Extracto
El cáncer de vejiga es la cuarta causa más común de cáncer en hombres en los Estados Unidos. comportamiento invasivo es un determinante importante de pronóstico. En este estudio, hemos identificado mamíferos objetivo de rapamicina complejo 2 (mTORC2) como un regulador central de la migración de las células del cáncer de vejiga y la invasión. actividad mTORC2 se evaluó por el grado de fosforilación de Ser473 en AKT y se determinó que aproximadamente 5 veces mayor en las muestras de cáncer de vejiga humano invasivo en comparación con el cáncer de vejiga humana no invasiva. Las líneas celulares inmortalizadas malignos de vejiga, UMUC-3, J82 y T24 demostraron una mayor actividad mTORC2 línea de base con respecto a la línea celular derivada de la vejiga del papiloma benigno RT4 y la normal HU1 urotelial línea celular. Las células malignas de cáncer de vejiga también demostraron un aumento de la migración en ensayos transwell y denudación, aumento de la invasión de matrigel, y el aumento de la capacidad de invadir los especímenes de vejiga humanos. El silenciamiento génico de Rictor, un componente crítico de mTORC2, la migración de células de cáncer de vejiga sustancialmente inhibida y la invasión. Esto fue acompañado por una disminución significativa en la activación de Rac1 y la fosforilación de paxilina. Estos estudios identifican mTORC2 como un importante objetivo para neutralizar la invasión del cáncer de vejiga
Visto:. Gupta S, Hau AM, Playa JR, Harwalker J, E Mantuano, Gonias SL, et al. (2013) diana de mamífero de la rapamicina Complejo 2 (mTORC2) es un determinante crítico de la invasión del cáncer de vejiga. PLoS ONE 8 (11): e81081. doi: 10.1371 /journal.pone.0081081
Editor: Natasha Kyprianou, Universidad de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 11 Julio, 2013; Aceptado: 8 Octubre 2013; Publicado: 27 Noviembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Gupta et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por la Case Western Reserve University /Clínica de Cleveland Número CTSA subvención UL1 RR024989 del Instituto Nacional del cáncer, y un premio de desarrollo de la carrera KL2 (RR024990) con el documento dE Obsequiar. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de vejiga por más de 70.000 nuevos casos de cáncer en los Estados Unidos cada año, estimando una incidencia mundial de 386.000 casos por año [1,2]. El carcinoma urotelial (UCA) representa aproximadamente el 95% de todos los cánceres de vejiga, con los resultados del paciente influenciados principalmente por el grado patológico y la etapa [3]. Grado es un principal contribuyente al comportamiento en UCa no invasivo, que se subdivide en bajo grado y de alto grado categorías. enfermedad de bajo grado muestra frecuente recurrencia local, en la superficie de la vejiga, pero la progresión de la enfermedad invasiva raras [4]. enfermedad de alto grado de avance de la invasión en el 40-50% de los pacientes [5]. Una vez que se produce la invasión, la supervivencia específica de la enfermedad disminuye a medida que aumenta el estadio patológico (es decir, la profundidad de la invasión de la pared de la vejiga), a pesar de la intervención terapéutica.
El cáncer de vejiga sigue siendo una enfermedad relativamente poco estudiada y los mecanismos celulares que determinan la progresión del cáncer se conoce por completo. enfermedad de alto grado a menudo muestra
RB
y
TP53
mutaciones y
PTEN
su eliminación; sin embargo, estos cambios genéticos pueden ser observados en las lesiones tanto invasivas y no invasivas. Identificación de las vías pro-invasivos de cáncer de vejiga ha sido más difícil. Trabajos recientes han demostrado que el receptor-1 del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR1) promueve la invasión de células de cáncer de vejiga que expresan ZEB1, un marcador de epitelio-mesenquimal transición (EMT) [6]; inhibición FGFR en este estudio redujo la diseminación metastásica de las células de cáncer de vejiga ortotópicamente implantados. foxq1 expresión también se asoció con una firma EMT en células de cáncer de vejiga y el silenciamiento de foxq1 aumentó la expresión de E-cadherina, disminución de la expresión de vimentina y atenuó el comportamiento invasivo [7]. El objetivo phosphoinositide-3-quinasa AKT-de mamíferos de la vía de la rapamicina (mTOR) ha sido identificado como una vía de candidato en la progresión del cáncer de vejiga en varios estudios recientes clinicopathological [8,9]. Aunque hemos identificado un papel para mTORC1 en la promoción de la proliferación del cáncer de vejiga
in vitro
y el crecimiento de xenoinjerto de cáncer de vejiga
in vivo
[9], el papel de mTOR señalización en la invasión del cáncer de vejiga no ha sido explorado.
