Extracto
El cáncer de próstata humano (CaP) es la segunda causa principal de muerte que afligen a los hombres de los Estados Unidos relacionadas con el cáncer. La mayoría de los tratamientos hasta la fecha para el CaP metastásico incluyen la terapia de privación de andrógenos-y segunda generación anti-andrógenos tales como el acetato de abiraterona y Enzalutamida. Sin embargo, una mayoría de los pacientes finalmente desarrollar resistencia a estas terapias y recaída en la forma letal, resistente a la castración de PCa a la que sigue siendo no opción de tratamiento adecuada. Por lo tanto, hay una necesidad inmediata de desarrollar agentes terapéuticos efectivos hacia esta población de pacientes. Imidazopiridinas Recientemente se han demostrado poseer actividad inhibidora de la quinasa Akt; Así, en este estudio, se investigó el efecto inhibidor de nuevos derivados de imidazopiridina HIMP, M-Mei, OMP, y ETOP en diferentes células de CaP resistentes a la castración humanos. Entre estos compuestos, HIMP y M-MeI se observó que poseían la dosis selectiva y la inhibición del crecimiento dependiente del tiempo: redujeron la proliferación celular PCa resistente a la castración y protegidas, en las células epiteliales benignas de la próstata. El uso de células LNCaP C-81 como el sistema modelo, estos compuestos también redujo la formación de colonias, así como la adhesión celular y la migración, y M-MeI fue el más potente en todos los estudios. La investigación adicional reveló que mientras HIMP inhibe principalmente el crecimiento de células PCa a través de la supresión de la vía de señalización de PI3K /Akt, M-MeI puede inhibir ambas vías PI3K /Akt y del receptor de andrógenos y detener el crecimiento celular en la fase G2. Por lo tanto, nuestros resultados indican que el nuevo compuesto M-MEI ser un candidato prometedor para el tratamiento del CaP resistente a la castración, y los estudios futuros que investigan el mecanismo de inhibición de imidazopiridina puede ayudar al desarrollo de fármacos eficaces contra el CaP.
cita: Ingersoll MA, Lyons AS, Muniyan S, D'Cunha N, T Robinson, Hoelting K, et al. (2015) Los nuevos derivados de imidazopiridina Poseen efecto anti-tumoral en las células humanas resistente a la castración cáncer de próstata. PLoS ONE 10 (6): e0131811. doi: 10.1371 /journal.pone.0131811
Editor: Zoran Culig, Universidad Médica de Innsbruck, Austria |
Recibido: 10 Febrero, 2015; Aceptado: 7 Junio 2015; Publicado: 29 Junio 2015
Derechos de Autor © 2015 Ingersoll et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por el Instituto Nacional del cáncer, Institutos nacionales de Salud [CA88184 (MFL), CA138791 (SKB)], Departamento de Defensa de CaP Becas de formación [PC094594 (MFL), PC121645 (MFL)], y la Universidad de Nebraska Medical Center Fondo Puente (MFL). El análisis del ciclo celular se realizó en el Centro de Citometría de Flujo UNMC Core, en parte, con el apoyo de UNMC Eppley Cancer Center de subvención [CA036727] (Ken Cowan). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (CaP) sigue siendo el tumor sólido más comúnmente diagnosticado y la segunda causa principal de muerte por cáncer en los hombres en Estados Unidos, el mantenimiento de una necesidad de nuevas opciones de tratamiento eficaces [1]. En la actualidad, la terapia de privación de andrógenos (ADT) es el curso estándar de tratamiento para el CaP metastásico, sin embargo, la mayoría de los pacientes con CaP recaen dentro de 1-3 años y se desarrollan resistente a la castración (CR) del CP, que no responde a ADT [2,3,4 ]. En 2004, se demostró que una combinación de docetaxel y prednisona para aumentar la supervivencia media de los pacientes por 2-3 meses, por lo que es el tratamiento estándar de atención para CR CaP [5]. Recientemente, la FDA ha aprobado compuestos adicionales, tales como la novela cabazitaxel taxano quimioterapéutico [6], inhibidor de la síntesis de andrógenos acetato de abiraterona,-sipuleucel T dirigidos micro-entorno-[7], AR inhibidor de la señalización Enzalutamida [8] inmunoterapéuticos [9], y el hueso Alpharadin radiofármaco (radio-223) para el tratamiento del CaP CR [10]. Sin embargo, estas opciones de tratamiento sólo son capaces de prolongar la supervivencia de unos pocos meses y el período promedio de supervivencia de los pacientes CR CaP permanece menos de dos años [11]. A pesar de los avances en las estrategias de tratamiento post-ADT, CR CaP sigue siendo una enfermedad incurable; por lo tanto hay una gran necesidad de opciones terapéuticas alternativas
