Extracto
La quimioterapia citotóxica del cáncer está limitado por algunas veces mortales, efectos secundarios graves, que surgen de la toxicidad para las células normales sensibles debido a que las terapias no son selectivas para las células malignas. Entonces, ¿cómo se pueden mejorar de forma selectiva? formulaciones farmacéuticas alternativas de agentes contra el cáncer se han investigado con el fin de mejorar el tratamiento de la quimioterapia convencional. Estas formulaciones se asocian con problemas como graves efectos secundarios tóxicos en los órganos sanos, resistencia a los medicamentos y el acceso limitado del fármaco a los sitios tumorales sugerido la necesidad de centrarse en los sistemas de suministro de medicamentos controlados específicas del sitio. En respuesta a estas preocupaciones, hemos desarrollado un nuevo sistema de administración de fármacos basado en los eritrocitos magnéticos de ingeniería con una proteína de fusión pico viral. Este nuevo sistema de administración de fármacos a base de eritrocitos tiene el potencial para la localización magnética controlada específica de sitio y la capacidad de fusión altamente eficiente con las células diana. Aquí nos muestran que el sistema de administración de fármacos virosomas eritro-magneto-HA es capaz de unir y fusionar con las células diana y liberar de manera eficiente los compuestos terapéuticos dentro de las células. La eficacia del fármaco contra el cáncer empleado se incrementa y la dosis requerida es 10 veces menor que la necesaria con la terapia convencional
Visto:. Cinti C, M Taranta, Naldi I, S Grimaldi (2011) de nuevo diseño Los eritrocitos magnéticos para sostenida y selectiva de entrega de la lucha contra el cáncer compuestos terapéuticos. PLoS ONE 6 (2): e17132. doi: 10.1371 /journal.pone.0017132
Editor: Steven Ellis, de la Universidad de Louisville, Estados Unidos de América
Recibido: 12 Octubre, 2010; Aceptado: January 21, 2011; Publicado: 23 Febrero 2011
Derechos de Autor © 2011 Cinti et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El éxito de cualquier tratamiento médico no depende únicamente la farmacocinética /farmacodinámica actividad del agente terapéutico, pero en gran medida, de su biodisponibilidad en el sitio de acción en el sistema humano [1] - [4]. En el pasado, las formulaciones farmacéuticas alternativas de agentes contra el cáncer se han investigado con el fin de mejorar el tratamiento de la quimioterapia convencional. En tableta oral terapia /corriente convencional, cápsulas y formulaciones inyectables se utilizan para la entrega fármacos contra el cáncer. Estas formulaciones se asocian con problemas como graves efectos secundarios tóxicos en los órganos sanos, dificultades en la administración clínica, resistencia a los medicamentos y el acceso limitado de la droga a los sitios tumorales sugieren la necesidad de centrarse en los sistemas de administración de fármacos controlados específicas del sitio.
sistemas de administración de fármacos (DDS), tales como las nanopartículas de lípidos o basadas en polímeros han sido diseñados para mejorar las propiedades farmacológicas y terapéuticas de los fármacos administrados por vía parenteral. La mayoría de la DDS aprobado actualmente para la administración parenteral cae en la categoría de liposomal o formulaciones basadas en lípidos o moléculas terapéuticas vinculadas a polietilenglicol (PEG) [5] - [7]. Aunque la solubilidad del fármaco puede no ser un factor limitante para sistemas tales como conjugados de polímero-fármaco, en el que el fármaco está unido químicamente al soporte, puede ser una consideración importante en liposomal DDS. La capacidad de carga de los liposomas no es eficiente para grandes moléculas terapéuticas tales como proteínas, en particular cuando los diámetros de liposomas pequeños son deseables por razones de biodistribución. nano Biodegradable /micropartículas de poli (D, L-lactida-co-glicolida) (PLGA) y polímeros basados en PLGA son ampliamente explorado como vehículos para la entrega controlada de agentes terapéuticos macromoleculares, tales como proteínas, péptidos, vacunas, genes, antígenos y factores de crecimiento . Literatura cita muchas ventajas y los inconvenientes de PLGA y sistemas de entrega basados en PLGA para la administración de fármacos macromoleculares [8], [9]. encapsulación de fármacos, tamaño de partícula, aditivos añadidos durante la formulación, el peso molecular, la relación de lactida a glicólido restos de PLGA y morfología de la superficie podría influir en las características de liberación [10]. PLGA tiene un efecto negativo en la estabilidad de la proteína durante la preparación y almacenamiento, debido principalmente a la naturaleza catalizada por ácido de su degradación [11]. Además, las condiciones de elaboración utilizadas en la fabricación de vehículos de administración de fármacos de PLGA tienen efectos perjudiciales sobre ciertas estructuras secundarias de proteínas [12].