mTORC2 es una diana atractiva para la inhibición de la invasión del cáncer de vejiga, porque se ha demostrado que afecta a la remodelación del citoesqueleto, la adhesión de células de cáncer, y la migración [10-12]. mTORC2 se distingue de mTORC1 por la presencia de la Rictor, PROTOR y subunidades mSin1, que son necesarios para la actividad quinasa completo [13,14]. los efectores incluyen AKT y la Rho GTPasas (Rho, Rac y Cdc42) que regulan la adhesión y migración [12,15,16]. mTORC2 también puede regular EMT [17] y se ha implicado en la invasión y metástasis en el colon y el cáncer de mama [10,18]. la orientación selectiva de mTORC2 reduce la metástasis del cáncer en modelos de ratón [10]; Sin embargo, su papel en la invasión y la metástasis del cáncer de vejiga es desconocida.
En este estudio, se analiza el papel de mTORC2 en la invasión de células de cáncer de vejiga. Hemos utilizado muestras de cáncer de vejiga humanos para mostrar que el aumento de la actividad mTORC2 está asociada con un fenotipo invasivo. Estos estudios son, junto con
in vitro
y la novela
ex vivo
ensayos de invasión de la pared de la vejiga humanos para demostrar el papel fundamental de mTORC2 en la migración celular y la invasión del cáncer de vejiga. Las alteraciones en la señalización de Rho GTPasa se detallan. Los resultados de este estudio indican que mTORC2 puede ser una nueva diana emocionante en la inhibición de la progresión del cáncer de vejiga.
Materiales y Métodos
Cultivo de células y reactivos
RT4, UMUC3, T24 y células J82 se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). HU1 células fueron un generoso regalo de R. Rackley (Cleveland Clinic). Las células fueron cultivadas en medio RPMI-1640 (Gibco, Invitrogen Corp., Grand Island, NY) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS, GIBCO) y solución de antibiótico /antimicótico (Sigma, Inc., St. Louis, MO). Todas las líneas celulares se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2. la privación de suero se realizó durante 16 h mediante el mantenimiento de las células en el suero carente de media, con lavados tres tampón fosfato salino (PBS) durante este período de tiempo. Para estimular el suero de las células, se añadió 10% de SFB. La rapamicina se obtuvo de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX).
Las muestras de pacientes
Todas las investigaciones con seres humanos fue aprobado por el IRB Cleveland Clinic y el consentimiento por escrito se obtuvo de los pacientes. muestras de tejido fresco se obtuvieron en el momento de la cirugía, se congelaron rápidamente y se almacenaron a -80 ° C. Las secciones congeladas se analizaron por microscopía para confirmar que mayor que & gt; 90% de las células en las muestras sometidas a análisis de inmunotransferencia eran células tumorales. El grado tumoral se confirmó por un patólogo. Para el análisis de inmunotransferencia, las muestras de tejido se homogeneizaron usando el Power Gen 500 homogeneizador (Thermo Scientific, San Diego, CA).
Rictor silenciamiento
siGENOME de control no director (NTC) siRNA y siGENOME SmartPool siRNA-Rictor específica se obtuvo de Dharmacon (Thermo Scientific). Las transfecciones se realizaron durante 48 h utilizando el RNAiMAX reactivo Lipofectamine® (Invitrogen). El silenciamiento se confirmó por análisis de inmunotransferencia.
