Extracto
Los microARN son una clase de origen natural pequeños ARN no codificantes que se dirigen a los ARNm codificantes de proteínas a nivel post-transcripcional y regulan complejos patrones de expresión génica. Nuestros estudios previos demostraron que en el cáncer de próstata humano el miARN
miR-125 ter
es altamente expresado, que conduce a una regulación negativa de algunos genes supresores de tumores. En este estudio, extendemos aún más nuestros estudios mostrando que
miR-125 ter
reprime el producto proteico del locus INK4a /ARF, p14
ARF, en dos líneas celulares de cáncer de próstata, LNCaP (de tipo salvaje p53) y 22R
v
1 (tanto de tipo salvaje y mutantes de p53), así como en el modelo de xenoinjerto de cáncer de próstata PC-346C que sobreexpresa lentivirally
miR-125 ter
. Nuestros resultados destacan que
miR-125 ter
modula la red de p53 al obstaculizar la baja regulación de Mdm2, lo que afecta p53 y su objetivo genes p21 y Puma en un grado suficiente para inhibir la apoptosis. Por el contrario, el tratamiento de las células del cáncer de próstata con un inhibidor de la
miR-125 ter gratis (anti-
miR-125 ter
) dio lugar a una mayor expresión de p14
ARF, disminución del nivel de Mdm2, y la inducción de la apoptosis. Además, la sobreexpresión de
miR-125 ter
en células PC3 deficientes en p53 inducida baja regulación de p14
ARF, lo que conduce a un aumento de la proliferación celular a través de una manera independiente de p53. Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que
miR-125b
actúa como un oncogén que regula p14
señalización ARF /Mdm2, estimular la proliferación de células de cáncer de próstata a través de una función de p53-dependiente o independiente de p53. Esto refuerza nuestra creencia de que
miR-125 ter
tiene potencial como diana terapéutica para el tratamiento de pacientes con cáncer de próstata metastásico
Visto:. Amir S, Ma AH, Shi XB, Xue L, Kung HJ, deVere Blanco RW (2013) Oncomir
miR-125 ter
Suprime p14
ARF para modular dependiente de p53 y p53-independiente de la apoptosis en el cáncer de próstata. PLoS ONE 8 (4): e61064. doi: 10.1371 /journal.pone.0061064
Editor: Matthew L. Anderson, Baylor College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 22 Octubre, 2012; Aceptado: March 6, 2013; Publicado: 9 Abril 2013
Derechos de Autor © 2013 Amir et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Con el apoyo de NCI subvención CA136597 y el Departamento de Defensa PC080488 subvención. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer de próstata metastásico (PAC), al progresar a CaP resistente a la castración (CRPC), representa una gran amenaza para la vida de los hombres americanos, lo que resulta en estimados 28.170 muertes por esta enfermedad en 2012 [1]. Los pacientes con CaP metastásico son tratados habitualmente con la terapia de privación de andrógenos (ADT). Desafortunadamente, la falta de ADT se produce inevitablemente y el tumor del paciente se convierte en CRPC. Se sabe que durante la progresión del CRPC tope células utilizan una variedad de receptores de andrógenos (AR) -dependiente y vías independientes para sobrevivir y prosperar en un entorno empobrecido andrógenos [2]. Aunque se han hecho varios intentos para caracterizar la firma molecular del CRPC, los mecanismos precisos que conducen a CRPC no se entienden completamente. En los últimos años, el descubrimiento de microRNAs (miRNAs) ha descubierto una nueva capa de complejidad que rige los mecanismos implicados en la regulación de CRPC [3], [4].
Los microARN son pequeños ARN no codificantes que funcionan como reguladores específicos de secuencia de la expresión génica a través de la represión de traducción y /o transcripción de escisión [5]. Los estudios han demostrado que miRNAs juegan un papel clave en los procesos celulares de la diferenciación, la proliferación, la apoptosis y la homeostasis metabólica [6]. Por otra parte, miRNAs puede funcionar como supresores de tumores u oncogenes, dependiendo de si se dirigen específicamente a oncogenes o genes supresores de tumores [7]. En este sentido, los miRNAs supresores tumorales son por lo general bajo-expresó mientras miRNAs oncogénicos tienden a ser sobre-expresado en el cáncer [8]. Los estudios han demostrado que
miR-125 ter
es oncogénico. La sobreexpresión de
miR-125 ter
se informó en el cáncer de colon [9], cáncer de vejiga [10], cáncer de ovario [11] y la leucemia [12]. Hemos informado anteriormente de que los tumores expresan niveles CaP clínicos de
miR-125b, aumentaron
comparación con los tejidos benignos [13]. Además, varios estudios han indicado que
miR-125 ter
es altamente expresado en cáncer de próstata, sobre todo en tumores metastásicos CaP e invasoras [14], [15]. Recientemente, se investigó la función de
miR-125 ter
y observamos que la sobreexpresión de
miR-125 ter
promovió el crecimiento de xenoinjertos de tumores en ratones intactos y castrados [16]. Por otra parte, hemos demostrado que
miR-125 ter de
se dirige directamente a varios supresora de tumores y genes pro-apoptóticos incluyendo p53, BAK1 y Puma [13], [16].