En los últimos años, los sistemas de entrega basados en células también se han desarrollado. El uso de células como vehículos terapéuticos se ha desarrollado como un concepto distinto y método de entrega [13] - [17]. vehículos basados en células son particularmente atractivos para el suministro de agentes bio-terapéutica que son difíciles de sintetizar, han reducido la vida media, la penetración del tejido limitada o se inactivan rápidamente al
in vivo
introducción directa. Como cuestión de hechos, el sistema de entrega basado en células posee una serie de ventajas, incluyendo los tiempos de entrega prolongados, la orientación de las drogas en los diferentes compartimentos celulares especializados y biocompatibilidad. El uso de un portador fisiológico para entregar agentes terapéuticos en todo el cuerpo, tanto para mejorar su eficacia y reducir al mínimo los efectos secundarios adversos inevitables, es una perspectiva atractiva que se puede aplicar en muchos entornos clínicos. El comportamiento de las células de la sangre, como un sistema de suministro para varias clases de moléculas (es decir, las proteínas, incluyendo enzimas y péptidos, agentes terapéuticos en forma de análogos de nucleótidos, análogos de glucocorticoides), se ha estudiado ampliamente ya que poseen varias propiedades, que hacen ellos portadores únicas y útiles [18] - [20]. En el contexto de la farmacoterapia extracorpórea, el enfoque más prometedor es el uso de autoerythrocytes que poseen características morfológicas y fisiológicas únicas. Aplicación de eritrocitos como recipientes para diversos fármacos disminuye el riesgo de efectos secundarios y reacciones inmunes patológicas contra agentes encapsulados y, por otra parte, permite la modificación de su propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas de la reducción de dosis y los intervalos entre ellos. La eficacia y la seguridad de los agentes farmacéuticos introducidos en los eritrocitos se han confirmado en numerosas
in vivo
estudios [20]. Los eritrocitos magnéticos, resultantes de la co-encapsulación de los fármacos con algunos ferrofluidos tales como cobalto-ferrita y magnetita, se han reportado para dirigir el fármaco encapsulado predominantemente a los sitios deseados del cuerpo por medio de un campo magnético externo [21] - [23]. La aplicación de ondas de ultrasonido en la región donde los eritrocitos magnéticas se acumulan puede inducir la destrucción del vehículo y la liberación de un fármaco en el órgano o tejido nivel [24], [25]. Además de la orientación de drogas, este método ha sido evaluado para la inducción de la isquemia local en los tumores, que por lo tanto puede ayudar a promover la remisión del tumor debido a la reducción del flujo sanguíneo local [22]. Sin embargo, la capacidad potencial de las empresas de telefonía celular para proporcionar una entrega específica de sitio o dirigida de agentes terapéuticos aún no se ha explorado completamente. Desarrollo de estrategias de focalización celular tendrán aplicaciones en vehículos de células más adelantado, ampliar la aplicabilidad de este método de entrega y potenciar los resultados terapéuticos.
En un intento de mejorar la focalización y la liberación eficiente de los compuestos terapéuticos a nivel intra-celular de las células diana, se ha desarrollado un nuevo sistema de administración de fármacos basado en eritrocitos controlada campo magnético. Colocación de una fusión pico viral glicoproteína de membrana de los eritrocitos 'y encapsular nanopartículas superparamagnéticas y drogas en los eritrocitos, hemos producido nuevo sistema de administración de fármacos basados en los eritrocitos, los virosomas-HA eritro-magneto, que tienen el potencial para-magnética controlada sitio-específica la localización y la capacidad de fusión altamente eficiente con las células diana. La presencia de glicoproteína de fusión viral hace que la aplicación de ondas ultrasónicas innecesaria para inducir la destrucción "vehículo" para la liberación de compuestos terapéuticos en el sitio diana. Aquí se muestra cómo los virosomas-HA-eritro magneto comportan algo parecido a un virus envuelto en su capacidad de invadir células huésped. Estos eritrocitos modificados son capaces de fusionarse con la membrana citoplasmática de las células diana en un tiempo muy corto y liberar las nanopartículas magnéticas y compuesto terapéutico en el interior de estas células. La cantidad total del fármaco contra el cáncer 5-Aza-2-desoxicitidina tiene un efecto terapéutico de 10 veces menor que la de la terapia estándar, lo que sugiere que este nuevo sistema de administración de fármacos puede ser capaz de reducir los efectos citotóxicos de fármacos mediante el aumento de la biodisponibilidad de compuestos terapéuticos en el sitio de acción y la mejora de la farmacocinética. Este nuevo sistema de administración de fármacos a base de eritrocitos potencialmente se puede aplicar en muchos entornos clínicos, incluyendo patologías neoplásicas, patologías causadas por la infección de un virus humanos o animales y las enfermedades cardiovasculares.