El análisis por inmunotransferencia
Las células y las muestras de tejido se extrajeron en tampón RIPA que contenía cóctel inhibidor de proteasa (Sigma) y fosfatasa cócteles de inhibidores de 1 y 2 (Sigma) y se sometieron a SDS-PAGE en geles de gradiente de 4-15%. Las proteínas se transfirieron a membranas de Hybond ECL (GE Healthcare, Pittsburgh, PA) utilizando el sistema de transferencia semiseca Bio-Rad Transblot (Life Science Research, Hercules, CA). Las membranas se bloquearon con 1% de albúmina de suero bovino y se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C en solución de bloqueo. Los anticuerpos, que se obtuvieron de Cell Signaling Technology (Danvers, MA), dirigidos Rictor (1: 1000), p-AKT (Thr308; 1: 1000), p-AKT (Ser473; 1: 1000), pan-AKT (1 : 2000), p-S6 (1: 2000), el total de-S6 (1: 2000), y la actina (1: 5000). Las transferencias se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con fosfatasa alcalina (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) a temperatura ambiente durante 1 h y se desarrollaron usando ECF ™ Western Blot paquetes de reactivos (GE Healthcare). La densitometría se realizó con ImageQuant software (GE Healthcare).
propagación de células y análisis morfométrico
Las células se trataron con tripsina y se sembraron a baja densidad en tiras de cámara de borosilicato cubreobjetos (Nalge Nunc International, Naperville, IL) recubierto con 20 mg de fibronectina /ml. //rsbweb.nih: se analizó usando el software Image J (http imágenes lapso de tiempo se ha realizado mediante una Leica TCS-SP2 con un Plan-Apocromático 63x /1,4 NA objetivo de petróleo (Leica, Buffalo Grove, IL) durante 24 h y la morfología celular .gov /ij /). La superficie total de las células individuales se cuantificó para cada punto de tiempo correspondiente y se representa con respecto al tiempo transcurrido.
Modificado herida cero ensayos de migración
ensayos de migración cero de la herida modificados se realizó como se describió anteriormente [19 ]. Brevemente, placas de cultivo de tejido se pre-trataron con 20 ng /ml de fibronectina en PBS durante 1 h. Una tira delgada de polidimetilsiloxano (PDMS) se colocó en el medio de cada pocillo y se deja que se adhieran. Las células se sembraron en la parte superior y se incubaron durante 18 h, después de lo cual las tiras de PDMS fueron retirados para revelar una matriz de fibronectina imperturbable. Múltiples campos de visión por pocillo se obtuvieron imágenes a intervalos regulares utilizando el microscopio Leica DM IRE2 (Leica) y software de imágenes MetaMorph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
ensayos de invasión Transwell
Transwell invasión se realizaron ensayos tal como se describe anteriormente [9] utilizando 8 micras membranas de PET (Corning Life Sciences, Tewksbury, MA) recubiertas con Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA). Las células se sembraron a membranas en medio libre de suero (SFM) y se dejaron migrar durante 24 h hacia una cámara que contiene pares de medio suplementado con 10% FBS. Las membranas se fijaron con paraformaldehído al 4%, se permeabilizaron en 0,1% de Triton X-100, y se tiñeron con DAPI. La parte superior de la membrana fue limpiar con un hisopo de algodón para que las células se contaron solamente transmigración. Los campos de visión a 200 aumentos fueron imágenes al azar utilizando el microscopio Leica DMR y el número de células presentes se cuantificó utilizando el software ImageJ.
vejiga pared invasión ensayo
Para los ensayos rebanada de vejiga, fresco, lleno rebanadas Grueso de la pared de la vejiga se obtuvieron de los pacientes sometidos a cistectomía radical y se obtuvieron a partir de porciones libres de la enfermedad de la pared de la vejiga por un patólogo urológica. La membrana basal fue despojado para exponer el tejido conectivo (lámina propia) y el aspecto externo de la grasa perivesical fue incrustado en agar. El tejido se mantiene en RPMI /10% FBS con antibióticos /antimicóticos durante 7-10 días. células de cáncer de vejiga se marcaron con CellTrackerTM Red, cabeza de serie en el segmento de tejido, y se incubaron durante 3-7 días con cambios regulares de medio a intervalos de 24 horas. A fin de evaluar la profundidad invasivo de las células tumorales, el tejido se seccionó perpendicularmente a los 10 micrones intervalos para ver todas las capas de tejido y las células se visualizaron utilizando hematoxilina y eosina (H & amp; E) tinción, inmunohistoquímica e inmunofluorescencia. Las imágenes fueron capturadas utilizando un microscopio de fluorescencia Leica DMR y avanzado software Spot (SPOT Imaging Solutions, Sterling Heights, MI). Profundidad de la invasión se midió usando el software Image-Pro Plus en las imágenes capturadas (Media Cybernetics, Rockville, MD). La inmunohistoquímica para detectar citoqueratina AE1 /3 se realizó como se describe anteriormente [9] utilizando una tinción Descubrimiento XT automatizado.
