró que el exón 1 es 1.150 pb más largo que se informó anteriormente (ahora 1.270 pb) y contiene 4 nuevos sitios de inicio de la transcripción (figura complementario S1 & amp;. Fig. 1A, parte baja). Estos sitios de inicio de transcripción se encuentran novela 1150, 699, 640 y 136 pb (denominada
PCA3
isoformas 1-4, respectivamente) aguas arriba del sitio de inicio ya se ha informado de
PCA3
[15]. La transcripción original se denomina aquí como
PCA3
isoforma 5 (
PCA3-5
). La presencia de estos transcritos más largos en los tumores estaba inversamente relacionada con la transcripción de longitud (resultados no mostrados). La transcripción de la novela sitio de iniciación de 4 (
PCA3-4
), yuxtapuesto inmediatamente aguas abajo de la región que contiene el FP2 3
SRY
sitios de unión de consenso (Complementario. Fig S2), fue significativamente mayor en comparación con los otros tres sitios de iniciación aguas arriba como se juzga por qPCR (resultados no mostrados). Transcripción del sitio de iniciación de 1 (
PCA3-1
) fue detectado por 5 'RACE en sólo unas pocas muestras.
Hemos llevado a cabo 3' RACE para investigar cualquier complejidad adicional en el extremo 3 ' de la transcripción. Cuatro sitios de poliadenilación adicionales fueron detectados utilizando 3 'RACE con lo que el número total de sitios de poliadenilación a siete, situado en los nucleótidos 411, 542, 873, 1583, 1600, 2146 y 3545, respectivamente, en el exón 4 (fig. 1A, parte inferior). De los 4 sitios de poliadenilación adicionales, sólo dos se asociaron con secuencias señal de poliadenilación AATAAA definido, y ATTAAA respectivamente. Hemos observado que un cebador directo basado en la nueva secuencia (
PCA3-4)
junto con un cebador inverso para el exón 2 amplificados de manera muy eficiente
PCA3
en CaP (7/8) y las metástasis muestras (7/8), pero no para detectar
PCA3 Hoteles en muestras de HPB (0/8) (figura 1B). La información clínica en estos pacientes se proporciona en el cuadro complementario S1. Estos cebadores no sólo amplifican un fragmento de ADNc del tamaño esperado (265 pb) pero también 2 superior bandas de tamaño molecular en algunas muestras (Fig 1B, complementario. Fig S3). Las bandas adicionales se escindieron del gel y se secuenciaron para revelar la presencia de 2 novela
PCA3
exones ambos 93 pb de tamaño (Fig 1C). Estos dos exones empalmados diferencialmente (2a y 2b), que tienen sitios de corte y empalme consenso de buena fe en sus extremos había confirmado su expresión mediante amplificación por RT-PCR utilizando cebadores específicos de exón novela La amplificación de
PCA3
usando el cebador PCA3-4F junto con un cebador correspondiente al exón 2a detectaron 5/8 y 4/8 CaP metastásico muestras y excelente proporcionado de nuevo la discriminación con la HPB (figura 1D). Resultados similares se demostraron mediante PCA3-4F y un cebador inverso para el exón 2b (resultados no mostrados). Esto mejora en el uso de el conjunto de cebadores original, empleado por Bussenmakers et al [15], que también detecta una señal menos intensa en la mayoría de los casos de BPH como es evidente a partir de los datos obtenidos aquí (Fig. 1E). La identificación de los exones 2a y 2b trae a 6 el número total de
PCA3
exones (Fig. 1C). Estos datos indican que múltiples transcripciones novela de
¿Cuáles son PCA3 expresados diferencialmente en el CaP.