El nivel celular y la actividad de p53 es mantenido por un circuito complejo compuesto de p14
ARF /Mdm2 /p53 [17]. p14
ARF se verificó para ser un potente supresor de tumores tanto
in vitro
y
in vivo
[18] y ha sido propuesto para ser el miembro más importante de este circuito de vigilancia. La expresión de p14
ARF es inducida en respuesta a oncogenes activados tales como Ras [19], c-Myc [20], Abl [21] y E2F-1 [22], así como durante la senescencia replicativa [23]. p14
ARF media la secuestro y la posterior degradación de la Mdm2 p53-antagonista a través de la vía de la ubiquitina /proteasoma, lo que resulta en la estabilización (aumento de la vida media) de p53 [17] y la consiguiente activación de sus genes diana aguas abajo, tales como p21 (dependiente de ciclina inhibidor de quinasa 1A), Puma (mediador de p53 upregulated de la apoptosis), y Bax (proteína X asociada a BCL2) [24], [25]. Dado que estas moléculas son componentes clave de la red de p53, la modulación de su expresión puede alterar el equilibrio normal entre la apoptosis y la proliferación celular. Esta observación se fundamenta en nuestros estudios que muestran que la inactivación o baja regulación de p53, Puma y BAK1 por
miR-125 ter
se asocia con CRPC [13], [16].
Para aclarar aún más el papel de
miR-125 ter
en el desarrollo de CRPC y sus mecanismos moleculares subyacentes, en este estudio se investigó la implicación de los
miR-125 ter
en la modulación de la red de p53 por la orientación p14
ARF, que es apoyado por nuestra identificación de un
miR-125 ter sitio
de unión potencial en el 3'UTR de
p14
ARF
gen. Esperamos que nuestros estudios para proporcionar nuevos conocimientos sobre los mecanismos moleculares relacionados con la tumorigénesis y el crecimiento resistente a la castración de la PAC y ayuda para facilitar la aplicación de
miR-125 ter
como un objetivo para el tratamiento del CaP.
materiales y Métodos
Los anticuerpos y reactivos
Para el análisis Western Blot, anti-p14
ARF (sc-8340), anti-Mdm2 (sc-965), se compraron desde Santa Cruz Biotecnología (Santa Cruz, CA); anti-BAK1 (3814), anti-MCL-1 (4572), anti-Bcl-X
L, anti-caspasa 3 (9662), anti-SMAC (2954) y anti-p21 (DCS60) fueron adquiridos de Cell Signaling Technology (Danvers, MA); anti-Puma (PC686), anti-p53 (OP43) de Calbiochem (Billerica, MA); anti-β-actina (clon AC-15) de Sigma (St. Louis, MO). Sintética
miR-125 ter
mímica (miR-125bm), control negativo miARN (miR-NC), anti-
miR-125 ter Opiniones y control negativo anti-miARN (anti-miR-NC) así como el vector PMIR-INFORME luciferasa fueron adquiridos de Ambion (Grand Island, NY). Tanto
p14ARF
siRNA (sip14) y
BAK1
siRNA (sibak) fueron adquiridos de Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz, CA).