La inmunofluorescencia
tinción de inmunofluorescencia se realizó tal como se describe anteriormente [20]. Las células se fijaron en PBS suplementado con mM MgCl 2
2, EGTA 2 mM, y 4% de formaldehído, se permeabilizaron en PBS que contenía 0,5% de Triton X-100, se incubaron con p-paxillin anticuerpo (Señalización Celular; 1: 1000) y visualizado con anti-conejo anticuerpos secundarios conjugados Alexa-(Invitrogen). Los núcleos se tiñeron con DAPI.
Rac1 /RhoA ensayo de activación de
RhoA /ensayos de activación de Rac1 se realizaron como se describe por el fabricante (Cell Biolabs, Inc., San Diego, CA). Brevemente, las células fueron cultivadas a 50-70% de confluencia, se trataron con FBS durante 30 min y se transfectaron con ARNsi 72 h antes de la cosecha. Las muestras de control se incubaron con GTP? S. cantidades equivalentes de proteína se incubaron con PAK1-PBD agarosa o Rhotekin-PBD agarosa (Millipore, Billerica, MA) durante 1 hora a 4 ° C. Las perlas de agarosa conjugada se lavaron 3 veces en PBS y se hirvieron en tampón de muestra SDS-PAGE. La inmunotransferencia se realizó con anticuerpos primarios que detectan Rac1 (BD Biosciences, 1: 1000) y RhoA (señalización celular; 1: 1000).
Resultados
señalización mTORC2 se incrementa en los cánceres de vejiga humanos invasivos
de bajo grado no invasiva (LG) UCa se define por papilares revestidos por epitelio urinario con la polaridad retenido y sólo una mínima atipia citológica (Figura 1A). Esto se correlaciona con la histología mutaciones frecuentes en
FGFR3
y
RAS
[21]. Por el contrario, no invasivo de alto grado (HG) UCa muestra agrandamiento nuclear, hyperchromasia, y la pérdida de la polaridad que se asocia comúnmente con mutaciones en
TP53
y
RB
genes (Figura 1B) . En un subgrupo de casos HG UCA, se observa un comportamiento invasor (Figura 1C) y esto se asocia con resultados empeorado. Se evaluó la actividad mTORC2 en muestras de LG UCA, HG UCA, y HG UCa con la invasión mediante la determinación de la fosforilación de AKT en Ser473 (p-Ser473). Inmunotransferencia sugirió un aumento de p-Ser473 en no invasiva HG UCa en comparación con lesiones LG (Figura 1D) y un aumento adicional de p-Ser473 en lesiones invasivas HG. Se realizó la comparación de densitometría p-Ser473 relaciones AKT /total, con resultados normalizados para no invasiva LG UCa (Figura 1E). A pesar del pequeño número de muestras impidió significación estadística, p-Ser473 se observó también en las patologías más avanzadas.
Se comparó
Un
, papilar de bajo grado no invasivo UCa (no inv LG ; barra de escala 80 micras);
B Opiniones, papilar no invasivo de alto grado UCa (no inv HG; barra de escala 80 micras); y
C
, de alto grado invasivo para determinar la actividad UCa mTORC2 (barra de escala 100 micras).
D
, inmunotransferencia para p-Ser473 como un marcador de la actividad mTORC2 se realizó y muestra la actividad mTORC2 mayor en tanto HG no invasivo y lesiones invasivas.
E
, se utilizó para cuantificar la densitometría p-Ser473 /total de las intensidades de señal AKT; promedios y error estándar de la media (SEM) se normalizaron a la intensidad de la señal promedio para las muestras LG no invasivos.
mTORC1 y mTORC2 se activan en las células malignas del cáncer de vejiga
Se comparó mTORC1 y mTORC2 señalización en las células hTERT-inmortalizadas normales urotelial (HU1) [22], las células RT4 papiloma derivados de la vejiga benignos y en UMUC-3, las células del cáncer de vejiga T24, y J82 invasivos. actividad mTORC1 se determinó midiendo la fosforilación de la p70 S6 quinasa (p-S6), mientras que la actividad mTORC2 se determinó mediante los niveles de p-AKT Ser473. En condiciones de línea de base, en medio que contiene suero, las células HU1 y RT4 mostraron bajos niveles de fosforilación de AKT en la treonina 308 (p-Thr308), que refleja la activación de PI3K y PDK1 aguas arriba de AKT (Figura 2A). p-Ser473 y p-S6 también fueron bajos en las células HU1 y RT4. Las tres líneas celulares de cáncer de vejiga malignas demostraron aumento de los niveles de p-Thr308, p-S6, y p-Ser473.