análisis de la secuencia de nucleótidos identificada cuatro putativo ORFs que inician a partir de una sola ATG localizados 54 nucleótidos dentro de la novela
PCA3- 4
isoforma (figura 1A, parte inferior). La primera de ellas, de 70 aminoácidos (aa) de longitud, se extendió a través de los exones 1 y 4 bis en una novela exón 2a. La segunda, el 82 aa de longitud, se extendió a través de exón 1, se saltó el exón 2 bis, y se extendió 16 bis en el exón 2b. La tercera, el 76 aa de longitud, también se extendió a través de exón 1, omiten exones 2a y 2b y ampliado en 10 aa 2c exón. La cuarta, 73 aa de longitud, se extiende también a través de exón 1, omiten exones 2a y 2b y 2c y extendió 7 bis en el exón 3. Estos ORFs inician 83 nucleótidos aguas arriba de la transcripción original (
PCA3-5
) descrito por Bussemakers et al. [15] y no podría haber sido predicho en los análisis anteriores de la transcripción original, que no se identificó ningún ORF significativos. Será de interés para determinar si estos ORFs código para las proteínas.
PCA3
está incrustado dentro del intrón 6 de la
BMCC1
gen
Para entender mejor la estrecha correlación entre
PCA3
los niveles de expresión de genes y el cáncer de próstata se investigó la evolución y organización de la
PCA3
locus del gen (figura 2A). Se utilizó el
PCA3
secuencia de ARNm (3923 pb, AF103907) para buscar secuencias homólogas en otros genomas. Utilizando un punto de corte E-valor & lt; 1 × 10
-4 en la búsqueda BLAST, se encontraron importantes éxitos sólo en los genomas de mamíferos. Exon 4 es la región más conservada del gen. Un segmento (403 pb) en el exón 4 se encontró en todos los genomas de mamíferos disponibles (evolutivo conservado de región (ECR_ex4c arrowed 'B' en las Figuras 2B y 3A & amp;. 3B) de este segmento, junto con el humano
PCA3
secuencia del gen, se utilizó para extraer las secuencias genómicas para
PCA3
homólogos en otras especies. Como resultado, se obtuvo humano
PCA3
homólogos en 14 mamíferos, incluyendo los 4 primates no humanos .
(A) el
PCA3
gen (arriba) está incrustado en el intrón 6 de
BMCC1 gratis (
PRUNE2
) isoforma 1 (
BMCC1-1
). cajas grises indican los exones de
BMCC1 Opiniones y cajas negras indican los exones de
PCA3.
los dos genes están en la orientación opuesta (NCBI Build 36). Tres otras isoformas de
BMCC1
también han sido descritos, ninguno de los cuales incluyen el conjunto completo de los exones presentes en
BMCC1-1
. (B) VISTA parcela de
BMCC1
gen . alturas de pico indican el grado de conservación entre especies de exones (azul) y las regiones conservadas evolutivos (ECR dentro de intrones - rosa) en comparación con el humano. Tenga en cuenta que la orientación de genes es diferente en la figura 2A, los paneles superior e inferior. Se estimó la tasa de mutación en la secuencia de ADN mediante la comparación de las secuencias de humanos y chimpancés y utilizando un tiempo de divergencia de 6 millones de años (MYR). La tasa de mutación en el
PCA3
gen se estimó en 1,26 × 10
-9 por nucleótido por año, superior a la (1.00 × 10
-9 por nucleótido por año) en la no -
PCA3
parte de la
BMCC1
gen, lo que sugiere la
PCA3
región podría tener una tasa de mutación moderadamente alto. Tres ECR altamente conservados dentro de
¿Cuáles son BMCC1 flechas (A, B & amp; C); Flecha "A '(ECR_in1, 277 pb) es una secuencia no codificante extremadamente conservada con 91% de similitud entre humanos y zarigüeya que se coloca dentro del intrón 1 de
PCA3
; Flecha "B" (ECR_ex4c, 403 pb) una ECR posicionado dentro de
PCA3
exón 4, que se conserva en todos los mamíferos y parece haber sido el punto focal de la evolución lineal de la
PCA3
gen (véase Fig. 3); Flecha "C" (361 pb) es el más altamente conservadas ECR (una secuencia no codificante conservada con un 99% de similitud entre el ser humano y la zarigüeya) dentro de
BMCC1 gratis (intrón 6) inmediatamente aguas abajo de
PCA3
.