Mientras insensibilidad a los andrógenos puede manifestarse de varias maneras.; un mecanismo alternativo propuesto es el aumento de la activación de Akt señalización en condiciones de andrógenos privados. Akt es conocido para regular el ciclo celular, el metabolismo, la angiogénesis y la supervivencia celular en CaP y su activación podría contribuir a la resistencia del tumor a ADT y anti-andrógenos [12,13]. Un mecanismo mediante el cual Akt puede contribuir a la PCa de supervivencia es a través de la modulación de la señalización del receptor de andrógenos (AR). Además de inducir el crecimiento celular, AR también tiene un papel en la regulación de la apoptosis. Tras la fosforilación de AR en Ser-210 y Ser-790 por Akt, la apoptosis mediada por AR se suprime. A través de este mecanismo, la actividad de Akt mejorada en el CaP puede contribuir a la supervivencia de CaP en ADT [13]. De hecho, la pérdida y /o mutaciones genéticas en la fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3K) /Akt que conducen a la señal de desregulación pueden presentar en hasta al 42% de los tumores de próstata primarios y más del 90% de los tumores metastásicos, por lo que es una prioridad siguiente --en línea diana terapéutica [14]. Recientemente, las investigaciones sobre imidazopiridinas, una nueva clase de compuestos que contienen aldehídos aromáticos y un grupo piridina, han demostrado que estos compuestos poseen una potente actividad inhibidora de la quinasa Akt [15 a 17]. Los datos muestran que estos compuestos tienen un efecto anti-proliferativo contra las células CR CaP con la capacidad de inhibir simultáneamente AR y /vías de señalización, haciéndolos Akt /mTOR agentes terapéuticos prometedores PI3K [18].
Para investigar la eficacia imidazopiridinas ' para la terapia de CaP, el modelo de células LNCaP progresiva, caracterizada originalmente en Lin et. Alabama.
JBC
1998, se utilizó como el modelo celular primaria en este estudio. células LNCaP C-81 son independientes de andrógenos (AI), expresa el antígeno prostático específico (PSA) en ausencia de andrógenos, y tener la capacidad de sintetizar la testosterona a partir del colesterol bajo (SR) condiciones reducida esteroides [19-22]. C-81 células también poseen una mayor proliferación, capacidad de formar colonias, y el potencial migratorio [21,23]. Lo más importante, LNCaP C-81 células conservan AR expresión y corresponden a la expresión de AR en la mayoría de CaP, así como avanzada CR CaP [19]. Esto los convierte en un modelo celular superior para estudios terapéuticos en comparación con muchas otras líneas de células de CaP. Otras líneas celulares seleccionadas para este estudio incluyen MDA PCa2b-AI, PC-3, y RWPE1. A su paso, las células MDA PCa2b comportan de manera similar a las células LNCaP y cambian de andrógeno-sensibles (AS) a baja paso a paso AI en alto. Las células MDA-PCa2b AI (MDA-AI) también retienen AR expresión y poseen una mayor capacidad tumoral; esto hace LNCaP C-81 modelos celulares preferibles MDA-AI y para el estudio de adenocarcinoma de próstata. Además, debido a la capacidad de los derivados de imidazopiridina para apuntar ambas vías AR Akt y, es prudente para investigar los efectos de los compuestos sobre células PC-3 AR-negativo para determinar su eficacia en las células que carecen de los mecanismos clásicos de señalización de andrógenos. Además, PC-3 líneas celulares son más representativos de carcinoma neuroendocrino de células pequeñas de adenocarcinoma predominante más clínicamente [24]; Por lo tanto, esta línea celular se debe utilizar en conjunción con modelos tales como líneas de células LNCaP y MDA PCa2b de ampliar la utilidad clínica. Por último, las células inmortalizadas RWPE1 epitelio de próstata benigna actúan como control para evaluar la selectividad de los compuestos derivados de imidazopiridina. Así, nuestros modelos celulares representan claramente la mayoría de los eventos moleculares observados en implementaciones clínicos de terapias modernas CaP.