Materiales y Métodos
el crecimiento del virus de la influenza y el aislamiento de la hemaglutinina (HA) de la glicoproteína
virus de la gripe obtenida a partir del líquido alantoideo de 10 días de edad huevos embrionados (huevos se obtuvieron de la fábrica de pollo en Roma, Italia) se sedimentó por ultracentrifugación y el sedimento se resuspendió en octa (etilenglicol) -
n
dodecil monoéter (C
12E
8) y se dejó durante la noche para permitir la solubilización completa de la membrana viral. La suspensión fue cuidadosamente homogeneizada y ultracentrifugated abajo para sedimentar las nucleocápside viral. A continuación, la suspensión virosoma (sobrenadante que contiene la proteína HA) se purificó por ultracentrifugación en un gradiente de sacarosa discontinuo (50% y 10% de sacarosa). En la interfaz de las capas de sacarosa, la glicoproteína HA concentra. Después de la eliminación de esta capa, el HA se ha dializado contra tampón y se esterilizó por filtración.
Los eritrocitos de lisis y la incorporación de HA glicoproteína, nanopartículas súper paramagnéticas y drogas 5-Aza-2-dC
Glóbulos rojos humanos (RBC) se obtuvieron a partir de sangre de donantes sanos por centrifugación a 1700 rpm durante 10 min a 4 ° C. Recién glóbulos rojos recogidos se lavaron dos veces en solución salina fisiológica-tampón de fosfato (1X PBS) (1.37 M NaCl, KCl 57 mM, Na 54 mM
2HPO
4, KH 45 mM
2 PO
4 pH 7,4 ).
2 × 10
9 Los glóbulos rojos se lisaron en 300 l de tampón de lisis (Tris 10 mM, EDTA 0,1 mM, MgCl 1 mM
2 a pH 7,2) durante 60 minutos a 0 ° C . A continuación, la isotonicidad se restauró mediante la adición de 65 l de tampón de resellado 1 X (1,37 M NaCl, KCl 57 mM, Na 54 mM
2HPO
4, KH 45 mM
2 PO
4 mM, MgCl 15
2 pH 7,4), suplementado con 0,1 mg de 100 nanopartículas nm-rojo marcado superparamagnéticas (nano-screenMAG, Chemicell Company), 1 g de HA de la gripe viral espiga glicoproteína, y 0,38 o 30,5 mg 5-Aza-2-dC ( Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.).
La suspensión se incubó durante 45 minutos a 37 ° C con agitación suave. RBCs sellados (fantasmas), que contienen la proteína HA de fusión en la membrana lipídica y ambos 5-Aza-2-dC y nanopartículas superparamagnéticas interior (eritro-magneto-HA virosoma), se recogieron por centrifugación a 10.000 rpm durante 15 minutos a 4 ° C. Los virosomas-HA-eritro magneto se lavaron dos veces con 1X PBS mediante centrifugación a 9000 rpm durante 15 minutos a 4 ° C y se resuspendieron en 1X PBS que contenía 1% de FCS.