Dos secuencias de ARNm (AB050197 y BC019095) fueron anotados inicialmente aguas arriba y aguas abajo de
PCA3
. Estas dos secuencias de mRNA fueron recientemente se fusionaron y anotados como dos isoformas de la
BMCC1
gen (también llamado
PRUNE2
, NCBI Gene ID: 158471). De acuerdo con estos lugares de mapeo, el
PCA3
gen está localizado en el intrón 6 de la más larga
BMCC1
isoforma 1 (
BMCC1-1
). Para confirmar esto se realizaron búsquedas de
PCA3
secuencias en el genoma humano y en otros lugares obtenidos sólo un golpe que hace corresponder exactamente a la
BMCC1
locus del gen. El gen
BMCC1
es ~295 kb de longitud y tiene una orientación opuesta al gen
PCA3
. Estudios recientes indican que la expresión
BMCC1
procesamiento es más complejo de lo que se pensaba inicialmente, y comprende cuatro isoformas variantes que no fueron anotados por completo en NCBI (Build 36.2). Higo. 2A ilustra la relación estructural entre el
PCA3 Opiniones y
BMCC1
genes.
BMCC1
isoforma-2 (
BMCC1-2 /PRUNE2-2
/BC019095 /NM_138818) comprende los 6 primeros exones del
BMCC1
como anotada en NCBI (Build 36.2) .
BMCC1-2
termina inmediatamente aguas arriba de la
PCA3
gen. Isoforma-3 (
BMCC1-3 /BMCC1
/ABO50197) reportado por Machida et al. [23] no se solapa
BMCC1-2
sino que comprende 13 exones distintos (exones 7-19) situado inmediatamente aguas abajo de
PCA3
. El sitio de iniciación de la transcripción para la isoforma-4 (
BMCC1-4
/KIAA0367 /BNIPXL /AY43213) reportado por Soh y baja [24] se encuentra todavía más aguas abajo dentro del segundo exón del
BMCC1-3
. Isoforma-1 (
BMCC1-1 /PRUNE2-1
/NM_015225), por otro lado, es un conjunto de genes de referencia generada computacionalmente reciente que comprende los 19 exones (NM_015225) derivados de la fusión de
BMCC1-2
y
BMCC1-3 Opiniones y que tenía, hasta ahora, carecían de apoyo transcripción completa. Aquí hemos utilizado RT-PCR primers que abarca
BMCC1-2
y
BMCC1-3 gratis (Fig. 2A) y el análisis de la secuencia de nucleótidos (resultados no mostrados) para verificar la existencia de la
BMCC1-1 Versión taquigráfica y confirmó su expresión en tejidos de CaP (Ver Fig. 4A). El mayor tamaño de
BMCC1-1
también es consistente con el transcrito de ARNm ~ 12 kb identificado por Machida et al. [23].
PCA3
localiza dentro del intrón 6 (~110 kb) de
BMCC1-1
.
PCA3
representa aproximadamente 25 kb de este intrón pero es en la orientación opuesta a
BMCC1
. Tres de las isoformas de la proteína BMCC1 BMCC1-1 (3088 aa - NM_015225), BMCC1-3 (2724 aa) [23] y BMCC1-4 (769 bis) [24] están codificadas con diferentes sitios de inicio, sin embargo, los tres son in- marco y contiene el BCH aguas abajo de dominio de codificación.
(A) Vista parcela donde se presentan las estructuras conservadas de la
gen PCA3
. Sólo los primates parecen tener una completa
gen PCA3
. Las dos regiones conservadas evolutivos compartidos por
BMCC1
y
PCA3 gratis (véase la Fig. 2B)
están arrowed
(flecha A ~ ECR_ex4c y flecha B ~ ECR_in1). Ambos ECR aparecen conservadas en los mamíferos (identidad & gt; 90%). ECR_in1 también está presente en este sitio en el pollo y el lagarto, pero no en el pescado, rana, o invertebrados. (B) ECR_ex4c aparece focal a la estructura en evolución lineal de
PCA3
. (C) Resumen de los mamíferos
PCA3
exones compartiendo alta en comparación con la conservación humana. La anotación estructura de genes se basa en Bussemakers et al. [15]. El nivel de conservación de los
PCA3
exones durante el curso de la evolución de los mamíferos aumenta 3 '→ 5' basado en la presencia de las ECR significativas en cada exón. La identidad de la secuencia exacta para el exón completo entre humanos y otras especies se muestra en el cuadro complementario S2. Es importante tener en cuenta que ninguna de ECR
PCA3
exones se encuentra en cualquiera de las especies no mamíferas en este análisis.