Líneas celulares y transfección
CaP humano líneas celulares PC3, 22R
v
1 y LNCaP se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). Todas las líneas celulares se mantuvieron rutinariamente en medio RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal al 10% que contenía antibióticos y multivitaminas. Para la transfección transitoria, las células se sembraron en placas de 6 pocillos un día antes de la transfección y se mantuvieron en un medio que contiene suero sin antibióticos. El día siguiente, las células fueron transfectadas con cualquiera de los genes miARN o siRNA utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Grand Island, NY) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
análisis de transferencia de Western
Las células fueron cultivadas a 70-80 % de confluencia y se lisaron utilizando el tampón de lisis celular (Cell Signaling Technology) suplementado con fluoruro de fenilmetilsulfonilo (1 mmol /L). Después de 20 min de incubación en hielo, los lisados se centrifugaron a 13.000 rpm durante 20 min y las concentraciones de proteína en el sobrenadante se determinó utilizando el kit BCA (Pierce, Rockford, IL). La proteína total (50 g por muestra) en 3 tampón de muestra × proteína [/L Tris-HCl 50 mmol (pH 6,8), 2% SDS, 10% de glicerol, 0,25% β-mercaptoetanol, azul de bromofenol (1 mg /ml)] se separaron en SDS-gel de poliacrilamida (Bio-Rad, Hercules, CA), y después se transfirió a membrana Immobilon PVDF (Millipore, Billerica, MA). Después de bloquear con leche 5% seca no grasa en solución salina tamponada con Tris /0,05% de Tween 20 (TBST), la membrana se incubó con un anticuerpo primario específico seguido por el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante. Las bandas de proteínas fueron exhibidos por un aumento de quimioluminiscencia. El nivel de expresión de proteínas se midió por análisis densitométrico cuantitativo.
luciferasa ensayo
El humano
p14
ARF
secuencia 3'-UTR que contiene la supuesta
miR-125 ter
sitio de unión se amplificó por PCR a partir de ADNc de LNCaP y se clonó en el vector de luciferasa PMIR-INFORME aguas abajo del gen de la luciferasa. El
p14
ARF
3'-UTR que no tienen este
miR-125 ter sitio
de unión se utilizó como control. Los productos de PCR clonados en el plásmido se verificaron mediante secuenciación de ADN. Para el ensayo de luciferasa, las células (4 × 10
4 por pocillo) se sembraron en placas de 24 pocillos y se cultivaron durante 24 horas. Las células fueron co-transfectadas con plásmidos informadores y 100 nM sintético miR-125bm o miR-NC. El plásmido de luciferasa pRL-SV40 Renilla (Promega, Madison, WI) se utilizó como control interno. Dos días más tarde, se recogieron las células y se lisaron con tampón de lisis pasivo (Promega). La actividad de luciferasa se midió usando un ensayo de indicador dual de luciferasa (Promega). La actividad de luciferasa se normalizó la actividad de luciferasa de Renilla.
Co-inmunoprecipitación ensayo
La interacción entre la proteína p14
ARF y Mdm2 se detectó mediante ensayo de co-inmunoprecipitación. Total de lisados de proteínas de miR-125bm- o transfectadas-NC de miR 22R
células v
1 se prepararon en el tampón de lisis celular. La proteína (1,0 mg /0,5 ml) se pre-aclaró mediante la mezcla con 20 l de perlas de proteína A y el sobrenadante se inmunoprecipitó a 4 ° C durante la noche con un anticuerpo de conejo anti-p14
ARF anticuerpo policlonal o IgG normal de conejo (Señalización Celular Tecnología). Las proteínas precipitadas se fraccionaron en un gel de SDS-PAGE 12%, seguido por la detección de transferencia de Western de la proteína Mdm2 utilizando el anticuerpo anti-Mdm2.
ensayo TUNEL
se realizó ensayo de TUNEL utilizando un
in situ
kit de detección de muerte celular (Roche, Indianapolis, IN) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, p53-positivas 22R
v
1 o células PC3 p53 nula (1 × 10
5 /pocillo) se sembraron en pocillos individuales de portaobjetos de cámara de 4 pocillos. Después de 24 horas, las células fueron transfectadas con 50 nM
miR-125 ter
, 50 nM anti-
miR-125 ter y 100 nm
sip14, solos o en diferentes combinaciones. Las células no tratadas y irradiadas se utilizaron como controles negativos y positivos. Se retiró el medio 72 horas después de la transfección y portaobjetos se enjuagaron dos veces con PBS, se fijaron en una solución de fijación (4% de paraformaldehído en PBS, pH 7,4) durante 1 hora a RT. Después de la fijación, los portaobjetos se enjuagaron dos veces con PBS y se incubaron en solución de permeabilización (0,1% Triton X-100) durante 2 min en hielo. 50 l de la mezcla de reacción TUNEL (50 l de solución enzimática + 450 l de solución de etiqueta) se añadió a cada diapositiva. Para el control negativo, se añadieron a 50 l de la solución de marca. DAPI se utilizó como contratinción nuclear. Los portaobjetos se incubaron en una atmósfera humidificada durante 60 minutos a 37 ° C en la oscuridad. Microscopía de fluorescencia se realizó para visualizar las células y adquirir imágenes digitales utilizando una longitud de onda de excitación en el intervalo de 450 a 500 nm y se detectó en el intervalo de 515-565 nm.