Un
, inmunotransferencia muestra mayor mTORC1 (p-S6) y mTORC2 (p -Ser473) la actividad en maligno UMUC-3, T24 y células de cáncer de vejiga J82, en comparación con las células normales urotelial HU1 y células RT4 benignas.
B Opiniones, estimulación inducida por la actividad mTORC2 suero en las células malignas de cáncer de vejiga. señalización mTORC1 era sensible a la rapamicina en este modelo; mTORC2 no lo era.
A continuación se evaluó mTORC1 y la actividad mTORC2 en células de cáncer de vejiga que se hicieron quiescentes por privación de suero y después se estimularon mediante la adición de suero (Figura 2B). En las células RT4, p-Ser473 fue apenas detectable antes y después de la estimulación con suero. En las células T24 y J82, p-Ser473 fue mínimo después de la privación de suero, pero aumentó considerablemente tras la adición de suero. UMUC-3 células demostraron p-Ser473, incluso después de la privación de suero y un modesto aumento de la p-Ser473 después de la adición de suero. Estos resultados sugieren que mTORC2 se activa en respuesta a la estimulación con suero en células de cáncer de vejiga invasivo. En contraste, p-S6 incrementa en respuesta a la estimulación en suero en benigna, así como células de cáncer de vejiga malignas. rapamicina dosis baja (10 nM), un inhibidor de la mTORC1, bloqueado selectivamente p-S6 y tenía poco o ningún efecto sobre la actividad mTORC2 [9].
En experimentos de tiempo en las células J82, la actividad aumentó rápidamente después de mTORC2 la estimulación de suero y se mantuvo durante al menos 6 h en cultivo (Figura 3A). La cinética de mTORC2 activación y desactivación (p-Ser473) fueron similares a las identificadas para mTORC1 (p-S6). Para confirmar que el p-Ser473 actividad mTORC2 reflejado específicamente, silenciados Rictor en las células J82 utilizando agrupado siRNA. Como se muestra en la Figura 3B, Rictor la silenciación del gen era eficaz y completamente ablación fosforilación del residuo Ser473 de AKT en respuesta al suero. La fosforilación de la diana mTORC1, S6, no se vio afectada, lo que demuestra la especificidad en el caso de silenciamiento. No director de control (NTC) siRNA no alteró los niveles Rictor o respuesta a la estimulación con suero. Se obtuvieron resultados similares en experimentos con células T24 (resultados no mostrados). Estos hallazgos demuestran Rictor eficaz silenciamiento de genes y una reducción asociada en la señalización mTORC2.
Un
, la estimulación con suero en las células J82 muestra altos niveles de mTORC2 (p-Ser473) la actividad en un 5 minutos que persiste a 6 h.
B
, Rictor la silenciación del gen usando agrupado siRNA reduce drásticamente proteína Rictor detectable y ablación de p-Ser473 relativa a la observada en células transfectadas con siRNA NTC. No se detectó ningún efecto sobre mTORC1 de señalización (p-S6).
mTORC2 es un regulador crítico de la migración celular y la invasión en el cáncer de vejiga
Se utilizó un ensayo de arañazos heridas modificado para evaluar la migración celular en células de cáncer de vejiga T24 que fueron transfectadas con NTC o siRNA-Rictor específica (Figura 4A). El sustrato era recubiertos de fibronectina. En las células transfectadas con siRNA NTC, no se observó migración sustancial sólo en la presencia de suero. Rictor-siRNA invirtió los efectos del suero sobre la migración celular. Figura 4B resume los efectos de Rictor-silenciamiento en la migración de células T24 como una función del tiempo. Estadísticamente disminuciones significativas en la migración de células se asociaron con Rictor la silenciación del gen 10-24 h. Resultados similares se obtuvieron cuando Rictor fue silenciado en las células J82 y se estudió la migración celular (resultados no mostrados).
Un
, la privación de suero bloqueado J82 vejiga motilidad de las células del cáncer. La adición de suero indujo la migración robusta de las células J82 que fueron transfectadas con siRNA NTC, tal como se determina usando un ensayo de cero modificado. La migración se inhibió por Rictor la silenciación del gen. La barra de escala 100 micras.