ADNc se preparó a partir de muestras de tejido de pacientes incluidos ocho HPB, CP o metástasis CaP, respectivamente, para su uso en las siguientes reacciones de PCR. (UN). RT-PCR llevada a cabo en la HPB, el CP y metástasis (MET) con diferentes conjuntos de cebadores para
PCA3 Opiniones y BMCC1 Alta fila;
BMCC1-2
RT-PCR utilizando un cebador directo para
BMCC1
exón 5 (BMCC1-Ex5F) y un cebador inverso específico para la forma extendida del exón 6 (BMCC1-Ex7R) única para
BMCC1-2
segunda fila;
BMCC1-1
específica de RT-PCR utilizando cebadores para
BMCC1
exón 6 (BMCC1-Ex6F) y el exón 7 (BMCC1-Ex7R). 3ª fila;
BMCC1
-BCH región específica de RT-PCR utilizando cebadores BCHF y BCHR. 4ª fila;
PCA3
fue amplificado (35 ciclos) con cebadores específicos para
PCA3
isoforma 5 exón 1 (PCA3-5F y el cebador EX1 /3R). 5
ª fila; β
Control 2microglobulin PCR (B). El análisis comparativo de expresión de RT-PCR de
PCA3
,
BMCC1-1
y el
BMCC1
-BCH región de líneas de cáncer de ALVA41, DU145, LNCaP y PC3 de próstata, un RPWE1 línea de células normales de la próstata, JHP una línea celular linfoblastoide control, RM654 una línea celular linfoblastoide de un paciente con AOA2 y MCF7 una línea celular de cáncer de mama. RT-PCR se llevó a cabo con el cebador conjuntos específicos para
PCA3
isoforma 5 (PCA3-5F) y Exon 1/3 (Ex1 /3R) y para
BMCC1-1
y la
BMCC1
región -BCH como se ha indicado anteriormente. (C) Análisis PCR semi-cuantitativa de
PCA3
y
BMCC1-1
expresión en la línea celular LNCaP en respuesta a la dihidrotestosterona. Los resultados fueron normalizados con relación a los niveles de β
2microglobulin. Cuatro cultivos de células se mueren de inanición de suero durante 2 días antes de la incubación con dihidrotestosterona (g /ml). Los resultados fueron normalizados y expresan como media veces mayor en relación con el nivel de expresión antes del tratamiento. Las barras de error son desviaciones estándar y los valores de p se determinaron a partir de la comparación con las muestras no tratadas utilizando la prueba t de Student.
tiene el gen BMCC1 estado bajo selección?
Desde
PCA3
está incrustado o anidada dentro de
BMCC1
era de interés para estudiar los cambios evolutivos en este gen. BLAST búsquedas revelaron que
BMCC1
homólogos están presentes en los mamíferos, el pollo y el lagarto, pero no en la rana africana, peces o invertebrados (Figura 2B). Se utilizó el software VISTA aplicar la alineación global de la
BMCC1
genes homólogos. La alineación en la figura 2B demuestra que
BMCC1
sólo se conserva de humano a perro /ratón con la excepción de un número de muy conservadas ECR que se extienden de humano a Lizard (incluyendo aquellos con flecha A y C en la Fig. 2B ).
