Extracto
CD133 (prominin-1), una glicoproteína transmembrana-5, recientemente se ha considerado ser un marcador importante que representa la población subconjunto de células madre, como el cáncer. Aquí nos presenta el aislamiento de células CD133 positivas (LC-CD133
+) y células CD133-negativos (LC-CD133
-) a partir de muestras de tejido de cada diez pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas (LC) y cinco líneas de células LC. LC-CD133
+ representada mayores Oct-4 expresiones con la capacidad de auto-renovación y puede representar un depósito con potencial de proliferación para la generación de células de cáncer de pulmón. Por otra parte, LC-CD133
+, a diferencia de LC-CD133
-, altamente co-expresó el múltiplo ABCG2 marcador resistente a los medicamentos y mostró una resistencia significativa a los agentes de quimioterapia (por ejemplo, cisplatino, etopósido, doxorrubicina y paclitaxel) y radioterapia. El tratamiento de Octubre-4 siRNA con el vector lentiviral puede bloquear específicamente la capacidad de LC-CD133
+ para formar esferas y puede facilitar aún más LC-CD133
+ para diferenciarse en LC-CD133
-. Además, knock-down de Octubre-4 expresión en LC-CD133
+ puede inhibir significativamente la capacidad de invasión tumoral y la formación de colonias, y aumentar las actividades apoptóticas de la caspasa 3 y poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP). Por último,
in vitro
y
in vivo
estudios confirman además que el efecto del tratamiento con quimiorradioterapia para LC-CD133
+ se puede mejorar mediante el tratamiento de Octubre-4 siRNA. En conclusión, hemos demostrado que la expresión de Octubre-4 desempeña un papel crucial en el mantenimiento de las propiedades de auto-renovación, cáncer madre-como, y chemoradioresistant de LC-CD133
+. La investigación futura se justifica en cuanto a la expresión regulada de arriba Oct-4 en LC-CD133
+ y el cáncer de pulmón maligno
Visto:. Chen YC, Hsu SA, Chen YW, Tsai TH, ¿Cómo CK, Wang CY, et al. (2008) Oct-4 Expresión Mantenido madre, como el cáncer de propiedades en células CD133-positivo-Derivados del cáncer de pulmón. PLoS ONE 3 (7): e2637. doi: 10.1371 /journal.pone.0002637
Editor: Usted Ming, de la Universidad de Washington, Estados Unidos de América
Recibido: 17 Marzo, 2008; Aceptado: June 8, 2008; Publicado: 9 Julio 2008
Derechos de Autor © 2008 Chen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas de investigación del Consejo Nacional de Ciencias (NSC-96-3111-B-075-001-MY3, 95-2314-B-075-055-MY2 96-2628-B-010-006-MY3, 96 -2314-B-075-024), el hospital general de Veteranos de Taipei (V96C1-151, V96E1-004, V96ER2-016, V96E2-010), los proyectos conjuntos de UTVGH (VGHUST96-P1-07), Yen-Ling-Tjing Fundación médica, hospital de la ciudad de Taipei (96001-62-014, 96001-62-018, 96002-62-092), y la Universidad Nacional Yang-Ming (Ministerio de Educación, apunte para el plan Universitario Top), Taiwán.
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es una de las principales causas de muerte por cáncer en los países industrializados [1], [ ,,,0],2]. La radioterapia y la quimioterapia juegan papeles importantes y cruciales en el tratamiento clínico contra el cáncer de pulmón para lograr una supervivencia prolongada del paciente [3], [4]. Sin embargo, una alta tasa de fracaso y la tasa de supervivencia media baja se observan en los pacientes sometidos a quimioterapia con recurrente, cáncer de pulmón intratable [5]. Para mejorar la tasa de supervivencia de los pacientes, la investigación para dilucidar el mecanismo de la tumorigénesis se necesita de cáncer de pulmón [5]. Los datos recientes han demostrado que los tumores contienen una pequeña subpoblación de células, es decir, las células cancerosas madre-como (CSC) o células iniciadoras del cáncer (AIC), que presentan una capacidad de auto-renovación y son responsables del mantenimiento del tumor y la metástasis [6] . Las células madre se han aislado por su capacidad de flujo de salida colorante Hoechst 33342 y se refiere como la "población lateral (SP)" [7]. Ho y sus colegas aislaron y caracterizaron células SP de seis líneas celulares de cáncer de pulmón humano y demostraron que una expresión elevada de ABCG2, así como otros transportadores de casete de unión a ATP se correlacionó positivamente con la resistencia a múltiples fármacos quimioterapéuticos [8]. Además, Gutova y sus colegas han CSC uPAR-positivas purificadas a partir de líneas celulares de cáncer de pulmón de tres. Estos uPAR de células positivas co-expresada con CD44 y MDR1, y tenía la capacidad de promover la malignidad avanzada y quimio-resistencia [9].