Nuestros resultados demuestran estos derivados de imidazopiridina son capaces de suprimir la proliferación de células PCa humana de una manera dosis-y dependiente del tiempo. Es importante destacar que, el compuesto M-MeI exhibió potencia selectiva contra la proliferación celular CR CaP en comparación con las células epiteliales de próstata benignas. Además, también se encontró que este compuesto para inhibir la migración celular, la adhesión, y
in vitro
tumorigenicidad. Nuestros datos son los primeros en demostrar el efecto antitumoral de nuevos derivados de imidazopiridina HIMP, M-Mei, OMP, y ETOP sobre las células CR CaP e indica M-MEI ser un agente terapéutico pista prometedora para futuros estudios.
Materiales y Métodos
Materiales
RPMI 1640, medio de queratinocitos SFM, gentamicina y L-glutamina se adquirieron de Invitrogen (Carlsbad, CA). suero bovino fetal (FBS) y FBS tratado con carbón vegetal se obtuvieron de Atlanta Biológicos (Lawrenceville, GA). Biología molecular de agarosa grado se adquirió de Fisher Biotech (Fair Lawn, Nueva Jersey). marcadores de peso molecular de proteínas convencionales, acrilamida, y el kit de ensayo de proteínas de Bradford se adquirieron de Bio-Rad (Hercules, CA). Los anticuerpos policlonales (ABS) que reconocen las tres isoformas de la proteína Shc (# 29807, 1: 4000) fueron adquiridos de Upstate (Lake Placid, NY). Anti-AR (# c1411, 1: 400), anti-ciclina B
1 (# K1907, 1: 1000), anti-ciclina D
1 (# A2712, 1: 1000), anti-Bcl
XL (# F111, 1: 1000), anti-Bax (# G241, 1: 1000), anti-PCNA (# G261, 1: 3000), anti-p53 (# K2607, 1: 1000), anti- PSA (# E1812, 1: 2000), anti-survivina (# C271, 1: 2000), y conjugado con peroxidasa de rábano picante anti-ratón (# C2011, 1: 5000), anti-conejo (# D2910, 1: 5000) , anti-cabra (# J0608, 1: 5000) de IgG Abs se obtuvieron todos de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Anti-fosfo-Akt (Ser473) (# GA160, 1: 1000), anti-Akt (# c1411, 1: 2000), anti-fosfo-STAT5 (Y694) (# 9351S, 1: 4000), y anti-STAT5 (# 9363, 1: 2000) Abs eran de Señalización celular Tecnología (Beverly, MA). Anti-β-actina (# 99H4842, 1: 10000) Abs y 5α-dihidrotestosterona (DHT) se adquirieron de Sigma (St. Louis, MO). derivados de imidazopiridina HIMP (3-fenil-1- (piridin-2-il) imidazo [1,5-
a
] piridina), M-MeI (1- (piridin-2-il) -3- (
m
tolil) imidazo [1,5-
a
] piridina), OMP (1- (piridin-2-il) -3 - (
o
tolil) imidazo [1,5-
a
] piridina), y ETOP (3- (4-etoxifenil) -1- (piridin-2-il) imidazo [1,5-
a
] piridina) se sintetizaron y proporcionada por el Dr. Xiu Bu como se describe anteriormente [18,25] y sus estructuras se muestran en la figura 1. Para facilitar la lectura, abreviaturas químicas se utilizan en todo el texto.
HIMP, 3-fenil-1- (piridin-2-il) imidazo [1,5-
a
] piridina; M-MEI, 1- (piridin-2-il) -3 - (
m
tolil) imidazo [1,5-
a
] piridina; OMP, 1- (piridin-2-il) -3 - (
o
tolil) imidazo [1,5-
a
] piridina; ETOP, 3- (4-etoxifenil) -1- (piridin-2-il) imidazo [1,5-
a
] piridina.
Cell Culture
próstata humano LNCaP líneas celulares de carcinoma, MDA PCa2b, PC-3, y las células epiteliales de la próstata benigna RWPE1 inmortalizadas se obtuvieron originalmente de la American Type Culture Collection (Rockville, MD, EE.UU.). células LNCaP y PC-3 se mantuvieron rutinariamente en medio RPMI 1640 que contiene 5% de FBS, glutamina 2 mM, y 50 mg /ml de gentamicina [19,21]. células MDA PCa2b se mantuvieron en medio BRFF-HPC1 que contiene 20% de FBS, glutamina 2 mM y 50 mg /ml de gentamicina [26,27]. Como se informó anteriormente, se estableció el modelo de células LNCaP progresiva en la que las células LNCaP en o por debajo pasaje 33 se designan como C-33 y los que están en o mayor que el paso 81 como C-81. Mientras que C-33 células son sensibles al crecimiento inducido por andrógenos, C-81 células son AI, expresar mayores niveles basales de PSA, y hacerse con la capacidad de sintetizar la testosterona a partir del colesterol [19-22]. Al igual que en el modelo de LNCaP, después del paso, las células se convierten en MDAPCa2b AI y poseen muchas propiedades bioquímicas de la clínica CR CaP, incluyendo la expresión de AR funcional, la secreción de PSA, y la proliferación celular rápida en condiciones de andrógenos privados de [19,21,22,27 , 28]. las células se cultivaron en RWPE1 de queratinocitos-SFM complementado con extracto de pituitaria bovina (25 mg /ml) y factor de crecimiento epidérmico recombinante (0,15 ng /ml) junto con 50 g /ml de gentamicina.