Cinética de eritro magneto HA-virosomas fusión con células HeLa: análisis Espectrofluorímetro
virosomas eritro-magneto-HA se prepararon como se ha descrito anteriormente y se marcaron mediante la adición de octadecil rodamina (R18). Los virosomas eritro-magneto-HA /R18 cargado se añadieron a las células HeLa. lípido total en virosomas-HA-eritro magneto /R18 se cuantificó por la cantidad de octadecil rodamina (R18) en su membrana, basado en el hecho de que R18 representa el 15% del peso total de los lípidos en él. Las eritro-magneto-HA-virosomas /R18 se solubilizaron mediante la adición de 0,1% (concentración final) de Triton X-100 en PBS, y la fluorescencia de R18 (excitación a 560 nm y emisión a 590 nm) se midió utilizando una alícuota de la solución con un espectrofluorímetro Perkin Elmer 650-40), calibrado con soluciones estándar que contienen R18 0,1% de Triton X-100. El grado de R18 auto-enfriamiento en cada uno de los virosomas-HA-eritro magneto se examinó mediante la comparación de la fluorescencia de R18 antes y después de la solubilización de los virosomas-HA eritro-magneto con 0,1% Triton X-100 en PBS. virosomas eritro-magneto-HA se añadieron a las células HeLa. La cinética de eritro-magneto-HA virosomas fusión con células HeLa se calculó como% de R18 desatenuación de fluorescencia (FDQ) usando 560 y 590 nm como longitud de onda de excitación y emisión, respectivamente. Como control preparamos eritrocitos magnéticas marcadas con R18 sin proteína de fusión HA reconstituido. También se analizó la cinética de la fusión de estos eritrocitos magnéticas con células HeLa.
El análisis por HPLC de la 5-Aza-2-dC incorporación en la eritro-magneto-HA virosomas
Productos químicos y soluciones.
5-Aza-2-desoxicitidina (5-Aza-2-dC, Decitabine) se adquirió de Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EE.UU.). acetato de amonio fue de Carlo Erba (Milán, Italia). acetonitrilo de calidad HPLC (MeCN) era de Rathburn (Walkerburn, Reino Unido).
análisis
HPLC de virosomas eritro-magneto-HA contienen decitabina.
2 × 10
9 eritro-magneto virosomas de HA se incubaron con 200 l de tampón de lisis para liberar el fármaco 5-Aza-2-dC incorporado y se centrifugaron a 10.000 rpm durante 15 minutos a 4 ° C. El sobrenadante se recupera y se utiliza para el análisis de HPLC o se almacena en un congelador a -80ºC hasta su análisis.
Soluciones Stock estándar de la decitabina a una concentración de 114, 228, 456 y 1140 ng /ml, se prepararon individualmente en agua o solución de tampón de lisis y se almacenan a -80 ° C hasta su análisis.
La relación de área de pico de la muestra /5-Aza-2-dC (decitabina, estándar) se utilizó para la cuantificación. El límite de detección (LOD) se definió como tres veces la relación señal-ruido. El límite más bajo de cuantificación (LLOQ) se definió como el nivel más bajo de analito que puede ser detectado de forma fiable y reproducible con una precisión de ≤20% y la exactitud de 80-120%.
Instrumentación.
El sistema de HPLC compuesto por una Dionex (Sunnyvale, CA, EE.UU.) 3000 última serie LC conectado a una trampa de iones lineal LTQ-Orbitrap (Thermo Fisher Scientific, EE.UU.) espectrómetro de masas, equipado con una fuente de iones por electrospray. Los datos fueron adquiridos y se procesan con un software Excalibur 2.1. Los compuestos se separaron en un C18 Gemini (150 mm-2,0 mm ID) y 3 micras de tamaño de partícula (Phenomenex, Torrance, CA, EE.UU.) protegido por una Phenomenex Gemini C18 (4,0 mm-2,0 mm ID) y 3 micras de partículas cartucho de guardia tamaño . El método HPLC utilizado gradiente de elución; fase móvil de disolvente A fue agua con ácido fórmico al 0,1% y la fase móvil B era acetonitrilo con ácido fórmico al 0,1%. La composición de la fase móvil inicial de 92% de disolvente A y 8% de disolvente B se mantuvo durante 2 min. Entre 2 y 9 min el porcentaje de fase móvil B se aumentó a 35% y luego de vuelta a sus iniciales en la composición de la fase móvil de 0,1 min, con un tiempo total de 14 min. La columna se ajustó a una velocidad de flujo de 0,2 ml min-1 y una temperatura de 36 ° C. se utilizó volumen de muestra de 10 l para todos los experimentos de LC-MS. El espectrómetro de masas se hizo funcionar en modo de electropulverización positiva. La temperatura capilar fue de 275 ° C y se utilizó el spray de 4.5 kV de tensión.
Tumor de células HeLa tratamientos
células humanas HeLa fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (Rockville, MD).
Las células se mantuvieron en medio DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino, 2 mM L-glutamina, en relación de división de 1:04 dos veces a la semana.