WST-1 ensayo
Las células (4,5 × 10
3 /pocillo) se sembraron en placas de 96 pocillos en medio RPM1 que contienen 10% de FBS. Después de haber sido cultivadas durante 24 horas, las células fueron transfectadas con 50 nM
miR-125 ter
o anti-
miR-125 ter
. Después de cinco horas, las células se trataron con medio fresco. a base de tetrazolio ensayo de proliferación celular (WST-1, Promega) se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Colonia ensayo
22R
v
1 (3 × 10
3 /pocillo) y LNCaP (4 × 10
3 /pocillo) se sembraron separadamente en placas de seis pocillos y se transfectaron con
miR-125 ter
o anti-
miR-125 ter
a una concentración de 100 nM utilizando lipofectamina 2000. después de dos semanas, las colonias de células fueron contados después de la tinción en el 20% de metanol y cristal violeta.
Resultados
miR-125 ter
regula por disminución p14
ARF en células de CaP
estudios previos demostraron que el gen supresor de tumores p14
ARF es significativamente las reguladas en los tejidos tapa [26]; Sin embargo, la forma p14
ARF es el regulado se explica mal entendido. Usando el algoritmo TargetScan, un potencial de
miR-125 ter
vinculante sitio fue identificado en el 3-'UTR de
p14
ARF
ARNm. por tanto, se investigó el efecto de
miR-125 ter
sobre la regulación de p14
ARF en células de CaP. Para ello, LNCaP y 22R
v
1 células fueron transfectadas con miR-125bm sintética para elevar el celular
miR-125 ter
abundancia, o con anti
miR-125 ter
para reprimir
miR-125 ter
actividad. Como se muestra mediante Western blot y densitometría cuantitativa análisis, en comparación con el tratamiento de miR-NC, miR-125bm reducción inducida de p14
expresión ARF en un 80% en las células LNCaP (Figura 1, panel superior) y el 60% en 22R
v
1 (Figura 1A, panel inferior). Por el contrario, anti-
miR-125 ter
aumentó la p14
nivel de ARF en un 40% en LNCaP (Figura 1, panel superior) y 30% en 22R
v
1 (Figura 1A, panel inferior) en comparación con anti-miR-NC. Nuestro estudio anterior demostró que los andrógenos hasta regula
miR-125 ter Hoteles en células de CaP [13]. Así, las células LNCaP y 22R
v
1 se trataron con 5,0 nM de R1881 andrógenos y el nivel de expresión de p14
se determinó ARF. Se encontró que el tratamiento R1881 indujo una reducción de 80% de p14
ARF en LNCaP y 20% de disminución en 22R
v
1 (Figuras 1A). También se examinó el nivel de p14
ARF en un
miR-125 ter
-overexpressed PC-346C del tumor de xenoinjerto en ratones [16], y se encontró que el nivel de p14
proteína ARF se redujo en un 60 % en el
miR-125 ter
tumor -overexpressed en comparación con el miR-NC tumor de control (Figura 1B). Para determinar si el
miR-125 ter sitio
putativo de unión en la 3'-UTR de p14
ARF ARNm es responsable de la regulación de p14
ARF por
miR-125 ter
, vectores indicadores de luciferasa que contenían el fragmento 3'-UTR de
p14
ARF
gen fueron co-transfectadas con el miR-125bm en células LNCaP. Como se muestra en la Figura 1C, la co-transfección dio como resultado una reducción de aproximadamente 50% de la actividad de la enzima en las células LNCaP. También se realizó el ensayo de luciferasa en 22R
se observó v
1 en las células y un resultado similar (datos no mostrados). Tomados en conjunto, los resultados que se muestran en la Figura 1 validar la regulación de p14
ARF por
miR-125 ter Hoteles en células de CaP.