para imitar las condiciones de ADT clínica , las células se mantuvieron en condiciones de SR, es decir, fenol RPMI libre de rojo de 1640 que contiene medio de 5% de carbón vegetal /dextrano tratados con FBS, glutamina 2 mM, y 50 mg /ml de gentamicina plus 1 nM DHT. derivados de imidazopiridina HIMP, M-MEI, OMP, y ETOP se disolvieron en sulfóxido de dimetilo (DMSO) a 20 concentraciones madre mM, almacenado a -20 ° C y diluida según sea necesario para las condiciones experimentales en el medio respectivo.
ensayos de proliferación de la célula
para los experimentos de proliferación celular bajo condiciones normales, las células LNCaP C-81 y MDA PCa2b-AI se sembraron en medio de cultivo normal y se dejaron crecer durante 3 días, a continuación cambió a medio que contiene el compuesto respectivo y cultivaron durante 3 días más. Para determinar la proliferación celular en condiciones SR, LNCaP C-81, las células MDA-PCa2b AI, PC-3, y RWPE1 se sembraron en condiciones regulares y se dejó crecer durante 3 días. Las células fueron entonces hambre esteroides durante 48 horas en medio de SR y se cambian a medio SR fresco que contiene el compuesto respectivo, a continuación, se cultivaron durante 3 días adicionales. Los grupos de control recibieron DMSO disolvente solo. En el punto de tiempo especificado, se tripsinizaron las células y el número de células vivas se contaron mediante el ensayo de exclusión de azul de tripano usando un contador de células basada en imágenes Cellometer Auto T4 (Nexcelom, MA, EE.UU.).
Crecimiento Celular Kinetic y dosificación Determinaciones
ensayos dependientes de la dosis se llevaron a cabo en células LNCaP C-81 de la misma manera como los ensayos de proliferación celular y utilizan un medio que contiene 0, 1, 5, o 10 mM de compuesto especificado. Para determinar el efecto cinético de HIMP y M-MeI en el crecimiento de LNCaP células C-81, las células se sembraron en placas de cultivo de seis pocillos a una densidad de 2 x 10
3 células /cm
2 y mantenidos en condiciones de cultivo habituales durante 3 días. Las células se cambiaron a continuación a medio SR y se mantienen durante 2 días. Una placa de células unidas se recogió y se cuenta como día 0, y las células restantes se cambiaron a sus respectivas medio de tratamiento: control (DMSO), HIMP, y M-MeI (10 M). En cada punto de tiempo, las células se recogieron para el recuento del número de células y las células restantes se alimentaron con medio fresco que contenía compuesto respectivo tratamiento. Después de recuento del número de células, lisados de células se prepararon para análisis de transferencia Western.
Análisis de citometría de flujo
Para determinar el efecto de los compuestos en el ciclo celular, LNCaP C-81 células fueron sembradas en matraces T25 en una densidad de 2 x 10
3 células /cm
2 en un medio normal durante 3 días, se cambió a medio SR durante 48 horas, y luego se alimentaron con medio fresco que contenía SR 10 M de compuesto especificado. Un conjunto de células se recogió después de 3, 5, y 7 días de tratamiento, respectivamente, por tripsinización. Después de recuento del número de células, una alícuota de células se sedimentaron por centrifugación, se resuspendieron en 70% de etanol, y se incubó a 4 ° C durante 30 minutos, después se lavaron con PBS y se centrifugaron de nuevo por centrifugación. El ADN de las células fijados con etanol se tiñó usando Telford Reactivo (PBS, pH 7,4, que contiene 0,1% de Triton X-100, 0,1 mM EDTA sal disódica, 0,05 mg /ml de RNasa A (50 U /mg), y 50 mg /ml yoduro de propidio) a 4 ° C durante 4 horas [29]. Determinación de la distribución del ciclo celular se llevó a cabo utilizando un activadas por fluorescencia clasificador de células Becton-Dickinson (FACSCalibur, Becton Dickinson, San Jose, CA, EE.UU.) en el Centro de Citometría de Flujo UNMC Core.