B
, la cuantificación muestra una reducción de la distancia de migración de las células transfectadas con siRNA-Rictor específico (□) en comparación con las células transfectadas con siRNA NTC (▲). También se muestran las células que no eran estimulada por suero (♦). Un total de 6 cuadros fueron analizados para cada punto de tiempo por condición.
C
, transwell invasión en las membranas recubiertas con Matrigel muestra un mayor número de células de cáncer de vejiga malignas que invaden. D, Rictor silenciamiento de genes reduce significativamente la invasión de células de las tres líneas celulares de vejiga malignas en transwell ensayo. (*) Estadísticamente significativa comparación utilizando la t de Student, p. & Lt; 0,05) guía empresas
invasión de células de cáncer de vejiga se estudió inicialmente utilizando reconstituido Matrigel en cámaras de Boyden. Cada una de las tres líneas celulares de cáncer de vejiga malignas demostrado un aumento significativamente invasión a través de Matrigel, en comparación con las células RT4 no malignos (Figura 4C). Rictor silenciamiento de genes redujo significativamente la invasión de las células de cáncer de vejiga malignas (Figura 4D). En J82 células, invasión se inhibió en más de un 80%. La eficacia de Rictor silenciamiento de genes sugiere que mTORC2 puede ser un objetivo importante para inhibir la invasión de cáncer de vejiga.
vejiga humana pared de la invasión de las células del cáncer de vejiga requiere mTORC2
Para apoyar aún más nuestra hipótesis de que mTORC2 puede ser crítico en la regulación de la invasión de células de cáncer de vejiga, hemos desarrollado una novela
ex vivo
sistema modelo para probar la invasión de la pared normal de la vejiga. secciones de espesor completo de la vejiga humano adulto que incluía la lámina propia (LP; fibroblastos con predominio de tejido conectivo con vasos sanguíneos), muscularis propria (MP; densos haces de músculo liso) y grasa peri-vesical (grasa PV; tejido principalmente fibroadiposo y capilares ) fueron anclados en agar y se bañó en medio de cultivo celular (Figura 5A). Sembramos estas preparaciones con células J82 maligna con fluorescencia marcado y permitimos que estas células penetran la pared de la vejiga durante 72 h. células J82 que fueron sometidos a la silenciación del gen Rictor o tratados con NTC siRNA también se inocularon en las preparaciones de la pared de la vejiga. células invasoras fueron identificados fácilmente por microscopía de luz (Figura 5B). Tinción inmunohistoquímica para pancitoqueratina (citoqueratina AE1 /3) confirmó que las células invasoras eran de origen epitelial (Figura 5C). imagen fluorescente de células invasoras se muestra la figura 5D. Se observó un aumento significativo en la invasión cuando se compararon las células J82 malignas con células RT4 (p & lt; 0,05; figura 5E). Rictor silenciamiento de genes en las células J82 redujo significativamente la profundidad invasiva (Figura 5F), lo que indica un papel esencial en la regulación de mTORC2 la invasión de células J82 en nuestro
ex vivo
sistema modelo humano.
Una
, esquemático que muestra la orientación de ensayo de invasión de la pared de la vejiga humana que incluye lámina propia (LP), muscular propia (MP) y la grasa perivesical (grasa PV). B, H & amp; E sección que muestra la invasión de las células J82 en la lámina propia después de 72 h (barra de escala a 200 micras)
C
, celdas resaltadas en el panel anterior mostraron inmunotinción positiva para pancytokeratin (barra de escala 100 micras).
D
, tinción de inmunofluorescencia muestra invasión de las células malignas J82 (rojo), a las 72 horas (barra de escala 50 micras).
E
, la cuantificación de la invasión tisular por las células RT4 y J82 (micras).