Para los tratamientos, 3 ml de células a una densidad de 5 × 10
5 fueron sembradas en placas de microtitulación de 6 pocillos. Dos conjuntos de experimentos se llevaron a cabo en paralelo, tanto para microscopía de escaneo láser confocal (CLSM) y el análisis FACS. Para el análisis de CLSM, en la parte inferior de las placas de cultivo no se colocaron cubreobjetos de vidrio en la que se dejan las células crecer.
Después de 24 horas, el medio de cultivo se cambió con medio que contiene 2,5 mM 5-aza- 2-dC solo o 1 × 10
9-5-Aza cargados dC-virosomas eritro-HA-magneto o tampón en el que se volvieron a suspender las eritro-magneto-HA-virosomas (sobrenadante, el control-2). Después de 30 min, 1, 6, 24, 48 y 96 horas de incubación, tratados y no tratados (control-1) las células fueron analizadas por CLSM y análisis FACS.
Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) análisis de fusión eventos de virosomas eritro-magneto-HA con células tumorales
Las células tumorales cultivadas en portaobjetos en presencia de 5-Aza-2-dC-cargados virosomas eritro-magneto-HA fueron lavados en 1X tampón PBS y se fijaron con 4 % de paraformaldehído. Los núcleos celulares se contratiñeron con DAPI y se montaron en medio antifade. Fluorescencia y de campo brillante imágenes fueron obtenidas por un sistema de microscopio invertido Leica TCS SP5, equipado con cinco láseres que emiten desde el UV a la visible (405 Diode, argón, HeNe 543, HeNe 594 y HeNe 633). La fluorescencia DAPI se detectó a una excitación de 405 nm y emisión de 454 nm, mientras que la fluorescencia roja de nanopartículas superparamagnéticas a una excitación de 543 nm y emisión de 613 nm
Análisis cytofluorimetric (análisis FACS).
análisis FACS se llevó a cabo en células HeLa tratadas con 2,5 M 5-aza-dC o 1X 10
9 5-Aza-2-dC-cargado eritro-magneto-hA-virosomas y en comparación con los no tratados (control -1) después de 24, 48 y 96 horas de cultivo. FACS análisis también se llevó a cabo en las células HeLa tratadas con tampón en el que se volvieron a suspender las eritro-HA-virosomas para comprobar la ausencia de no incorporada 5-Aza-2-dC fármaco (control-2). Tratadas y las células no tratadas se fijaron en alcohol etílico y los núcleos se tiñeron con 10 g /ml de yoduro de propidio y se incubaron con 100 g /ml de ARNasa durante 1 hora a 37 ° C. El contenido de ADN nuclear, que discrimina las fases del ciclo celular, se determinó mediante citometría de flujo utilizando el Becton-Dickinson FACScan CentroII.
declaraciones Ética
En el presente estudio no necesitamos la aprobación ética ya el trabajo no se involucra a los estudios en humanos ni en animales.
el presente estudio se llevó a cabo sin la utilización de donantes de material de voluntarios humanos, se obtuvo sangre humana de la bolsa de transfusión del banco de sangre, por estas razones que no necesitamos el consentimiento informado .
resultados
Comportamiento de eritro-magneto-HA virosomas
Un nuevo sistema de administración de fármacos basados en los eritrocitos se describe aquí es potencialmente capaz de suministrar fármacos a los tejidos diana aumentar la biodisponibilidad de compuestos terapéuticos en el sitio de acción que conduce a un mejor efecto terapéutico con efectos secundarios mínimos. Los eritrocitos humanos se aislaron de la sangre de un donante sano y se trataron con una solución hipotónica para inducir la apertura de poros de la membrana y la liberación de hemoglobina. Se añadió una mezcla que contiene la hemaglutinina (HA) proteínas de fusión de pico viral, las nanopartículas superparamagnéticas fluorescentes y el compuesto terapéutico durante el resellado de los eritrocitos "fantasma". Debido a la alta afinidad por las membranas, la hemaglutinina se une a la membrana citoplasmática de los eritrocitos, mientras que las nanopartículas magnéticas (fluorescencia verde) y las drogas penetran a través de los poros en los eritrocitos "fantasmas" (Fig. 1).
Microscopía confocal de barrido láser ( CLSM) imágenes de virosomas erytro magneto-HA que encapsulan 100 nm nanopartículas superparamagnéticas marcados con fluorescencia (verde) y 5-Aza-2-dC.