ensayo de adhesión celular
para determinar el efecto de los derivados de imidazopiridina en CaP la adhesión celular a superficies de plástico-Ware, se suspendieron LNCaP C-81 células en 5% de FBS 1640 medio RPMI que contiene 10 mM de los compuestos respectivos y se incubaron durante 30 minutos. Las células se sembraron en placas de 6 pocillos por triplicado a una densidad de 3x10
3 células /cm
2 en respectivo medio de tratamiento y se incubaron durante una hora adicional. Las células no adheridas se lavaron con cuidado y las células unidas restantes se tiñeron con una solución de cristal violeta al 0,2% que contenía metanol al 50%. Se contó el número total de células en cinco campos a un aumento de 40x por pocillo.
clonogénicos y de colonias en agar blando ensayos de formación de
El ensayo de crecimiento celular clonogénico en la superficie de plástico-mercancías se llevó a cabo como se descrito anteriormente [23,26]. Brevemente, las células LNCaP C-81 se sembraron en placas de 6 pocillos en condiciones de cultivo normales en tres densidades: 20, 200, y 2.000 células por pocillo. Las células se incubaron durante la noche, después de lo cual se eliminaron las células no unidas y las células unidas se alimentaron con medio normal fresco que contiene 10 mM de compuesto de tratamiento. Las células se cultivaron durante 9 días con un cambio de medio fresco cada tres días. En la 10
TH días, se retiró el medio y las células se lavaron con solución salina tamponada con HEPES enfriada con hielo, las células entonces unidos se tiñeron con una solución de cristal violeta 0,2% que contiene 50% de metanol. El experimento se llevó a cabo por duplicado.
El efecto de los derivados de imidazopiridina en el crecimiento independiente de anclaje de células LNCaP C-81 se evaluó por el ensayo de agar blando. Brevemente, 5x10
4 células fueron sembradas en una capa superior de agarosa 0,25% con una capa base que contiene 0,3% de agarosa en placas de 6 pocillos. El día después de la siembra, los grupos de células que contienen más de una célula se excluyeron del estudio. Las células fueron alimentadas con 0,5 ml de medio normal fresco que contiene el compuesto respectivo cada 3 días durante 4 semanas. Después del período experimental, las colonias se tiñeron con una solución de cristal violeta 0,2% que contiene 50% de metanol y se contaron.
Migración Celular Ensayo
Para determinar el efecto de los derivados de imidazopiridina en la movilidad celular CaP, LNCaP la migración de células C-81 se evaluó a través de ensayo de cámara de Boyden. Las células se sembraron a una densidad de 5 x 10
4 células en la cámara superior de insertos de 24 pocillos placa transwell. Medio que contiene 10 mM de compuesto de tratamiento (disolvente solo para el control) se colocó en las dos cámaras superior e inferior de los cultivos polarizados. Las células fueron incubadas durante 24 horas, después de lo cual se tiñeron con solución de cristal violeta 0,2% en 50% de metanol, y las células restantes en la cámara superior se retiraron a través de hisopo de algodón. Las células que habían migrado a través de la cámara inferior se contaron a un aumento de 40x en un microscopio.
análisis de inmunotransferencia
Todas las células se enjuagaron con solución salina tamponada con HEPES enfriada con hielo, pH 7,0, a través de cosecha raspado y se lisaron en tampón de lisis enfriado con hielo que contenía inhibidores de proteasa y fosfatasa. Total de lisados celulares se prepararon como se ha descrito previamente [19,30]. La concentración de proteína del sobrenadante se determinó a través de una proteína de ensayo de Bio-Rad Bradford. Para inmunotransferencia, una alícuota de lisado celular total se sometió a electroforesis en SDS-geles de poliacrilamida (7,5% -12%). Después de ser transferido a una membrana de nitrocelulosa, las membranas se bloquearon con leche no grasa al 5% en solución salina tamponada con Tris (TBS) que contenía 0,1% de Tween-20 durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las membranas se incubaron con el correspondiente Ab primario durante la noche a 4 ° C. Las membranas se aclararon y se incubaron con el Ab secundario apropiado durante 60 minutos a temperatura ambiente. Las proteínas de interés fueron detectados por un aumento de quimioluminiscencia (ECL) kit de reactivos y β-actina se utilizó como control de carga.