F
, Rictor silenciamiento de genes inhibe significativamente la invasión de la vejiga todo por las células J82. (*) Comparación estadísticamente significativa utilizando la t de Student, p. & Lt; 0,05) guía empresas
Rac1 es un efector aguas abajo de mTORC2 en células de cáncer de vejiga
A continuación, examinó los efectos de Rictor silenciamiento de genes en células J82 difusión. Las células que fueron transfectadas con siRNA NTC y permitir que se extienda en la fibronectina mostraron amplias extensiones citoplasmáticas y un aspecto morfológico aplanado (Figura 6A). Por el contrario, Rictor silenciamiento génico produjo células ovoides más pequeños que no pudieron propagarse. Cuantificación de la superficie cubierta por células adherentes confirmó que Rictor silenciamiento de genes significativamente atenuada propagación de las células J82 (Figura 6B). A continuación utiliza J82 células para evaluar la fosforilación de paxillin, que regula la formación de adhesión focal y la rotación y puede regular la formación lamellipodium [23]. Rictor la silenciación del gen redujo el nivel de fosfo-paxillin en células J82 malignos respecto a las células transfectadas NTC. Análisis de la activación de Rac1 en células J82 mostró una reducción sustancial en el nivel de carga-GTP (activado) Rac1 (Rac1-GTP) cuando fue silenciado Rictor (Figura 6D). Densitometría mostró que desmontables Rictor redujo los niveles de Rac1 al 60,2% de las células que expresan Rictor. Por el contrario, RhoA-GTP activada fue moderadamente disminuyó en un silenciamiento Rictor, con caída Rictor reducción de la actividad de RhoA al 83,3% de las células que expresan Rictor (Figura 6E).
células J82 fueron o bien transfectadas con siRNA-Rictor específico o NTC siRNA 72 h antes del inicio del experimento.
Un
, la tinción de inmunofluorescencia muestra amplios procesos citoplásmicos y periférica fosfo-paxillin en las células que son transfectadas con siRNA NTC. Este se reduce en las células con Rictor la silenciación del gen. La barra de escala de 30 micras.
B Opiniones, áreas de la superficie celular se determinaron para J82 células transfectadas con NTC (♦) o-Rictor siRNA (▲) y permitir que se extienda durante los tiempos indicados (media ± SEM, n & gt; 15 por cada hora punto; (*) p & lt; 0,05).
C
, inmunotransferencia para fosfo-paxillin en células J82 que fueron transfectadas con-Rictor específico o NTC siRNA y se dejaron adherir durante 30 min.
D
, GTP-Rac1 se determinó en células J82 transfectadas con siRNA NTC o Rictor-específica. Rictor caída redujo los niveles de Rac1 al 60,2% del control. Las células con GTPºS se analizaron como un control positivo y el PIB como control negativo.
E
, GTP RhoA cargado en células J82 transfectadas con Rictor específico o NTC siRNA. Rictor caída redujo los niveles de RhoA al 83,3% del control.
Discusión
En el cáncer de vejiga, invasión local en la muscular propia (músculo detrusor) es un determinante importante de pronóstico y posterior del paciente terapia. Vías de señalización que están involucradas de forma única en la invasión de células de cáncer de vejiga debe ser los principales objetivos para el desarrollo de la terapéutica. Sin embargo, comúnmente se describen alteraciones genéticas y de señalización en el cáncer de vejiga no se han considerado en el contexto de la invasión. HG UCA, que se desarrolla un comportamiento invasor en un subgrupo de pacientes, a menudo alberga mutaciones en
TP53
y
RB
. Las mutaciones y /o pérdida de estos oncogenes se han implicado en la regulación del ciclo celular defectuoso [21]. Las alteraciones de la fosfatasa y tensina homólogo (PTEN) lípido /proteína fosfatasa se han demostrado en aproximadamente el 30% de los pacientes con cáncer de vejiga y abarcar deleción homocigota del gen, la pérdida de heterocigosidad (LOH), y la mutación de genes [24]. Sin embargo, el impacto final de
PTEN
en cascadas de señalización corriente abajo como mTORC2 en la invasión del cáncer de vejiga no está claro.
En este estudio, se demostró que la actividad mTORC2 se correlaciona con el grado del cáncer de vejiga humano y la invasión. A nivel mecánico, mTORC2 controla las células del cáncer de vejiga difusión, la migración y la invasión de Matrigel. mTORC2 también regula la invasión del cáncer de vejiga en una novela
ex vivo
modelo de vejiga humana que captura el complejo microambiente de la pared de la vejiga. El aumento de la actividad mTORC2 en la activación de Rac1, que es conocido por promover la propagación de células y la migración [25]. Estos resultados sugieren que activado mTORC2 puede constituir un elemento de señalización crítica y objeto de orientación en la invasión del cáncer de vejiga.
