Extracto
Introducción
No pruebas de mutación no invasiva utilizando ADN circulante tumoral (ctDNA) es una premisa atractiva. Esto podría permitir a los pacientes sin muestra tumoral disponible para acceder a más opciones de tratamiento
Materiales & amp.; Métodos
La sangre periférica y los tumores emparejados fueron analizados a partir de 45 pacientes con CPNM. Hemos investigado el impacto de las variables pre-analíticos sobre la producción de ADN y /o
KRAS
detección de mutaciones:. Tipo de muestra de tubo de recogida, tiempo de incubación, las etapas de centrifugación, volumen y kits de extracción de ADN de entrada de plasma
resultados
tiempo
2 h de incubación y centrifugación de plasma doble (2000 xg) reducen el rendimiento global de ADN que resulta en niveles más bajos de contaminación de ADN genómico (ADNg). Reduce la "contaminación" y aumentó
se observó KRAS
detección de mutaciones de ADN utilizando tubos para recogida libres de células de sangre (cfDNA BCT) (Streck), después de 72 horas siguientes a la extracción de sangre en comparación tubos de EDTA. volumen de entrada de plasma y el uso de diferentes kits de extracción de ADN impactados rendimiento de ADN.
Conclusión
Este estudio demostró que el éxito de la recuperación ctDNA para la detección de mutaciones en NSCLC depende de pasos previos a la analíticos. Desarrollo de métodos normalizados para la detección de
KRAS mutaciones
de especímenes ctDNA se recomienda para minimizar el impacto de las medidas pre-analíticos sobre las tasas de detección de mutaciones. Donde el rápido procesamiento de la muestra no es posible el uso de tubos cfDNA BCT sería ventajoso
Visto:. Sherwood JL, Corcoran C, Brown H, Sharpe AD, Musilova M, Kohlmann A (2016) Métodos optimizados PREANALÍTICAS Mejorar
KRAS Mutation Detection
en circulación ADN tumoral (ctDNA) de pacientes con células no pequeñas de cáncer de pulmón (NSCLC). PLoS ONE 11 (2): e0150197. doi: 10.1371 /journal.pone.0150197
Editor: Javier S. Castresana, Universidad de Navarra, ESPAÑA
Recibido: December 24, 2015; Aceptado 10 de febrero de 2016; Publicado: 26 Febrero 2016
Derechos de Autor © 2016 Sherwood et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue financiado por AstraZeneca. El donante prestado apoyo en forma de salarios para todos los autores, pero no tuvo ningún papel en el diseño del estudio, recopilación o análisis de datos, la decisión de publicar o preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores: JLS, CC, HB, AS, MM y AK son empleados de y sean accionistas de AstraZeneca, cuya compañía financiado este estudio. Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
La necesidad de una detección precisa de la mutación de células no pequeñas del cáncer de pulmón (NSCLC) tejido tumoral tiene establecerse, junto con la necesidad de identificar respondedores potenciales a los medicamentos personalizados, como inhibidores de tirosina quinasa (TKIs); p.ej.
EGFR TKI
, erlotinib, gefitinib y el T790M dirigida TKI osimertinib) [1]. Sin embargo, el tejido del tumor evaluable no siempre está disponible para los pacientes con NSCLC [2]. Por ejemplo, en el reciente estudio Medida Iressa Seguimiento (IFUM), el estado de mutación del tumor no pudo ser determinada en el 19% de los pacientes elegibles [3]. En el Reino Unido sólo el 71% de los pacientes con cáncer de pulmón tienen una confirmación histológica de su enfermedad [4].
Debido a la falta de disponibilidad de muestras de tejidos adecuados, ADN tumorales circulantes (ctDNA) se está convirtiendo cada vez más importante como una fuente alternativa para la detección de mutaciones accionables [5]. Habrá una mayor demanda de pruebas de biomarcadores en muestras de cáncer de pulmón en particular en donde los fármacos más específicos están en desarrollo [6], como los inhibidores de MEK1 /2; selumetinib [7], cobimetinib (GDC-0973, XL-518) y trametinib y el T790M dirigida ITC del EGFR, osimertinib (AZD9291) [8] y rociletinib (CO-1686) [9]. Las pruebas de mutación del plasma también ofrece una opción mínimamente invasiva para caracterizar metastásico y /o mecanismos de la enfermedad resistentes cuando el tejido o re-biopsia o no está disponible.