CD133 (prominin-1), una glicoproteína transmembrana-5, fue reconocido por primera vez en CD34
+ poblaciones progenitoras de la sangre de adultos, la médula ósea y células de hígado fetal [10]. Recientemente, CD133 ha sido considerada como un marcador importante para representar a la población de células madre cancerosas subconjunto de leucemia, tumores cerebrales, retinoblastoma, tumores renales, tumores de páncreas, carcinoma de colon, carcinoma de próstata, y carcinoma hepatocelular [11] - [19]. Sobre la base de hallazgos inmunohistoquímicos, Hilbe y colegas sugirieron que las células progenitoras CD133 positivas (CD133
+) juegan un papel en el desarrollo de la vasculatura del tumor en pacientes con cáncer de pulmón no de células pequeñas (NSCLC) [20]. Más recientemente, un estudio bien diseñado por Eramo y sus colegas mostraron que el cáncer de pulmón contiene una población de CD133
+ células madre cancerosas capaces de auto-renovarse y generar una progenie ilimitado de células no tumorigénicas. Estos CD133
+ células también son resistentes a la quimioterapia convencional [21]. Sin embargo, los mecanismos de regulación de genes en el mantenimiento de la auto-renovación y propiedades resistentes a los fármacos en las células madre putativa, como el cáncer de tumores de pulmón aún no están claros.
Oct-4, un miembro de la familia de dominio POU factores de transcripción, se expresa en células madre pluripotentes embrionarias (eS) y las células germinales [22] - [23]. Oct-4 mRNA se encuentra normalmente en las células madre totipotentes y pluripotentes de embriones pregastrulation [24]. La anulación de la
Oct-4
gen en ratones provoca letalidad antes de tiempo debido a la falta de formación de ICM, lo que indica que Oct-4 tiene una función crítica para la auto-renovación de células madre embrionarias [25]. Oct-4 activa la transcripción a través de motivos octamer, y sitios de unión Oct-4 se han encontrado en varios genes, incluyendo
FGF 4 gratis (factor de crecimiento de fibroblastos 4) y
PDGF
α
r gratis (derivado de plaquetas receptor del factor de crecimiento α) [26], [27]. Esto sugiere que Oct-4 funciona como un interruptor maestro durante la diferenciación mediante la regulación de los potenciales pluripotentes de las células madre, y Oct-4 juega un papel fundamental en el desarrollo de los mamíferos [24], [25].
En este estudio, las células CD133 positivas (LC-CD133
+) y células CD133-negativos (LC-CD133
-) fueron aisladas de muestras de tejido de cáncer de pulmón (LC) de los pacientes y las líneas celulares de LC. Estos LC-CD133
+ células poseían tanto las características de las células madre similares y tumores malignos. Nuestros datos demuestran además que Oct-4 expresión en LC-CD133
+ participa en la malignidad del tumor de cáncer de pulmón y exhibe propiedades refractarias de la quimiorradioterapia en las células madre, como el cáncer. Estos resultados sugieren que la expresión de Octubre-4 desempeña un papel crucial en el mantenimiento de las propiedades del cáncer de tallo y como chemoradioresistant en CD133
derivados de las células del cáncer de pulmón +.