Un
) Western blot de los niveles de expresión de p14
IRA en LNCaP (
top of) y las células 22Rv1 (
parte inferior). Las células cultivadas en 10% FBS fueron transfectadas con 50 nM de miR-125bm o anti-
miR-125 ter gratis (anti-125 ter) durante 72 horas o tratadas con 5,0 nM de R1881 andrógenos durante 48 horas. Después, se analizaron 50 g de proteína por muestra. Tanto el control de miR-negativo (miR-NC) y control negativo anti-MIR (anti-NC) se utilizaron como controles, y β-actina se utilizó como control de carga.
B Opiniones) Western blot de los niveles de expresión de p14
ARF, MDM2 y p53 en lenti-
miR-125 ter
xenoinjertos de tumores PC-346C -overexpressed. Tanto xenoinjerto sin tratar (untreat.) Y-lenti miRNA control de vectores infectados xenoinjerto PC-346C (vector) se utilizaron como controles. En ambos
Un
y
B Opiniones, los números bajo los geles son los cambios veces el promedio de p14
proteína ARF de tres geles independientes en relación con los controles correspondientes. Plegables cambios se calcularon mediante el escaneo de los p14
bandas de la IRA y la normalización de las bandas de ß-actina.
C
) Ensayo de la luciferasa de
miR-125 ter
unión a la 3'-UTR de
p14
ARF
mRNA en células LNCaP. El ensayo se repitió tres veces con cada ensayo se lleva a cabo en tres pozos y se obtuvieron resultados similares en cada ocasión. Los resultados representativos se muestran como media ± desviación estándar (n = 3).
miR-125 ter
-p14
ARFsignaling regula la red de p53
Los estudios han demostrado que p14
ARF acelera la degradación Mdm2, dando como resultado p53 sobre regulación [27]. por tanto, nos preguntamos: ¿la baja regulación de p14
ARF por
miR-125 ter
afecta a la expresión de Mdm2 y p53 en células de CaP? Para abordar esta cuestión, células LNCaP y 22R
v
1 se trataron con miR-125bm y los niveles de Mdm2 y luego se examinaron p53. En comparación con el miR-NC, el tratamiento de células LNCaP con
miR-125 ter
indujo un aumento dramático en la expresión de Mdm2 y una reducción significativa del nivel de p53 (Figura 2A, panel superior). Del mismo modo, en 22R
v
celdas 1,
miR-125 ter
tratamiento también una mayor expresión de Mdm2 y reducción del nivel de p53 (Figura 2A, panel inferior). Como era de esperar, el miR-125bm mediada baja regulación de p53 inducida por la reducción significativa de los dos efectores directos p53, p21 y Puma. Del mismo modo, en el
miR-125 ter
xenoinjertos de tumores PC-346C -overexpressed, la expresión de Mdm2 se triplicó y la proteína p53 se redujo reguladas en un 83% en comparación con el control de vectores (Figura 1B). Para confirmar los resultados intermedios de la inhibición de p14
ARF, utilizamos
p14
ARF
siRNA (sip14) para silenciar p14
IRA en LNCaP y 22R
v
1 Células. Como se muestra por inmunotransferencia, el tratamiento sip14 disminuyó significativamente la expresión de p14
proteína ARF y posteriormente upregulated nivel Mdm2 y downregulated la expresión de p53 (Figura 2B). Desde p14
ARF se une directamente a la C-terminal de Mdm2, hemos examinado el efecto de
miR-125 ter
en la interacción entre la proteína p14
ARF y Mdm2 por la co-inmunoprecipitación en 22R
v células
1 tapón. Hemos observado que Mdm2 puede ser detectada a partir de anti-p14
proteínas de anticuerpo precipitado con ARF, no a partir de proteínas de IgG acoplado de control, lo que indica que p14 endógena
ARF es capaz de formar un complejo con Mdm2. El tratamiento con
miR-125 ter
regulado por p14
ARFprotein, lo que resulta en una reducción de Mdm2 inmunoprecipitada (Figura 2C). Tomados en conjunto, los datos que se muestran en la Figura 2 proporcionan evidencia de que
miR-125 ter
regula
vía de p14 ARF /Mdm2 /p53 señalización.
Un
) Western blot de Mdm2 y p53 en células LNCaP tratadas con MIR-125bm (
top of) y 22R
v
1 células (
parte inferior). Las células fueron transfectadas con 50 nM de miR-125bm o control de miR-negativo (miR-NC) durante 72 horas. Cantidades iguales de proteína (50 mg) se utilizaron para detectar los niveles de expresión de Mdm2, p53, p21 y Puma.