Análisis estadístico
Cada grupo de experimentos se llevó a cabo por duplicado o triplicado como se ha especifican en las leyendas de las figuras, y los experimentos se repitieron de forma independiente al menos dos o tres veces. Los valores medios y el error estándar de todos los resultados se calcularon y de dos colas se utilizó la prueba de t de Student para determinar la significación de los resultados.
p Hotel & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
Efecto dependiente de la dosis de derivados de imidazopiridina sobre la proliferación celular CR CaP
LNCaP C-81. células exhiben muchas de las propiedades bioquímicas como se ve en la clínica CR CaP, incluyendo la expresión funcional de AR, la secreción de PSA AI, y la proliferación intracrina con la regulación del crecimiento [19,21-23] y por lo tanto se utilizaron como sistema modelo celular primario para pruebas de compuestos de imidazopiridina. Inicialmente, los efectos dependientes de la dosis de HIMP, M-MeI, OMP, y ETOP en LNCaP células C-81 se ensayaron en condiciones de cultivo normales. Las células se trataron con 0 a 10 mM de cada compuesto durante 72 horas y el crecimiento celular se analizó mediante el ensayo de exclusión de azul de tripano. En condiciones de cultivo normales, se observó una inhibición dependiente de la dosis de la proliferación celular para todos los compuestos con IC estimado
50 valores de 6.1 M (M-MEI), 6,6 M (Etop), 7,3 M (OMP), y 9,3 M ( HIMP) (figura 2A).
(A) efecto de la dosis de derivados de imidazopiridina en LNCaP células C-81. Las células se sembraron en placas de seis pocillos a 2 x 10
3 células /cm
2 en un medio ordinario y se cultivaron durante 72 horas. entonces un grupo de células se alimentaron con medio normal fresco que contiene 0,1,5, o 10 derivados de imidazopiridina m con disolvente solo para el control y se cultivaron durante 72 horas adicionales. Otro conjunto de células fue primero esteroide hambre en un medio de SR durante 48 horas después se trató con compuestos respectivos en los medios SR frescas que contienen 1 nM DHT durante 72 horas. Todas las células se trataron con tripsina y se contaron el número de células vivas. El experimento se llevó a cabo en pocillos duplicados con 3 series de experimentos independientes. Los resultados presentados son la media ± SE; n = 2x3. *
p Hotel & lt; 0,05 **
p Hotel & lt; 0,005 ***
p Hotel & lt; 0,0005. (B) Efectos de derivados de imidazopiridina en el crecimiento de diversas células de CaP y inmortalizado las células epiteliales de la próstata. Todas las células se sembraron en placas de seis pocillos a la densidad se indica en su respectivo medio durante tres días, esteroides de hambre durante dos días, a continuación, alimentada con medio de SR fresco con 1 nM DHT que contiene 10 derivados de imidazopiridina mu M y se cultivaron durante tres días adicionales. Las células se trataron con tripsina y se contó el número de células vivas. LNCaP C-81-2 x 10
3 células /cm
2, MDA PCab2b AI-3 x 10
3 células /cm
2, PC-3-2 x 10
3 células /cm
2, RWPEI- 7.5 x10
3 células /cm
2. Todos los experimentos se realizaron en pocillos por triplicado con 3 series de experimentos independientes. Los resultados presentados son la media ± SE; n = 3x3. *
p Hotel & lt; 0,05; **
p Hotel & lt; 0,001; ***
p
. & Lt; 0,0001
A continuación, examinó el efecto de los compuestos en condiciones SR, imitando condiciones de ADT. Los compuestos inhibieron el crecimiento de células después de la respuesta de dosis con CI estimado
50 valores de 10,2 M (M-MEI), 10,5 M (OMP), 11,6 M (HIMP), y 16,0 M (ETOP) (Figura 2A). Curiosamente, M-MeI tenía la mayor actividad inhibidora en ambas condiciones de crecimiento. Aunque ETOP tenía una inhibición comparable al M-MEI en condiciones regulares, que tuvo el menor efecto en condiciones SR. HIMP y OMP también mostraron ser menos eficaz que la M-MEI, tanto en condiciones de tratamiento.