Materiales y Métodos
aislamiento de CD133
+ Móvil subconjunto
Esta investigación siguió los principios de la Declaración de Helsinki y se obtuvieron muestras de todos los pacientes tras el consentimiento informado. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética Institucional /Junta de Revisión Institucional de Taipei el Hospital General de Veteranos. Las células disociadas a partir de las muestras de los pacientes no pequeñas de cáncer de pulmón de células (Tabla 1) y el cáncer (LC) líneas de células pulmonares se marcaron con 1 ml CD133 /l perlas micromagnéticas por 1 millón de células utilizando el kit de aislamiento de células CD133 (Miltenyi Biotech , Auburn, CA). CD133
+ células se cultivaron en un medio que consiste en DMEM /F12 libre de suero (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD), suplemento N2 (amp I +; D Systems Inc., Minneapolis), 10 ng /ml de bFGF recombinante humano ( R & amp; D Systems) y 10 ng /ml de EGF (R & amp;.; D Systems) [28]
Viabilidad de las células Determinado por ensayo colorimétrico
El aislado CD133
+ y CD133
- células se cultivaron en un clúster de cultivo celular de 96 pocillos (Corning Costar, Acton, MA) a una densidad de 3 x 10
3 células /pocillo con medio de cultivo 100 l. En los puntos de tiempo específicos durante el cultivo, el medio se desecha y se reemplaza con un volumen igual (100 l) de medio fresco que contiene 0,2 mg /ml de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil ) -2- (4-sulfofenil) 2H-tetrazolio (MTS, Promega, Madison, WI) y 0,038 mg /ml de metosulfato de fenazina (PMS; Promega) y se incubaron durante 1,5 horas adicionales en 37 ° C 5% de CO
2. La viabilidad celular proporcional a la densidad óptica (DO) se midió por ensayo colorimétrico en términos de actividad mitocondrias para convertir la sal de tetrazolio en un producto formazan soluble de color en el medio. Los valores de DO se midieron a la longitud de onda de 490 nm con un contador VICTOR 1420 Multilabel de Wallac (PerkinElmer Wallac, Turku, Finlandia).
En tiempo real de transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR)
en tiempo real el análisis RT-PCR, el ARN total de las células se extrajo utilizando el ARN
kit de fácil (Qiagen, Valencia, CA). Brevemente, el ARN total (1 g) de cada muestra se transcribió inversamente en 20 l utilizando 0,5 g de oligo dT y 200 U Superscript II RT (Invitrogen, Carlsbad, CA). La amplificación se llevó a cabo en un volumen total de 20 l que contenía 0,5 mM de cada cebador, MgCl 4 mM
2, 2 l LightCycler FastStart DNA Maestro SYBR Green I (Roche Diagnostics, Pleasanton, CA) y 2 l de 1: 10 cDNA diluido. La cuantificación de las muestras desconocidas se realizó por LightCycler Software cuantificación relativa, versión 3.3 (Roche Diagnostics). En cada experimento, el gen GAPDH limpieza fue amplificado como un estándar de referencia. GAPDH primers fueron diseñados: GAPDH (f): GCCAAAAGGGTCATCATC (nt 448-465, nº de acceso NM_002046 GenBank.), GAPDH (r): ATGACCTTGCCCACA GCCTT (nt 745-765), Oct-4 bis (f): CGCAAGCCCTCATTTCAC (nt 5- 22, nº de acceso NM_002701 GenBank), Oct-4 bis (r):. CATCACCTCCACCACCTG (nt 98-115, GenBank adhesión no NM_002701).. Las reacciones de PCR se prepararon por duplicado y se calienta a 95 ° C durante 10 minutos seguido por 40 ciclos de desnaturalización a 95 ° C durante 10 segundos, hibridación a 55 ° C durante 5 segundos, y extensión a 72 ° C durante 20 segundos. Todas las reacciones de PCR se realizaron por duplicado. Las curvas de calibración (valores de umbral de ciclo frente a la concentración de plantilla) se prepararon para cada gen diana y para la referencia endógena (GAPDH) en cada muestra.
La tinción de inmunofluorescencia de marcadores de células madre
Un avidina-biotina complejo método se utilizó para la tinción de inmunofluorescencia en el esferoide diferenciado y celular neuronal similar. En resumen, las células se sembraron en cubreobjetos de vidrio con poli-L-ornitina-revestido y se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 15 a 20 minutos a temperatura ambiente, y luego se lavaron dos veces (10 minutos cada uno) con 1 x PBS. Las células se permeabilizaron con 0,1% Triton X-100 /PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente, y después dos veces (10 minutos cada uno) con 1 x PBS. Las células se bloquearon entonces con solución durante 30 minutos de bloqueo y se incubaron con anticuerpos primarios (OCT-4, Chemicon, Temecula, CA) durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, lavaron las células tres veces (10 minutos cada uno) con 1 × PBS. señales inmunorreactivas se detectaron con una mezcla de conejo biotinilado anti-ratón IgG y Fluorsave (Calbiochem, San Diego, CA). Las células se sondaron adicionalmente con isotiocianato de fluoresceína (FITC)-etiquetados anticuerpos secundarios. Las imágenes de fluorescencia se visualizaron con un microscopio de fluorescencia. Para analizar cuantitativamente la intensidad de fluorescencia, se registraron imágenes con un microscopio de fluorescencia invertido equipado con una cámara CCD. El porcentaje de la señal de fluorescencia por campo fotografiado fue analizada por el software de procesamiento de imágenes (Image Pro-Plus, MediaCybernetics, Inc., Silver Spring, MD).