Para verificar la captura efectiva de 5-Aza-2 -dC (decitabina) en nuestro sistema de administración de fármacos a base de eritrocitos y para cuantificar el rendimiento del compuesto terapéutico encapsulado, se realizó el análisis HPLC (Fig. 2). Cromatografía líquida /tándem método de cuantificación espectrometría de masas (QTOF /MS) se ha utilizado con el fin de cuantificar e identificar las isoformas 5-Aza-2-dC y sus productos de descomposición en condiciones fisiológicas de pH y de la temperatura como se describe anteriormente [26], [ ,,,0],27].
(A) Los picos de 1,14 ng 5-aza-dC (estándar). (B) Los picos de 5-aza-DC encapsular en virosomas 2 × 10
9 eritro-magneto-HA. RT: tiempo de retención; AA: cuentas de área de pico. (C) La calibración de la curva 5-aza-DC. Los valores de área de pico de las normas se ponen en relación con el ng /10 l de muestra de 5-Aza-2-dC corrían. Las soluciones estándar utilizadas fueron 1,14, 2,28, 4,56 y 11,40 ng 5-aza-DC (rombos negros). triángulos grises muestran las concentraciones de 5-aza-DC que se encuentran dentro de los virosomas muestras de dos eritro-magneto-HA utilizados en
in vitro
experimentos.
En la Figura 2 A y B, el picos tanto de 5-Aza-2-dC (estándar) y 5-Aza-2-dC cargada en virosomas 2 × 10
9 eritro-magneto-HA se muestran. Las muestras se controlaron en modo positivo, lo que resulta en especies de 1 unidad de masa más alta que las moléculas neutras. Los datos se visualizaron mediante la extracción de los cromatogramas de iones a m /z = 229. En la solución estándar (Fig. 2 A) dos picos correspondientes a ambos sola cargada β- (I) y a-formas (II) de 5-Aza-2 -dC (m /z = 229) están presentes. En la muestra, otro pico es evidente, además de 5-Aza-2-dC β- y a-formas (I y II). Este pico corresponde a un derivado guanilurea (III) (m /z = 219). Como se indica anteriormente, cromatogramas de iones extraídos a = 219 (derivados de guanilurea, especies monoméricas cargadas individuales) m /z no son únicos como un identificador de derivados de guanilurea como compuestos con m /z = 229 también producen fragmentos con m /z = 219 cuando se visualizan por el espectrómetro de masas [28]. ß-formas (I) de 5-Aza-2-dC se hidrate en la posición C-6 y el anillo-abre para producir un derivado de anillo-formilado abierta, seguida por la pérdida de ácido fórmico, que entonces produce un derivado de guanilurea (III). Desformilación de cualquiera de los derivados formilados de anillo abierto en los derivados guanilurea (III) da como resultado la pérdida del protón H-6 como el ácido fórmico. Los tiempos de retención (RT), así como los valores de área (AA) para cada pico se muestran en la Figura 2 A y B.
Para cuantificar la cantidad de 5-Aza-2-dC contenida en el erythrocyte- sistema de entrega basado, se inyectaron 10 l de cada estándar y la muestra en HPLC. Diferentes concentraciones de estándar, que van desde 0,114 ng /l (0,5 M) a 1,14 ngμl (5 M) de 5-Aza-2-dC, se prepararon y el área del pico de cada muestra de 10 l se calculó por HPLC . Los valores de área de pico de los estándares se pusieron en relación con el ng de 5-Aza-2-dC y una curva de calibración fue diseñado (Fig. 2 C). Figura 2 A muestra el valor del área (AA: 660.834) detectada por HPLC correspondiente a 1,14 ng (0,5 M) de solución patrón de 5-Aza-2-dC. Diferentes muestras de virosomas eritro-magneto-HA se prepararon y diferentes cantidades de 5-Aza-2-dC, que van desde 0,5 ng /l (2,5 M) a 42 ng /l (200 mM), se añadieron durante el resellado. Para evaluar la cantidad efectiva de 5-Aza-2-dC atrapado en los eritrocitos para cada preparación, virosomas 2 × 10
9 eritro-magneto-HA se lisaron en tampón de lisis 200 l. La cantidad total de fármaco incorporado en virosomas 2 × 10
9 eritro-magneto-HA fue de 3,6 ng o 360 ng cuando se añadieron 2,5 M o 200 mM de 5-Aza-2-dC a los eritrocitos durante el resellado , respectivamente (Fig. 2 C). Por lo tanto, la eficiencia de incorporación para cada muestra fue de aproximadamente 1%.