B Opiniones) Western blot de p14
ARF, Mdm2 y p53 en
p14
ARF
siRNA (sip14) tratados con LNCaP (
Top of) y 22R
v
1 células (
parte inferior). Las células se trataron con sip14 y los niveles celulares de p14
ARF, p53 y Mdm2 se analizaron. β-actina se utilizó como control de carga.
C
) un análisis de co-inmunoprecipitación de proteína entre p14
ARF y Mdm2 en 22R
v
celdas 1. Las células fueron transfectadas con miR-125bm y 1,0 mg de proteína se inmunoprecipitaron con anti-p14
anticuerpo ARF o la IgG de conejo. Los inmunocomplejos resultantes se utilizan para detectar el nivel de Mdm2 por análisis de transferencia de Western usando anticuerpo anti-Mdm2. Entrada: 50 g de proteína de lisado celular total. IP: inmunoprecipitación. IB:. Inmunotransferencia
miR-125 ter
estimula la proliferación de las células de CaP
Tras haber determinado la regulación de p14
ARF vía de señalización /Mdm2 /p53
miR-125 ter
, se examinó el efecto de la regulación de p14
ARF por
miR-125 ter
sobre la proliferación celular tapa. Para ello, tanto las células LNCaP y 22R
v
1 células fueron transfectadas con 125bm-MIR y la proliferación celular sintética se determinó por WST-1 ensayo. Como se muestra en las figuras 3A y 3B, cuando se compara con el tratamiento miR-NC, transfección con miR-125bm resultó en un aumento de 1,5 veces en la proliferación celular en ambas líneas celulares ensayadas. Además, hemos realizado ensayos de formación de clones. Al igual que en los WST-1 resultados,
miR-125 ter
estimuló un aumento de 1,0 veces en la supervivencia clonogénico de células LNCaP y el aumento de 2,5 veces en 22R
v
1 en las células, y la adición de anti-
miR-125 ter
causó una reducción dramática en el número de colonias en comparación con las células no tratadas y anti-miR-NC (datos no mostrados). Estos datos apoyan que la regulación a la baja de p14
ARF por
miR-125 ter
facilita el crecimiento de las células de CaP.
Las células fueron transfectadas con 50 nM de miR-125bm o 50 nM de control negativo miARN (MIR-NC) durante 5 días. La proliferación celular se midió por WST-1 de ensayo.
p14
ARF
siRNA (sip14) se utilizó como control. Los resultados se expresan como la proliferación en relación con la de las células tratadas con MIR-NC, y se muestran como media ± desviación estándar (n = 4).
Anti
miR-125 ter
inducido la apoptosis en células de CaP que expresan p53 funcional
Desde
miR-125 ter
regula p14
ARF /Mdm2 señalización y posteriormente afecta a la red de p53, se evaluó el efecto de la regulación a la baja de p14
ARF por
miR-125 ter
sobre la apoptosis en células de CaP p53 positivo. En primer lugar, hemos probado la liberación de SMAC mitocondrial (segundo activador de las mitocondrias derivadas de la caspasa) y activar la caspasa 3 (Cas-3) en LNCaP y 22R
líneas v
1 de células que expresan p53 funcional. Cuando se compara con el tratamiento de miR-NC, miR-125bm causó una reducción del 10% del SMAC y la reducción del 40% de activarse Cas-3 en las células LNCaP, y la reducción fue del 20% y el 30% en 22R
v
1 células , respectivamente (Figura 4A). Estas líneas celulares fueron también tratados con anti-
miR-125 ter
. En comparación con el tratamiento anti-miR-NC, regulación a la baja de
miR-125 ter
actividad inducida aumento de aproximadamente un pliegue en el SMAC y activa Cas-3 (Figura 4A). Desde anti-
miR-125 ter
regula al alza SMAC y activar la caspasa 3, de este modo, analizamos anti-
miR-125 ter
inducida por la muerte celular por apoptosis mediante el uso de un ensayo de TUNEL. 22R
v
células fueron transfectadas con 1 miR-125bm o anti-
miR-125 ter
. No se observó muerte celular por apoptosis en tratados con miR-125bm v
células 22R
1. En contraste, el tratamiento de 22R
v
1 células con anti-
miR-125 ter
causó 63% de las células para sufrir apoptosis (Figura 4B). Para validar que
miR-125 ter
modula la apoptosis dependiente de p53 a través de p14
ARF, 22R
v células
1 fueron tratados con anti-
miR-125 ter
, seguido por
p14
ARF
silenciamiento. Se encontró que antisentido a
p14
ARF gratis (sip14) disminuyó drásticamente la muerte apoptótica en
miR-125 ter
-inactivated 22R
v
1 células (Figura 4C) . Como era de esperar,
p14
ARF
silenciamiento proliferación estimulada de estas células 22R
v
1 (datos no presentados). Además, los niveles de expresión de varios factores pro-apoptóticos fueron evaluados con el análisis de transferencia Western. De hecho, el tratamiento con anti-
miR-125 ter
indujo una regulación al alza de p14
proteína ARF en 22R
v
celdas 1, mientras que la adición de sip14 dio como resultado obvio regulación a la baja de p14
ARF (60%), p53 (30%) y BAK1 (70%), en comparación con el tratamiento scramble siRNA (Figura 4D). Estos datos sugieren fuertemente que
miR-125 ter
/p14
ARF objetivos de señalización de la red de p53, la regulación de la proliferación y la apoptosis dependiente de p53 en las células de CaP.