Análisis FACS
Para la identificación de marcadores de superficie celular , una suspensión de células de sexto a octavo células-pasaje de esferas tripsinizadas se tiñó con anti-CD133, CD117 (c-Kit), o ABCG2 y fluoresceína secundario (FITC) -o ficoeritrina (PE) anticuerpos -junto (Dako, Carpinteria). Las células fueron fijadas con paraformaldehído al 2% y se analizaron con un aparato FACSCalibur BD (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ).
El tratamiento con radiación para el análisis de viabilidad de la célula
La radiación gamma ( irradiación ionizante; IR) fue entregado por una unidad de cobalto Theratronic T-1000 (Theratronic International, Inc., Ottawa, Canadá) a una tasa de dosis de 1.1Gy /min (SSD = 57.5cm). Para evaluar la tasa de proliferación de las células que sembraron las células en placas de 24 pocillos a una densidad de 2 × 10
4 células /pocillo. Las células se sembraron 24 horas después de IR y luego se analizaron por methyle tiazol ensayo de tetrazolio (ensayo MTT, Sigma-Aldrich, St. Louis, MN). La cantidad de MTT formazon producto se determinó mediante el uso de un lector de microplacas y la absorbancia se midió a 560 nm (SpectraMax 250, Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
quimioterapéuticos Agentes
cisplatino, etopósido (VP16), y paclitaxel se obtuvieron de Sigma-Aldrich y se disolvieron en DMSO (Sigma-Aldrich) en 100 mM de solución madre.
In Vitro
de Análisis de la invasión y de colonias en agar suave Ensayo
se utilizó el sistema Transwell placa de 24 pocillos con una 8-m membrana de filtro de tamaño de poro de policarbonato (Corning Costar, Corning, NY). La membrana de filtro se revistió con Matrigel (BD Biosciences, San Diego) se diluyó con medio libre de suero y se incubaron durante la noche a 37 ° C. Las suspensiones de células se sembraron en el compartimiento superior de la cámara Transwell en la densidad celular de 1 × 10
5 en 100 l de medio libre de suero. Después de 24 horas, el medio se retiró y la membrana de filtro se fijó con formalina al 4% durante 1 hora. La superficie opuesta de la membrana de filtro hacia la cámara inferior se tiñeron con Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich) durante 3 minutos y las células migradas se visualiza entonces en un microscopio invertido. El protocolo de ensayo de colonias en agar blando se describe como sigue. Cada pocillo (35 mm) de una placa de cultivo de seis pocillos se revistió con 2 ml de mezcla de agar inferior (DMEM, 10% (v /v) de FCS, 0,6% (w /v) de agar). Después de que la capa inferior solidificó, 2 ml de mezcla de agar-medio superior (DMEM, 10% (v /v) de FCS, 0,3% (w /v) de agar) que contiene 2 × 10
se añadió 4 células, y los platos eran se incubaron a 37 ° C durante 4 semanas. Las placas se tiñeron con 0,5 ml de 0,005% de cristal violeta durante 1 hora y luego un microscopio de disección se utilizó para contar el número de colonias [29].
mediada por RNAi Lentiviral
El vector pLVRNAi y Pcdh-MCS1-EF1-copGFP vector se adquirieron de Biosettia Inc. (Biosettia, San Diego, CA). El método de clonación de la secuencia de doble cadena shRNA se describe en el protocolo del fabricante. El oligonucleótido 5'-siRNA CCGGCCCTCACTTCACTGCACTGTACTCGAGTACAGTGC AGTGAAGTGAGGGTTTTT-3 'de orientación humana Oct-4 (NM_002701, NT 1035-1055) se sintetizó y se clonó en pLVRNAi para generar un vector de expresión lentiviral. La Oct-4 cDNA se amplificó y se purificó mediante RT-PCR y se clonó en un vector Pcdh-MCS1-EF1-copGFP. producción Lentiviral hecho por la transfección de células 293T utilizando Lipofectamine 2000 (LF2000, Invitrogen). Se recogieron los sobrenadantes 48 horas después de la transfección y luego se filtraron; los títulos virales se determinaron luego por FACS a las 48 horas después de la transducción. células subconfluentes se infectaron con lentivirus a una multiplicidad de infección de 5 en presencia de 8 ìg /ml de polibreno (Sigma-Aldrich).