Para probar la incorporación efectiva de la hemaglutinina (HA) en membranas de eritrocitos y de su actividad de fusión, se evaluó la cinética de la fusión de nuestra eritro-magneto ingeniería virosomas -HA con las células diana. se utilizó Rodamina etiquetado de octadecilo (R18) para determinar la fusión de eritro-magneto-HA virosomas con células HeLa. Fusión Se ha informado% de R18 desatenuación de fluorescencia (FDQ) usando 560 y 590 nm como longitud de onda de excitación y emisión, respectivamente. La fusión de la eritro-magneto-HA virosomas con células HeLa que se inicia después de un período muy corto (unos pocos minutos) y el porcentaje de fusión aumenta exponencialmente con el tiempo (Fig. 3). En contraste, los eritrocitos magnéticos sin hemaglutinina (HA) no muestran actividad de fusión con células HeLa. Estos datos indican que la glicoproteína viral spike (HA) purificada a partir de virus de la gripe y se reconstituyó en vehículos de eritrocitos magnéticos mantiene sus propiedades de fusión con las membranas citoplasmáticas de las células diana y confiere a los eritrocitos magnéticos la capacidad de fusionarse con las células diana.
Los virosomas-HA eritro-magneto-cargados-dC 5-aza-2 se marcaron con octadecil rodamina (R18) y se incubaron con células HeLa. Fusión Se ha informado% de R18 desatenuación de fluorescencia (FDQ) usando 560 y 590 nm como longitud de onda de excitación y emisión, respectivamente. RBC: 5-Aza-2-dC-cargado eritrocitos magnéticos sin proteína de fusión HA reconstituido (Control); RBC-HA: 5-Aza-2-DC-cargado virosomas eritro-HA-magneto
Efecto de Decitabine cargados-eritro-magneto-HA virosomas sobre las células tumorales
A. verificar la eficiencia y la eficacia de nuestro sistema de administración de fármacos a base de eritrocitos, se trataron células tumorales HeLa ya sea con 5-Aza-2-dC solo o encapsulado en virosomas-HA-eritro magneto. 5 × 10
5 células tumorales fueron tratados con 1.800 ng de 5-Aza-2-dC (2,5 M), una concentración demostrado tener efecto terapéutico
In vitro
, o con 1 × 10
9 virosomas-HA-eritro magneto que contienen 10 veces menos 5-Aza-2dC (180 ng).
la absorción a la célula diana y la entrega del compuesto terapéutico en el citoplasma de las células tumorales es se muestra en la Fig. 4. Los tiempos de Al muy cortos (de 30 min a 1 hora) todavía es posible distinguir los eritrocitos de ingeniería que comienzan a mezclarse con las células diana (Fig. 4 A y B). Después de 6 horas la mayor parte de las células diana muestran los virosomas-HA-eritro magneto dentro del citoplasma (Fig. 4 C). El eritro-magneto-HA virosoma, interiorizado dentro de la célula "huésped", se parece a un endosoma viral. La membrana de la eritro-magneto-HA virosomas comienza a fusionarse con la membrana de la célula diana entre 12 y 24 horas, después de lo cual las nanopartículas fluorescentes y el fármaco comienza a difundirse dentro de las células tumorales. Después de 24 horas todas las células tumorales mostraron una fuerte fluorescencia en el citoplasma y algunas tienen la morfología típica de la apoptosis temprana. A las 96 horas la mayor parte de las células tumorales muestran la morfología característica de micronúcleos en los últimos tiempos la apoptosis (Fig. 4 D).
En el lado izquierdo se esquematiza la sincronización y mecanismo de acción de los eritro-magneto-Ha virosomas, encapsulando 100 nanopartículas magnéticas marcadas con fluorescencia nm (verde) y 5-Aza-2-CC. En la derecha se muestran imágenes CLSM de virosomas eritro-magneto-HA (verde) después de 30 minutos (A), 1 hora (B), 6 horas (C), 24 y 96 horas (D) de la incubación con células HeLa que destacan por DAPI (azul). células (CTRL) Si no se trata HeLa (control).