Estos ECR se encuentra en gran medida entre los
BMCC1
intrón 6 y el exón 9 (incluyendo dentro de
PCA3
). Se compararon las secuencias de aminoácidos basado en humanos y chimpancés
BMCC1-1
CDS secuencias. La longitud total de aminoácidos es de 3088 (humano) y 3089 (chimpancé). Después de que se suman secuencias de humanos y chimpancés, encontramos 40 mutaciones no sinónimas y 21 mutaciones sinónimas. Para toda la región, la proporción de no sinónimo más sinónimo tasa de sustitución (dN /dS) es 0,90. Una relación de dN /dS mayor que 1 en una región de codificación a menudo sugiere la selección positiva. Exón 8 es el exón más largo de
BMCC1
y tiene 6598 pb, que codifica 2199 aminoácidos. Nos pareció que la mayoría de las mutaciones no sinónimas son en el exón 8 y el número de mutaciones no sinónimas [25] es casi tres veces la de la sinónimo mutaciones [12]. La relación dN /dS fue de 1,38, lo que sugiere una selección positiva reciente en esta subregión. Por otra parte, se encontró que 39 de las 40 sustituciones no sinónimas en el gen
BMCC1
estaban en los exones 8 y 9, que tenía sólo 14 sustituciones sinónimas. Sólo había una sustitución, que es sinónimo, en el exón 7. Cuando examinamos los exones 8-9 o exones 7-9, encontramos consistentemente que la relación dN /dS era mayor que 1 (exones 8-9, 1.30; exones 7 -9, 1,22), lo que sugiere una selección positiva en la región vecina de
PCA3
.
PCA3
surgió en los mamíferos y, recientemente, ha evolucionado en los primates
PCA3
no está tan bien conservada en los mamíferos como
BMCC1 Opiniones y no fue detectado anteriormente en roedores [15]. Para determinar el origen de
PCA3
comparamos
PCA3
secuencias de genes entre especies. Se realizó un alineamiento global de los 15 mamíferos
PCA3
ortólogos. Higo. 3A muestra una parcela VISTA de las regiones conservadas dentro de la
PCA3
región del gen. Una parcela VISTA más detallada se centra en
PCA3
exones 2-4 se proporciona en la figura. 3B. Como se ha descrito, el
PCA3
gen está altamente conservada en los primates. Por ejemplo, cuando se compara con el humano
PCA3
secuencia, las cuatro secuencias de exón y la mayoría de las secuencias de intrones en los cuatro primates tienen alta identidad con humano (Fig. 3A).
Comparación de conservación de la secuencia entre estas 15 mamíferos, reveló un patrón lineal de cambio en relación con estos cuatro exones durante el curso de la evolución de los mamíferos. Exon 4 es de lejos el más grande exón (3454 pb) y con fines comparativos exón 4 se dividió (5 '→ 3') en 3 regiones [a, b y c que corresponden a los tres sitios de terminación descritos por Bussemakers et al. [15]. ECR_ex4c, el segmento conservado de 4c exón descrito anteriormente (flecha "B" en la Fig. 2B y Fig. 3) aparece en los 15 mamíferos, incluyendo la zarigüeya, que es un grupo de fuera de los 14 euterios. Mientras zarigüeya tiene sólo éste región conservada con respecto a la 4
PCA3
exones, los roedores tener 1-2 pequeñas ECRs adicionales en el exón 4b (Fig. 3A y 3B). Exón 4a apareció por primera vez en el conejo. Exón 3 se detectó en elefante, musaraña de árbol, vaca, perro, cerdo, caballo, y en todos los primates, pero no en conejos, roedores, o zarigüeya. De acuerdo con la trama VISTA un exón significativa 2 sólo está presente en cerdo, caballo y todos los primates (Fig. 3B).
Finalmente, el exón 1 está presente en los primates solamente (Fig. 3A). Este patrón de evolución lineal de la formación de genes se resume en la Fig. 3C donde los resultados sugieren que: (1) vestigios de la
PCA3
gen surgió en los mamíferos; (2) estos vestigios fueron sometidos posteriormente a un patrón lineal de la evolución: el exón 4c 4c → exón /exón 4b 4c → /4b /4a → exones 4/3 → exones 4/3/2 → exones 4/3/2/1; y (3)
PCA3
parece madurar en los primates con los cuales comparten una dotación completa de los exones (Fig. 3C). La identidad de la secuencia exacta de cada uno de los humano completo
PCA3
exones en comparación con otras especies se muestra en el cuadro complementario S2.