In Vivo
Análisis de crecimiento tumoral y metástasis
Todos los procedimientos con animales estaban en conformidad con las directrices de bienestar animal institucionales de Taipei el hospital general de Veteranos. 1000, 3000, y 10
4 células se inyectaron en la vena de la cola de ratones SCID y /o ratones desnudos (cepa BALB /c) cada uno de 8 semanas. En las imágenes GFP vivo se visualiza y se mide mediante un dispositivo de iluminación (LT-9500 Illumatool TLS equipado con excitación fuente de iluminación [470 nm] y la placa de filtro [515 nm]). El tamaño del tumor se midió con calibres y se calculó el volumen del tumor según la fórmula (longitud x anchura
2) /2. La densidad óptica integrada de la intensidad de fluorescencia verde fue capturado y luego analizada por Image Pro-Plus Software [29].
Análisis estadístico
Paquete Estadístico de Ciencias Sociales de software (versión 13.0) (SPSS, Inc., Chicago, IL) fue utilizado para el análisis estadístico. de Student independiente
t-test
o ANOVA se utilizó para comparar las variables continuas entre los grupos, mientras que se aplicó la χ
2 test para la comparación de variables dicotómicas. La estimación de Kaplan-Meier se utilizó para el análisis de supervivencia, y se utilizó la prueba de log-rank para comparar las duraciones de supervivencia acumulada en diferentes grupos de pacientes. El nivel de significación estadística se fijó en 0,05 para todas las pruebas.
Resultados
El aislamiento y la caracterización de las células CD133 positivas derivadas de pulmón, cáncer
Utilizando el método de cuentas magnéticas, aislamos CD133
+ células (Fig. 1A) a partir de muestras de tejido de diez cáncer no microcítico de pulmón no microcítico (CPNM) de los pacientes (Tabla 1) y cinco líneas de cáncer de pulmón (CP) de células (Tabla S1). El alto porcentaje (97%) de CD133
+ (LC-CD133
+) subconjunto se aisló en los tejidos de LC y LC línea celular parental (fig. 1A). Se ha informado de que las células madre, como el cáncer pueden ser cultivadas en suspensión para generar cuerpos esferoidales-como (SB) menores de medio libre de suero con bFGF & amp flotante; EGF [30]. Se encontró que el LC-CD133
+ aislado a partir de estos diez pacientes (Tabla 1) y cinco líneas de células de LC (Tabla S1) pueden formar SB en DF 12-medio libre de suero con bFGF y EGF (Fig 1B;. No. 1 [PLC] y nº 2 [LLC]). (Fig. 1D) Además, la capacidad de formar SB (Fig. 1C) y la tasa de proliferación en LC-CD133
+ eran significativamente más alta que en LC-CD133
- (p & lt; 0,05). Además, para determinar el
in vivo
actividad tumorigénico de LC-CD133
+ y LC-CD133
-, inyectamos respectivas cantidades de 1000, 3000, y 10
4 células en las venas de la cola de ratones SCID. Los resultados mostraron que 10
4 LC-CD133
- no indujo la formación de tumores, pero 3000 LC-CD133
+ a partir de los tejidos de cáncer de pulmón de diez pacientes y cinco líneas de células de LC en ratones xenotransplantado puede todo generar visible tumores 4 semanas después de la inyección (Tabla 1 y Tabla S1).
(a) el uso de un método de perlas magnéticas, que ordenadas CD133
+ células a partir de muestras de tejido de pacientes con cáncer de pulmón (LC), y se caracterizaron ellos por el ensayo de FACS. (B) LC-CD133
+ ordenados a partir de dos pacientes por el número 1 (PLC-CD133
+) y N ° 2 (LLC-CD133
+) se cultivaron en bFGF y EGF con DMEM sin suero medio libre. (C) Evaluación de las capacidades de formación de cuerpos esferoides similar (SB) de LC-CD133
+ y LC-CD133
- bajo medio libre de suero con bFGF & amp; EGF. (D) Las curvas de crecimiento de LC-CD133
+ y LC-CD133
- se midieron mediante hemocitómetro. Bar: 100 micras. Los datos que se muestran aquí son la media ± desviación estándar de tres experimentos.