selectivo antiproliferativo Efecto de los compuestos sobre el CP vs normales inmortalizadas células epiteliales de la próstata
El efecto supresor de cada inhibidor sobre la proliferación se investigó usando un panel de líneas de células epiteliales de la próstata cancerosas y benignas. AI células de CaP incluyendo AR-positivo LNCaP C-81 y MDA PCa2b-AI, así como células AR-negativos PC-3 fueron elegidos como representantes de avanzada CR CaP. células RWPE1, una línea de células epiteliales de la próstata benigna inmortalizada, se utilizaron para determinar la selectividad de los compuestos. Después de tres días de tratamiento 10 mM en condiciones SR, HIMP, M-MeI, y ETOP todos muestran la inhibición selectiva de la proliferación de células cancerosas con significativamente menos efecto sobre las células RWPE1 no cancerosas (Fig 2B). Aunque OMP era eficaz contra C-81 y las células PC-3, era comparativamente potente contra las células RWPE1. En general, los resultados muestran HIMP y M-Mei fueron los más selectiva, inhibición del crecimiento celular CaP significativamente más que las células RWPE1 con M-MEI presentan una mayor inhibición en todas las líneas celulares analizadas.
represión de CaP tumorigenicidad por derivados de imidazopiridina
capacidad de los compuestos para suprimir la formación de colonias en células LNCaP C-81 se ha accedido inicialmente por ensayos clonogénicos in vitro para el crecimiento celular dependiente de anclaje. células LNCaP C-81 se sembraron con 20, 200, y 2.000 células por pocillo en placas de 6 pocillos, y después se trató con 10μM de cada compuesto. Tras 10 días de tratamiento, todos los compuestos inhibieron significativamente el crecimiento clonogénico a 2.000 células por pocillo, como se muestra en la figura 3A para 2.000 células por pocillo. Mientras M-Mei y ETOP inhibió fuertemente el crecimiento de colonias, HIMP y OMP eran comparativamente menos potente. se observó la formación de colonias mínima a densidades de 20 y 200 células por pocillo.
(A) en ensayo clonogénico y plástico. células LNCaP C-81 se sembraron en placas de seis pocillos a densidades de 20, 200 y 2.000 células /pocillo. Después de 24 horas, las células unidas se trataron con compuestos respectivos a los 10 M concentraciones de derivados de imidazopiridina o disolvente solo como control. Las células se alimentaron los días 3, 6, y 9 con medios de cultivo fresco que contenía inhibidores respectivos. En el día 10, las células se tiñeron y el número de colonias contadas. Las fotografías de las placas de colonias representativas se tomaron de placas sembradas con 2,000cells /pocillo, y se contó el número de colonias se muestra también a partir de placas sembradas con 2,000cells /pocillo. se observó la formación de colonias mínima a densidades de 20 y 200 células /pocillo. Los resultados presentados son la media ± SE; n = 2x3. ***
p Hotel & lt; 0,0001. (B) ensayo de agar blando independiente del anclaje. células LNCaP C-81 se sembraron a una densidad de plato de 5 x 10
4 células /35 mm en 0,25% placas de agar blando. El día siguiente, las células en dobletes o mayores fueron marcados y excluido del estudio. Los medios se añaden cada tres días, y al final de 5 semanas, las colonias formadas se tiñeron y se contaron. se muestran imágenes representativas de las colonias (arriba) y se contó el número de colonias (abajo). Los experimentos se realizaron por duplicado con 3 series de experimentos independientes. Los resultados presentados son la media ± SE; n = 2x3. *** P & lt; 0,0001. (DO). ensayo de adhesión celular en y plástico. Las células se suspendieron en medio de tratamiento durante 30 minutos antes de ser chapada en placas de 6 pocillos a 3 x10
3 células /cm
2 utilizando el mismo medio de tratamiento. Las células se dejaron adherir durante una hora, se fijaron y se tiñeron por la solución de 0,2% de cristal violeta (50:50, agua: MeOH). Se contó el número total de células en cinco campos a un aumento de 40x para cada pocillo. Los experimentos se realizaron por triplicado con 3 series de experimentos independientes. Los resultados presentados son la media ± SE; n = 3x3. *
p Hotel & lt; 0,05; **
p Hotel & lt; 0,01. (RE). La migración celular Transwell ensayo. La migración celular se evaluó a través de la cámara de Boyden. Una alícuota de 5 x 10
4 C-81 células se sembró en el inserto de placas de 24 pocillos en medios que contienen 10 mM compuestos respectivos con disolvente solo para el control en ambas cámaras superior e inferior. Después de 24 horas de incubación, las células migraron y se tiñeron las células restantes en la cámara superior se retiraron a través de un hisopo de algodón. Se contaron las células que habían migrado a través de la cámara inferior. Se muestran imágenes representativas a 40 aumentos. Los experimentos se realizaron por triplicado con 3 series de experimentos independientes, y los resultados presentados son la media ± SE; n = 3x3, *
p Hotel & lt; 0,05; **
p
. & Lt; 0,005
El ensayo de formación de colonias en agar blando se realiza entonces para determinar el efecto de los compuestos sobre el crecimiento independiente del anclaje en un entorno en 3 dimensiones. Como se muestra en la figura 3B, las células cultivadas a una densidad de 5.000 células por placa de 35 mm durante cuatro semanas producidos muchas menos colonias con tamaño de las colonias más pequeñas cuando se tratan con los derivados de imidazopiridina. En comparación con las células de control tratadas con disolvente solo, M-MeI suprimió el crecimiento de colonias en la mayor medida, lo que reduce el número de colonias por 90 por ciento con tamaño de las colonias apenas visibles (Fig 3B). En comparación, ETOP y OMP reducido crecimiento de la colonia con la inhibición del 80 y 70 por ciento, respectivamente, y HIMP tenido un efecto mínimo en un 50 por ciento de inhibición.