La eficacia del 5-Aza-2-dC reconstituido en virosomas eritro-HA-magneto en la promoción de la apoptosis en relación con el fármaco libre se muestra en la Figura 5. células HeLa no tratadas (control) y se trató con 1,800 ng de 5-Aza-2-dC o con virosomas 1 × 10
9 eritro-magneto-HA que contienen se analizaron por FACS 180 ng de decitabina. Como controles para evaluar los posibles efectos tóxicos del vehículo solo en las células, las células HeLa se cultivaron también en presencia de la solución tampón en el que 5-Aza-2-DC-cargado virosomas eritro-magneto-HA fueron suspendidos (sobrenadante) y con eritro virosomas -magneto-HA que encapsulan sólo los fluorescentes magneto-nanopartículas
Ctrl (control) las células no tratadas.; Aza: células tratadas con 1.800 ng (2,5 M) de 5-Aza-2-dC; Erythro Aza: células tratadas con virosomas eritro magneto-HA que contenían 180 ng de 5-Aza-2-dC; Eritro: descargada virosomas-HA eritro magneto-5-aza-2-dC; Sobrenadante: las células tratadas con tampón, donde se volvieron a suspender los virosomas eritro-magneto-HA (control 2) guía empresas
Después de 96 horas solamente 12,6% de las células tratadas con 1.800 ng de libre 5-aza-. 2-dC aparece apoptótica en comparación con 96% de las células cuando las células se tratan con 180 ng en virosomas-HA-eritro magneto. Por otra parte, a las 24 horas apoptosis significativa se ve con el sistema de suministro de fármaco mientras se observa prácticamente ningún efecto de los fármacos solos. Estas observaciones sugieren que el sistema de magneto HA-eritro-entrega virosomas aumenta el efecto anti-neoplásico de 5-Aza-2-dC a través de la mejora de la biodisponibilidad del fármaco. Ni el sobrenadante, donde cargado-5-Aza-2-dC los virosomas eritro-magneto-HA se suspenden, ni virosomas eritro-magneto-HA que sólo contienen nanopartículas fluorescentes tienen un efecto sobre la proliferación celular, lo que demuestra que nuestra administración de fármacos a base de eritrocitos sistema en sí tiene efecto no tóxico en las células. En conjunto, estos resultados sugieren que este nuevo sistema de administración de fármacos a base de eritrocitos tiene el potencial de aumentar la eficiencia y la eficacia de los compuestos terapéuticos.
Discusión
La quimioterapia citotóxica o la radioterapia del cáncer está limitada por graves, a veces, los efectos secundarios potencialmente mortales debido a la falta de especificidad de las células diana solas. Una estrategia para mejorar la especificidad es encapsular los agentes terapéuticos en un sistema de suministro de fármaco capaz de dirigir compuestos terapéuticos a un sitio diana.
eritrocitos portadores han sido evaluados para su uso en la administración de fármacos en el ser humano que demuestra su seguridad y eficacia [ ,,,0],29]. entrega basada en los eritrocitos de nuevos medicamentos convencionales y por lo tanto está experimentando cada vez mayores intereses en la administración de fármacos y en el manejo de patologías complejas, especialmente cuando los efectos secundarios podrían convertirse en problemas graves [13], [19], [30]. Recientemente, los eritrocitos se han utilizado para encapsular el amikacina antibiótico, y se demostró una liberación sostenida de los eritrocitos cargados durante un período de 48 horas, lo que sugiere un posible uso de los eritrocitos como un sistema de liberación sistémica lenta de antibióticos. La administración de amikacina por los eritrocitos cargados en ratas conduce a cambios significativos en el comportamiento farmacocinético del antibiótico [31], [32]. El sistema de suministro de fármacos basado en eritrocitos presenta varias ventajas: es especialmente eficiente en la liberación de fármacos en la circulación durante largo periodo de tiempo (semanas), los eritrocitos tienen una gran capacidad de atrapamiento, se procesan fácilmente y tienen capacidad para acomodar los fármacos tradicionales y biológicos [ ,,,0],18], [30]. Eritrocitos cargados con el compuesto coloide ferromagnético pueden ser accionados magnéticamente en el órgano diana /tejido por medio de un campo magnético externo [21] - [23], [33] Por último, la disponibilidad de un aparato que permite la encapsulación de fármacos en los eritrocitos autólogos hace que esta tecnología disponible en muchos entornos clínicos y competitiva con respecto a otros sistemas de administración de fármacos [34]
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en el presente trabajo destacamos un nuevo sistema de administración de fármacos basados en los eritrocitos, la eritro-magneto-HA virosoma