El aumento de la expresión ABCG2 y la capacidad invasora de la CL-CD133
+
in vitro
Para caracterizar nuestra aislados LC-CD133
+, se utilizó el análisis FACS para detectar el perfil de expresión de células de la superficie marcadores. Como se muestra en la Figura 2A, la mayoría de los aislados LC-CD133
+ se tiñeron con más altos niveles de expresión de CD133, CD117 (c-Kit), y ABCG2 compara con LC-CD133
-. Este resultado demuestra que el aislado LC-CD133
+ células fueron casi ABCG2-positivos (Fig. 2B). A fin de evaluar la mejora de la tumorigenicidad de LC-CD133
+, examinamos
in vitro
Matrigel-combinada Transwell invasión y ensayos de formación de colonias en agar blando. En comparación con LC-CD133
-, LC-CD133
+ derivado de NSCLC pacientes No.1 (PLC) y No. 2 (LLC) mostraron mayor actividad de invasión a través de ensayo de invasión de Matrigel Transwell (
p
& lt; 0,001; Fig. 2C). Del mismo modo, la capacidad de formación de focos de LC-CD133
+ de PLC (No.1) y LLC (Nº 2) se ha mejorado en comparación con la LC-CD133
- de estos dos pacientes (
p
& lt; 0,001; Fig. 2D)
(a) y (B) Los niveles de expresión de CD133, CD117 (c-Kit), y ABCG2 se analizaron mediante el ensayo de FACS en LC-CD133
+ y LC-CD133
-. Las capacidades de (C) la migración /invasión y (D) los focos de tumor (blando de colonias en agar) la formación en LC-CD133
+ fueron significativamente más elevada que en LC-CD133
- (*
p
& lt; 0,001). Los datos que se muestran aquí son la media ± desviación estándar de tres experimentos.
Aumento de
En Vivo
Tumor-restauración y la capacidad proliferativa de LC-CD133
+
además, evaluó la
in vivo
tumoral-restauración y la capacidad proliferativa de LC-CD133
+ y LC-CD133
- por análisis de tumorigenicidad xwnotransplantado (Fig. 3A). Cuatro semanas después del 10
se inyectaron 4 células en las venas de la cola de ratones SCID, un aumento significativo en los múltiples nódulos de formación de tumores en la superficie pulmonar se observó en el LC-CD133
+ -. Grupo inyectado (figuras 3A4 & amp; 3A7) pero no en el LC-CD133
- grupo (Fig 3A1).. Se observaron las infiltraciones difusas de LC-CD133
+ desde el parénquima pulmonar a la cavidad alveolar (Fig. 3A5, 3A6, 3A8 y). El examen histológico demostró que la formación de trombos y la neovascularización prominente se detectaron en el parénquima pulmonar de LC-CD133
+ - inyectado ratones SCID (Fig 3A9.). En contraste, no se encontraron focos tumorales significativa o formación neovascular en los pulmones de LC-CD133
- inyectado ratones SCID (Figs 3A2 & amp; 3A3.). Además, investigó el
in vivo
tasa de crecimiento del tumor en 10
4 LC-CD133
+ células, 10
6 LC-CD133
- células, y 5 × 10
6 células tumorales de los padres de la misma paciente. El hallazgo demuestra que la tasa de crecimiento del tumor del 10
4 LC-CD133
+ grupo (de los pacientes No. 1, 2, 4, y 7; Tabla 1) fue significativamente mayor que la de la 10
6 LC-CD133
- grupo y 5 × 10
6 grupos de células tumorales parentales (figura 3B.). Por otra parte, 10
4 LC-CD133
+ aislado de tumores secundarios pueden generar más nuevas (segundas), los tumores de los ratones SCID trasplantados. Los resultados de la citometría de flujo mostraron que se detectó un alto porcentaje (60%) de las células CD133 positivas en el segundo tumor (Fig. 3C). Además, un mil LC-CD133
+ aislado del segundo tumor también puede generar una nueva (tercera) de tumores en ratones SCID trasplantados (Fig. 3C). En resumen, nuestros datos indican que la CL-CD133
+ presentes auto-renovación y repoblación capacidades tanto
in vitro Opiniones y en
in vivo
.