Un
) Detección de SMAC y activar la caspasa 3 (Cas-3) en LNCaP (
la izquierda) y las células 22R
v
1 (
derecha). Las células fueron transfectadas con 50 nM de miR-125bm o 50 nM anti-
miR-125 ter gratis (anti-125 ter) durante 5 días, y los niveles de SMAC y Cas-3 se midieron mediante análisis de transferencia Western. ß-actina se utilizó como control de carga. Los números debajo de los geles son las veces los cambios medios de SMAC y Cas-3 de tres geles independientes en relación con los controles correspondientes.
B Opiniones) La detección de anti-
miR-125 ter
la apoptosis inducida en 22R
v
celdas 1. Las células fueron transfectadas utilizando 50 nM anti-
miR-125 ter
durante 72 horas y la muerte celular por apoptosis se detectó usando el ensayo de TUNEL. La fluorescencia nuclear verde indica que la escisión apoptótica de ADN nuclear (
la izquierda). Para la cuantificación de la muerte celular apoptótica, se contaron 400 células y la apoptosis se expresa como% de apoptosis (células apoptóticas /400 × 100%). El análisis cuantitativo se realizó tres veces y el resultado se expresó como media ± SE (n = 3) (
derecha). Las células tratadas con irradiación (IR, 6 Gy) se utilizaron como control positivo.
C
) ensayo de TUNEL de la muerte apoptótica de 22R
v
1 células que fueron tratadas con anti-
miR-125 ter
seguido por
p14
ARF
antisentido (sip14). El resultado se expresó como media ± SE (n = 3).
D
) Western blot análisis de p14
ARF, p53 y niveles BAK1 en 22R
v
1 células.
Izquierda
: 22R
v
células fueron transfectadas con 1 anti-
miR-125
;
derecho
: anti-
miR-125 transfectadas
22R
v
1 células fueron tratadas con sip14. Ambos (anti-NC) y revueltos siRNA-miR-NC contra se utilizaron como controles.
miR-125 ter
/p14
señalización ARF media la inhibición del crecimiento independiente de p53
en los experimentos anteriores, hemos validado que
miR-125 ter
/p14
señalización ARF está implicado en los mecanismos dependientes de p53 en células de CaP. Sin embargo, los estudios demostraron que la inactivación de la función de p53 se produce en una parte de los pacientes con CaP metastásico [28], [29]. Hace
miR-125 ter
/p14
ARF señalización de regular el crecimiento celular y la apoptosis en estas tapas deficientes en p53? Utilizamos las células PC3 CaP p53 nula para abordar esta cuestión. Se examinó la influencia de la alterado
miR-125 ter
la actividad en los niveles de expresión de p14
ARF proteínas y Mdm2. Similar a la de LNCaP p53 funcional y 22R
v
celdas 1, la transfección de miR-125bm disminución de la expresión de p14
ARF en un 36% y aumentó Mdm2 en un 43% en las células PC3, mientras anti-
miR-125b,
inducir una regulación al alza obvia de p14
ARF y un ligero represión de Mdm2 (Figura 5A). Estamos próximos a prueba si
miR-125 ter
afecta a la proliferación y la apoptosis de las células PC3. Con este fin, las células PC3 se trataron con anti-
se detectó miR-125 ter
y células apoptóticas con el ensayo TUNEL. Se encontró que el tratamiento con anti-
miR-125 ter
causó 50% de estas células para sufrir apoptosis (Figura 5B). Desde BAK1 se informó de mediar p14
apoptosis inducida por IRA en células deficientes en p53 [30], se evaluó el efecto de
BAK1
silenciamiento sobre la proliferación de células PC3 transfectadas-miR-125bm. Se encontró que miR-125bm indujo un aumento de 1,6 veces en la supervivencia de estas células PC3 (Figura 5C), apoyando observación anterior de que
señalización ARF /Mdm2 p14 contribuye a un mecanismo independiente de p53 [31]. Para confirmar la regulación de la apoptosis independiente de p53 por