Para aclarar si el efecto de estos compuestos sobre la formación de colonias se debe en parte a la inhibición de la adhesión celular, la capacidad de HIMP, M-MeI, OMP, y ETOP para influir en la adhesión celular CaP sobre la superficie de plástico de placas de 6 pocillos a continuación, se investigó. Aunque estos compuestos habían diversos grados de supresión de la capacidad de LNCaP células C-81 para adherirse a una densidad de 50.000 células por pocillo, se observó una tendencia inhibidora similar a la de ensayos de agar clonogénicas y blandos (Fig 3C vs. 3A & amp; 3B). M-MeI tuvo el mayor efecto y fue capaz de reducir la unión de células en un 40 por ciento. Mientras HIMP y ETOP también fueron capaces de inhibir significativamente la adherencia de las células, lo hicieron en menor medida; OMP se encontró que tenía un efecto mínimo sobre la capacidad de las células C-81 'para unirse a la superficie de plástico. Por lo tanto, aunque todos los compuestos pertenecen a la misma clase de moléculas, que influyen en la formación de colonias de células CaP y adhesión diferente.
Para investigar la capacidad inhibidora de estos compuestos sobre la metástasis tumoral, su actividad en la migración de células se analizó por transwell ensayo de migración. Curiosamente, se encontró que estos compuestos tengan grados variables de supresión de la migración de células de CaP. Fig 3D mostró que tanto M-MeI y ETOP fueron capaces de reducir significativamente LNCaP C-81 la migración celular a través de cámara de Boyden ensayo durante un período de 24 horas en aproximadamente un 30 por ciento. Comparativamente, HIMP y OMP no lograron reducir significativamente la migración de células. En general, M-Mei fue encontrado para exhibir la actividad inhibidora más potente en la capacidad tumoral de células CR CaP.
Efecto de los compuestos de imidazopiridina en proliferativa y apoptótica de señalización en células de CaP CR
Está bien establecido que la mayoría de las células CR CaP expresan AR funcional que aún se requiere para su crecimiento y supervivencia [22,31,32]. Para determinar cómo los compuestos suprimen la proliferación de las células del CP, se analizaron sus efectos en la señalización de proliferación y apoptosis en LNCaP C-81 y MDA PCa2b-AI-AR células positivas en condiciones SR. Fig 4A y 4B muestran que, en los tratamientos de 3 días, 10 M de cada compuesto significativamente suprimida LNCaP C-81 y la proliferación celular MDA PCa2b-AI
.
LNCaP células (A) C-81 se sembraron por triplicado en matraces T25 a 4 x 10
3 células /cm
2 en medio ordinario, cultivados durante 72 horas a continuación de hambre esteroides durante 48 horas. Las células se trataron entonces con 10 mM derivados de imidazopiridina o DMSO como control para 72 horas adicionales en condiciones SR. Las células se tripsinizaron y el número de células vivas contadas a través de ensayo de azul de tripano. Los experimentos se realizaron por triplicado con 3 series de experimentos independientes. ***
p Hotel & lt; 0,0005. se cultivaron (B) células MDA PCa2b-ai, tratados, y se contaron en condiciones como se ha descrito anteriormente en (A) para LNCaP células C-81. Los resultados presentados son la media ± SE; n = 3x3. *
p Hotel & lt; 0,05; **
p Hotel & lt; 0,005; ***
p Hotel & lt; 0,0005. (C) LNCaP C-81 proteínas totales del lisado de células se recogieron de (A) después de recuento del número de células. *
p Hotel & lt; 0,05;