(A) Las i
n vivo
tumorigenicidad de LC-CD133
+ y LC-CD133
- en los ratones inyectados con la vena de la cola, se analizó mediante examen macroscópico e histológico. A1-3: LC-CD133
-; Flechas: estructura alveolar normal de pulmón. A4-6: LC-CD133
+; flechas: la formación de tumores. A7-9: LC-CD133
+; flechas: la neovascularización y la trombosis. Bar: 200 micras. (B) El
in vivo
tumoral-restauración y la capacidad proliferativa de 10
4 LC-CD133
+, 10
5 LC-CD133
- y 5 × 10
5 células tumorales totales de paciente No. 1, 2, 4, y 7 se examinaron por análisis de tumorigenicidad xenotransplantado. (C) La capacidad de repoblación tumoral LC-CD133
+ se estudió en ratones SCID trasplantados. Los niveles de expresión de CD133 se determinaron por análisis FACS de la primaria LC-CD133
+, segundo tumor, y tercero tumor. Los datos que se muestran aquí son la media ± desviación estándar de tres experimentos
Enhanced la quimioterapia y la radiación resistencia en LC-CD133
+
Se evaluó la poliquimioterapia (quimioterapia). - capacidades resistentes de LC-CD133
+ y LC-CD133
-. Además, la prueba cuatro agentes quimioterapéuticos comunes, como el cisplatino, VP16 (etopósido), doxorrubicina, paclitaxel. En comparación con LC-CD133
-, LC-CD133
+ son significativamente resistente a los cuatro agentes quimioterapéuticos ensayados (
p
& lt; 0.01; Fig. 4A). A fin de determinar el efecto de la radiación sobre la tasa de crecimiento del tumor, se utilizó una radiación ionizante (IR) de la dosis de 0 a 10 Gy para tratar tanto LC-CD133
+ y LC-CD133
-. Como se muestra en la Fig. 3B, después del tratamiento IR, la tasa de supervivencia y el número de LC-CD133
+ fueron significativamente más altos que los de LC-CD133
- (
p
& lt; 0,01). Estamos, además, que la LC-CD133
+ células poseen un mayor grado de radioresistance (
p Hotel & lt; 0,01; Fig. 4B). Por otra parte, se investigó el efecto del tratamiento combinado de radio-quimioterapia en LC-CD133
+. Los experimentos se llevaron a cabo con cisplatino (10 M) por sí sola, VP-16 (10 M) solo, o en combinación con cisplatino y VP-16 en IR (2 Gy) tratados con LC-CD133
+. Como se muestra en la Figura 3C, los datos revelaron que la tasa de supervivencia celular en IR tratado-LC-CD133
+ no se redujo significativamente por el tratamiento IR combinada con cisplatino, con o sin VP-16 (
p
& gt; 0,05). Por el contrario, la supervivencia celular se redujo significativamente después de la quimioterapia con cisplatino en combinación con VP-16 en tratados con IR LC-CD133
- (
p
& lt; 0,01; figura 4C.). Estos resultados sugieren que la CL-CD133
+ puede jugar un papel vital en la capacidad del tumor para resistir la radiación y la quimioterapia.
(A) Tanto 10.000 LC-CD133
+ y LC-CD133
- se sembraron en una placa de 96 pocillos y se trataron con varias concentraciones de cisplatino, VP-16, doxorrubicina y paclitaxel durante 24 horas en 10% de FBS /DMEM /medio F-12. La tasa de supervivencia se determinó por el ensayo de MTT. (B) Para determinar el efecto de la radiación sobre la tasa de crecimiento del tumor, una radiación ionizante (IR) de la dosis de 0 a 10 Gy se utilizó para tratar la LC-CD133
+ y LC-CD133
-. *
p Hotel & lt; 0,01: LC-CD133
+ en comparación con LC-CD133
-. (C) El efecto del tratamiento combinado de radio-quimioterapia en LC-CD133
+ y LC-CD133
- fueron evaluados. -fueron utilizan El cuatro protocolos de radiación (2 Gy) solamente, radiación con cisplatino (10 M), la radiación con VP-16 (10 M), y la radiación con paclitaxel (10 nM). *
p Hotel & lt; 0,01. Los datos que se muestran aquí son la media ± desviación estándar de tres experimentos.