miR-125 ter
/p14
ARF señalización,
miR-125 ter
actividad fue suprimida con anti
miR-125 ter
y
p14
ARF
fue silenciada por RNAi. Hemos observado que
p14
ARF
silenciamiento disminuido significativamente la muerte apoptótica de
miR-125b
células PC3 -inactivated (Figura 5D), y también estimuló su proliferación (datos no mostrados). Además, se analizaron los niveles de expresión de p14
ARF y BAK1. Se encontró que
miR-125 ter
inactivación inducida por una regulación al alza de p14
ARF, mientras que
p14
ARF
silenciamiento invertido la regulación al alza de p14
ARF (60%) y también indujo una regulación a la baja de BAK1 (Figura 5E). Un estudio previo reportó que tanto Bcl-X
L y MCL-1 mediato p14
IRA inducida por la apoptosis independiente de p53. Estos dos factores anti-apoptóticos fueron analizados por tanto. No se observó alteración en su
miR-125 ter
-inactivated,
p14
ARF
-silenced células PC3 (Figura 5D). Tomados en conjunto, estos datos muestran que
miR-125 ter
/p14
señalización ARF es capaz de regular el crecimiento y la apoptosis en células de CaP deficientes en p53.
Un
) la detección de p14 niveles
ARF y Mdm2 en células PC3-p53 nula. Las células fueron transfectadas con 50 nM de miR-125bm o anti-
miR-125b, durante 72 horas. Los niveles de expresión de p14 tanto
ARF y Mdm2 fueron analizados por Western blot. β-actina se utilizó como control de carga.
B Opiniones) La detección de anti-
miR-125 ter
la apoptosis inducida en células PC3. Las células fueron transfectadas utilizando 50 nM anti-
miR-125 ter
durante 72 horas y la muerte celular por apoptosis se detectó usando el ensayo de TUNEL. La fluorescencia nuclear verde indica que la escisión apoptótica de ADN nuclear (
la izquierda). Para la cuantificación de la muerte celular apoptótica, se contaron 400 células y la apoptosis se expresa como% de apoptosis (células apoptóticas /400 × 100%). El análisis cuantitativo se realizó tres veces y el resultado se expresó como media ± SE (n = 3) (
derecha). Las células tratadas con irradiación (IR, 6 Gy) se utilizaron como control positivo.
C
)
miR-125 ter
promueve el crecimiento de,
BAK1
células PC3 -silenced p53 nulo. Las células fueron tratadas con 50 nM miR-125m durante 5 días y la proliferación celular se midió usando WST-1 de ensayo. Los resultados se expresan como la inhibición del crecimiento en relación con la de miR-NC (media ± SD, n = 4). Recuadro: expresión BAK1 en
BAK1
células PC3 -silenced.
D
) ensayo de TUNEL de la muerte apoptótica de las células PC3 que fueron tratados con anti-
miR-125 ter
seguido por
p14
ARF
antisentido (sip14). El resultado se expresó como media ± SE (n = 3).
E
) análisis de Western blot de p14
niveles de ARF y BAK1 en células PC3.
Top: PC3 células fueron transfectadas con anti-
miR-125
;
inferior
: anti-
miR-125
células PC3 transfectadas se trataron con sip14. Ambos (anti-NC) y revueltos siRNA-miR-NC contra se utilizaron como controles.
Discusión
Las observaciones recientes de los genes miARN expresión aberrante en varios cánceres humanos han puesto de relieve la importancia de miRNAs en muchos procesos biológicos [5].
miR-125 ter
es un miARN ampliamente conservado y se encontró a ser elevados en varios tipos de cánceres incluyendo tapa [14], [15]. Hemos informado anteriormente de que las tapas clínicos con altas puntuaciones de Gleason altamente expresas
miR-125 ter
[13], y que
miR-125 ter de
se dirige directamente a p53, Puma y BAK1, que muestra un efecto anti-apoptótica en presencia y en ausencia de andrógenos [16].