mTORC2 representa uno de los dos brazos de señalización de la cascada de mTOR. mTORC2 existe como un complejo que incluye mTOR y mLST8 y se distingue de la mTORC1 por la presencia de Rictor, PROTOR y mSIN1 [26]. En contraste con el complejo mTORC1 que regula la traducción en respuesta al nutriente de estado y factores de crecimiento, mTORC2 controla los procesos que requieren citoesqueleto remodelación, tales como la propagación de células y la migración. mTORC2 puede ser activado por PI3K estimulada por la insulina, que promueve la asociación de mTORC2 con ribosomas [27,28]. monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) y glucógeno sintasa quinasa-3β inhiben la activación mTORC2 [16,29].
Una vez activado, fosforila Ser473 mTORC2 en AKT, que ha sido propuesto para regular la actividad de AKT y la estabilidad [30]. se informa de la familia Rho GTPasas de funcionar como principales efectores de mTORC2 [10,12,17,31]. la migración de neutrófilos hacia quimioatrayentes está regulada por mTORC2 por un mecanismo que implica MyoII y regulación de la actividad de RhoA [32]. En las células de cáncer de colon, Rictor la silenciación del gen induce transición mesenquimal-epitelial (MET) e inhibe la motilidad celular por efectos tanto en RhoA y Rac1 [10]. Mientras que la reducción de la E-cadherina se ha reportado en las líneas de células malignas UMUC-3, [6], desmontables de Rictor en nuestro modelo de sistema no parece líneas de células J82 y T24 relativos a las células RT4 para revertir este fenotipo (datos no mostrados).
En nuestros experimentos con células de cáncer de vejiga J82, Rictor silenciamiento de genes sustancial disminución de la activación de Rac1 mientras que tener un efecto más modesto sobre RhoA. En muchos sistemas de células, existen vías para regular Rac1 y RhoA recíprocamente [33]. Por lo tanto, incluso una modesta disminución en la activación de RhoA en asociación con Rictor la silenciación del gen puede ser importante en las células de cáncer de vejiga. Los efectos marcados de silenciamiento Rictor en la propagación celular, la migración y la invasión son consistentes con nuestros resultados bioquímicos sugieren que Rac1 es importante objetivo de mTORC2 en el cáncer de vejiga. Una advertencia es que downdown Rictor también reduce p-Ser473, lo que puede inducir cambios descendentes adicionales en la señalización de AKT que podrían afectar a la invasión independiente de la actividad GTPasa Rho.
Al comparar la activación mTORC2 en líneas celulares de cáncer de vejiga, se encontró que UMUC-3 células fueron únicos en que detectable p-Ser473 se presente incluso en ausencia de suero. El aumento en el nivel basal de p-Ser473 en UMUC-3 células más probablemente refleja la deleción homocigótica del gen de nulo
PTEN
en estas células [9,34], lo que elimina un importante supresor de la señalización de mTOR. UMUC-3 células pueden representar un modelo para las células de cáncer de vejiga en la que
PTEN
está mutado. Los cánceres con
PTEN
deleción o mutación son con frecuencia resistentes a los agentes contra el cáncer dirigidos que funcionan aguas arriba de PTEN como aquellos contra el factor de crecimiento epidérmico receptor [35]. Las células T24 y J82 pueden ser modelos de cáncer de vejiga que se produce en ausencia de
PTEN
mutación preferidos. Estas células demostraron niveles esencialmente no detectables de P-Ser473 en ausencia de suero y fuerte estimulación de la actividad mTORC2 cuando se añadió suero.
La participación de Rac1 como un objetivo principal de aguas abajo mTORC2 en la regulación de la invasión del cáncer de vejiga puede vincular un número de hallazgos recientes en la literatura. Un estudio mostró que Rac1 regula la invasión de células de cáncer de vejiga y reorganización de la actina aguas abajo de la integrina-quinasa vinculada (CIC) [36]. Otro grupo ha informado de que Rictor puede interactuar físicamente con la ILK [37] para inducir la fosforilación de AKT en Ser473, lo que representa una firma-mTORC2 específico. Rac1 ha informado de interactuar directamente con mTOR de una manera GTP-independiente [38].
En conclusión, nuestros estudios demuestran que mTORC2 es un regulador crítico de la migración del cáncer de vejiga y la invasión, con efectos mediados principalmente a través de Rac1.