Papel de Octubre-4 Expresión en LC-CD133
+
Microarray resultados sugiere que el nivel de expresión de Octubre -4 auto-renovación y el gen stemness en LC-CD133
+ fue significativamente hasta reguladas que en LC-CD133
-. Para validar este hallazgo, se analizó la expresión de Octubre-4 tanto transcripcional y traduccional. Las cantidades de Octubre-4 transcripción y proteínas aisladas de LC-CD133
+ (pacientes nº 1 [PLC] y nº 2 [LLC]) fueron significativamente aumentado en comparación con los de LC-CD133
- por bienes -Tiempo RT-PCR y análisis de transferencia de western (Figs. 5A y 5B). Para investigar si Oct-4 expresión juega un papel en el mantenimiento de auto-renovación o propiedades madre, como el cáncer de LC-CD133
+, se utilizó el método de siRNA con el vector lentiviral para desmontables de-4 Oct expresión en LC-CD133
+. Nos pareció que era importante que el tratamiento de Octubre-4 siRNA en LC-CD133
+ puede interferir significativamente con las capacidades de los cuerpos esferoidales similar (SB) formación (
p Hotel & lt; 0,001; Fig. 5C ). Después de 7 días del tratamiento Oct-4 siRNA, el SB-CD133 de LC
+ no pudo mantener esferas flotantes pero diferenciadas en células de tipo epitelial adjuntos (Fig. 5C). Por el contrario, el tratamiento de control de mezcla aleatoria siRNA no influyó en la capacidad de formación de SB en LC-CD133
+ (Fig. 5C). La SB de LC-CD133
+ expresa endógenamente fuertes señales positivas para Oct-4 y CD133 (Fig. 5D). Por otra parte, los resultados de inmunofluorescencia demostraron que tanto el CD133 Octubre-4 y expresiones en LC-CD133
+ fueron bloqueados después de 7 días de Octubre-4 siRNA tratamiento (Fig. 5D). ensayo de FASC confirmó que la cantidad de CD133 se redujo drásticamente en Octubre-4 siRNA tratados con LC-CD133
+ y los porcentajes de LC-CD133
- se incrementaron significativamente en LC-CD133
+ después de 7 días de octubre-4 siRNA tratamiento (
p Hotel & lt; 0,001; Fig. 5E). Estos datos sugirieron que Oct-4 podrá mantener las propiedades de las células madre primitivas e inhibir la tendencia a la diferenciación en LC-CD133
+.
(A) Las cantidades de Octubre-4 transcripciones de LC aislado CD133
+ aumentaron significativamente en comparación con los de LC-CD133
- por tiempo real RT-PCR análisis. (B) Los datos de Western Blott mostraron que los niveles de proteína de Octubre-4 en LC-CD133
+ aislado de PLC y LLC fueron también significativamente regulados al alza en comparación con los de LC-CD133
-. (C) La expresión de la proteína de Octubre-4 en LC-CD133
+ se bloquearon con eficacia por Oct-4 siRNA. El tratamiento de Oct-4 siRNA en LC-CD133
+ puede impedir la capacidad de formación de SB y facilitar aún más la SB de diferenciarse en células epiteliales como adjuntos. Bar: 100 micras. (D) Mediante el uso de la tinción de inmunofluorescencia, se demostró que los niveles de expresión de proteínas de ambos Oct-4 y CD133 en LC-CD133
+ disminuyeron significativamente después de Octubre-4 siRNA tratamiento. Bar: 30 micras. (E) La proporción de LC-CD133
- se incrementaron significativamente en Octubre-4 siRNA tratados con LC-CD133
+ mediante el ensayo de FACS. *
p Hotel & lt; 0,001. Los datos que se muestran aquí son la media ± desviación estándar de tres experimentos.
Enhanced Chemoradiotherapeutic Sensibilidad y Apoptosis La actividad en LC-CD133
+ Tratada por Oct-4 siRNA
Para más estudio el papel de octubre-4 en la malignidad del tumor de LC-CD133
+
in vitro
, se utilizaron la migración /invasiva y ensayo de colonias en agar blando. Los resultados mostraron que las habilidades de los
in vitro
migratoria formación de la invasión y en colonia en LC-CD133
+ tratados por Oct-4 siRNA se redujo significativamente en comparación con los no tratados LC-CD133
+ o LC-CD133
+ tratados con scramble-siRNA (control;
p Hotel & lt; 0,001; Fig. 6A). Por otra parte, el efecto del tratamiento de quimioterapia para el LC-CD133
+ grupo puede ser mejorada significativamente por el tratamiento de Octubre-4 siRNA en comparación con los no tratados con LC-CD133
+ o LC-CD133
+ tratada por scramble-siRNA (figura 6B;.
p Hotel & lt; 0,001). Además, se encontró que las actividades apoptóticas de la anexina V (Fig 6C.) Y la caspasa 3 (Fig 6D;. Parte superior) se forma rápida y eficaz inducidos en LC-CD133
+ tratados por Oct-4 siRNA después de 72 horas . De acuerdo con los resultados de supervivencia y tratamiento de células efectos de Octubre-4 siRNA tratados con LC-CD133
+ (Fig. 6B), los datos de transferencia Western mostró además que las cantidades de forma activada (eliminado) de la PARP fueron consistentemente elevado en LC-CD133
+ tratados por Oct-4 siRNA con IR solo o en combinación con quimioterapia (figura 6D;. parte inferior). Por lo tanto, desmontables de Octubre-4 expresión en LC-CD133
+ puede mejorar efectivamente chemoradiosensitivities y actividades apoptóticas en respuesta a la IR y la quimioterapia, lo que sugiere que Oct-4 podría ser un factor clave permite LC-CD133
+ para resistir