La utilidad clínica de la detección de TKI sensibilizar a
EGFR
mutaciones en ctDNA se ha demostrado en el tratamiento de pacientes con gefitinib [3] en el CPNM y con erlotinib en el cáncer colorrectal (CCR) [10]. La detección de
KRAS
mutaciones en el CRC y el cáncer de páncreas usando ctDNA También se ha explorado junto con
BRAF Hoteles en muestras de melanoma [11-14]. ctDNA es típicamente degradado a una longitud de 166 pares de bases, muy probablemente debido a los procesos nucleolíticas que se producen durante la apoptosis [15,16]. Existe cierta evidencia que sugiere la ctDNA mientras que en la circulación tiene una vida media de entre 16 minutos [17] y alrededor de 2 horas [18,19], pero con una variación significativa entre los casos. Esto es probablemente debido a la actividad nucleasa transmitida por la sangre que degrada los fragmentos [20] en intervalos de 10 pares de bases [18] y el hígado también borra fragmentos de la circulación [21]. La detección de mutaciones en ctDNA es difícil debido a la baja cantidad de alelos mutantes en un fondo de ADN de tipo salvaje. Está presente en niveles muy bajos (& lt; 1%) [22] y puede variar de paciente a paciente debido a los procesos biológicos complejos tales como la amplificación génica observada con
EGFR
[23]. métodos sensibles son imprescindibles para dar resultados fiables. las variables pre-analíticos como la recogida de la sangre periférica, el procesamiento, el transporte y los métodos de almacenamiento pueden afectar las tasas de detección.
tejido tumoral En la actualidad sigue siendo el tipo de muestra estándar de oro recomendada debido a la tasa de detección relativamente baja en ctDNA si se compara con tumor tejidos [3,24]. La detección de ctDNA varía del 62% al 65,7% para la sensibilidad
EGFR
mutaciones en NSCLC [3,25] y la sensibilidad de 25% a 41% para
KRAS
mutaciones en el CCR [26,27 ].
Uno de los mayores retos en la detección de mutaciones de acciones concretas en ctDNA es la inestabilidad de las células blancas de la sangre después de la recogida. Los glóbulos blancos se descomponen extracción de sangre posterior, lo que lleva a un aumento en gDNA (DNA genómico) [28,29]. El aumento de la abundancia de espectador gDNA normales diluye el tumor deriva ctDNA lo que hace más difícil la detección de mutaciones viables [30] y exige que se utilizan técnicas más sensibles que los utilizados para la detección de mutaciones en muestras de tejido. Estudios previos han investigado el uso de métodos de mejora, pero en números de muestra limitados [30-32]. Las recomendaciones actuales para la evaluación de ctDNA incluyen: plasma en lugar de las muestras de suero, el uso de EDTA o tubos de extracción de ADN libre de células con el procesamiento dentro de 4 horas, el doble centrifugación y no más de tres ciclos de congelación y descongelación de las muestras de plasma [31]
El propósito de este estudio fue investigar diversos métodos para mejorar la detección de mutaciones en ctDNA de un empate 10 ml de sangre del paciente estándar. Se investigaron específicamente el uso de diferentes tubos de recogida de sangre. El uso de plasma de 45 pacientes con CPNM a juego con bloques tumorales también se evaluó el impacto sobre el rendimiento de ADN y /o
KRAS
detección bajo las siguientes condiciones: 1) tiempo de incubación a temperatura ambiente antes de aislar el plasma; 2) simple o doble centrifugación; 3) el volumen de entrada de plasma y 4) kits de extracción de ADN diferentes.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
La aprobación del Comité de Ética no se requiere en el caso de este trabajo específico como las muestras se recogieron en el mercado en el Centro de Investigación del cáncer de Manchester (MCRC) Biobanco, Reino Unido o Asterand Bioscience Royston, Reino Unido, que tiene la aprobación ética genérica: http://www.asterandbio.com/company/ethics/. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito completo para todas las muestras utilizadas en este estudio
El MCRC Biobanco es licenciado por el (número de licencia: 30004) Autoridad de Tejidos Humanos. y ha sido aprobado éticamente como banco de tejidos investigación por el Manchester del Sur Comité de Ética de Investigación (Ref: 07 /H1003 /161 + 5). Un conjunto de Hojas de Información del Paciente estándar y formularios de consentimiento del paciente se han desarrollado y aprobado y siempre será obtenido el consentimiento informado del paciente antes de tomar las muestras de los pacientes. El Biobanco tiene lo que se conoce como la aprobación ética Generico Online
Esto le confiere la aprobación para cualquier persona que utilice muestras del Biobanco MCRC, por lo que los investigadores no tienen que obtener su propio aprobación ética para los proyectos pertinentes utilizando muestras del Biobanco:. Http: //www.mcrc.manchester.ac.uk/Biobank/Ethics-and-Licensing
.