BMCC1 está regulada positivamente en el CaP y andrógenos inducibles
Desde
PCA3
está regulada al alza en el CaP y puesto que hemos demostrado aquí que este gen está incrustado en un segundo gen
BMCC1
, implicado en la proliferación celular, se determinó si
BMCC1
fue también diferencialmente regulada en el CaP. Se utilizó un conjunto de cebadores de RT-PCR que abarcan la región de la
BMCC1
gen (exones 6 y 7), específico para los de larga duración
BMCC1-1 Versión taquigráfica. La expresión de
BMCC1-1
fue evidente en las muestras de la próstata y la BPH normales y se reguló en el CaP y metástasis (Figura 4A,. Complementario figura S4). Esto se confirmó usando los cebadores correspondientes a la región BCH C-terminal de BMCC1 y para BMCC1-2. De hecho amplificación de esta isoforma dio una mejor discriminación entre PCa y la BPH (Fig. 4A, panel superior). La extensión de estos experimentos para CaP y otras líneas de células reveló que ambos genes fueron altamente expresado, específicamente en la línea celular de CaP LNCaP (Fig. 4B). Además
BMCC1-1
se detectó en una segunda línea de células de CaP DU145 pero a niveles más bajos.
PCA3
también se expresa en DU145, pero requiere nuevas rondas de amplificación para la detección. Los
BMCC1
isoformas más cortas (
BMCC1-3
y /o
BMCC1-4
) también fueron detectados (utilizando cebadores específicos para la región BCH) en un transformadas con EBV la línea celular linfoblastoide (JHP), pero cuanto más
BMCC1-1
isoforma no se detectó (figura 4B). Los datos previos han demostrado que el nivel de
PCA3
puede ser inducida en células LNCaP después del tratamiento con la dihidrotestosterona, que imita los efectos de la unión del receptor de andrógenos (DHT) [16]. Determinamos si
BMCC1-1
también era sensible a la inducción hormonal. Los resultados en la Fig. 4C demostrar que ambos
PCA3
y
BMCC1
son inducidos al máximo en la línea celular LNCaP a una concentración de 0,5 mM DHT.
Discusión
Tenemos revela aquí una serie de nuevos hallazgos para la
PCA3
biomarcador de genes que se upregulated dramáticamente en CaP. Bussemakers et al. [15] habían demostrado previamente que
PCA3
consistía en 4 exones y que diferentes transcripciones surgieron debido al corte y empalme alternativo del exón 2 y la presencia de 3 sitios de poliadenilación en el exón 4. Nuestros datos revelan que la unidad transcripcional para
PCA3
es considerablemente más complejo que esto. Además del sitio de inicio de la transcripción informado por Bussemakers et al. [15] que se han identificado 4 sitios de inicio de la transcripción adicionales que se extienden aguas arriba en más de 1 kb que aumenta el tamaño del exón 1 a 1,27 kb. Las transcripciones que inician en estos nuevos sitios se expresan diferencialmente con la isoforma más corta 4 (
PCA3-4
) más altamente expresado en el CaP y metástasis. Schalken et al. [16] estableció que un fragmento de 500 pb inmediatamente aguas arriba del sitio de inicio de transcripción originales (que se describe aquí como
PCA3-5
) tiene todos los sitios activadoras y represoras críticos para conducir
PCA3
expresión . Nuestra descripción adicional
PCA3
Principal sitios más aguas arriba de las dos isoformas más cortas (
PCA3-4
y
PCA3-5
) está contenido dentro de un transcriptoma más grande y que es probable que existan otros elementos de control en una fase previa. Esta disposición del transcriptoma no es novedoso como muchos genes están dispuestos en patrones superpuestos y entrelazados complejos en genomas eucariotas [26]. En ese informe, sin pasar por los mecanismos se invocan para su procesamiento en el extremo 3 'de la transcripción. Esto también puede ser el caso en el extremo 5 '. También describimos 2 nuevos exones empalmados diferencialmente (exones 2a y 2b) para
PCA3
que se encuentra entre el exón 1 y el exón original de 2 (2c ahora exón) [15]. [dieciséis]. [dieciséis].