Todos los procedimientos se llevaron a cabo de conformidad con la Declaración de Helsinki (1964, modificado en 1975, 1983, 1989, 1996 y 2000 ) de la Asociación médica Mundial y todas las muestras de los pacientes sometidos a análisis se realizaron con el consentimiento pleno e informado de los pacientes.
todos los datos clínicos y muestras fueron recibidos de forma anónima.
los pacientes
dos colecciones de muestras de NSCLC que consta de tejido incluido en parafina (FFPE) fijado con formalina y plasma emparejado se utilizaron en este estudio (Fig 1). Para la evaluación de diferentes métodos de estabilización de plasma, una colección de plasma y el tejido FFPE emparejado ponderada para los pacientes caucásicos con adenocarcinoma y se utilizó con una historia de tabaquismo (n = 20; MCRC Biobanco colaborar NHS). emparejado de plasma y el tejido FFPE fueron utilizados para comparar los diferentes volúmenes de plasma (n = 15; Asterand Bioscience, Royston, Reino Unido) y comparación de diferentes kits de extracción de ADN de plasma (n = 10; Asterand Bioscience)
Diagrama que muestra el. flujo de trabajo experimental para las diferentes cohortes de muestra. Panel A. Comparación de Streck celular gratis (BCT) y tubos de EDTA, además de centrifugación simple y doble en el rendimiento de ADN y detección de mutaciones. B. Comparación de los diferentes volúmenes de plasma y kits de extracción ctDNA en el rendimiento del ADN y la detección de mutaciones.
La recogida de sangre, el aislamiento y almacenamiento de plasma
Para la evaluación de diferentes métodos de estabilización de plasma, 10 sangre periférica ml se recogió en un tubo de recogida de sangre con EDTA (Vacutainer K2EDTA) (Becton, Dickinson, Oxford, Reino Unido) y 10 ml de una BCT ADN ™-Free Cell (cfDNA BCT) (Streck, Omaha, NE) de 20 pacientes, de acuerdo con las instrucciones de uso (inversora 10 veces). A continuación, cada volumen de 10 ml se dividió en 2 x 5 ml de alícuotas y después se incubó a temperatura ambiente durante 2 hr, ya sea o 72 hr. luego de plasma fue aislado de la muestra de sangre mediante la realización de un g centrifugación 2.000 x durante 10 minutos y retirar cuidadosamente el plasma. A continuación, el plasma eliminado se centrifugó de nuevo a 2000 x g durante 10 min antes de la eliminación del plasma sobrenadante para la extracción ctDNA. Para 5 de los 20 pacientes se recogió un sorteo adicional de 10 ml de sangre en un tubo EDTA y se dividió en 2 x 5 ml volúmenes. Luego, la sangre se incubó a la temperatura ambiente, ya sea para 2 hr o 72 h antes de un giro de centrífuga de aislamiento en 2.000 x g para aislar el plasma (Fig 1A). Para el almacenamiento a largo plazo, todo el plasma se almacenó a -80 ° C en alícuotas de 1 ml antes de la extracción de ADN.
Para la comparación de diferentes volúmenes de plasma y diferentes kits de extracción de ADN, se recogió sangre en tubos con EDTA y se centrifugó una vez durante 10 min a 1.300 x g. El plasma se recogió en alícuotas de 1 ml y se almacenó a -80 ° C dentro de 1 h de recogida de sangre. Las alícuotas de la misma paciente se descongelaron en hielo y se agruparon por paciente para generar & gt; 6 ml en total. A continuación se mezcló plasma de mezcla a fondo y se dispensa en 1, 2 y 3 volúmenes ml para el estudio de comparación de volumen de plasma (n = 15), y 3 x 2 ml de alícuotas para el estudio de extracción de ADN de comparación kit (n = 10) (Fig 1B) . Todas las muestras de plasma se congelaron a -80 ° C.
Todas las colecciones de tejidos se ejecutan simultáneamente, si bien los recogidos por Asterand Bioscience se llevaron a cabo bajo las limitaciones de disponibilidad de dichos conjuntos de muestras coincidentes, por lo tanto, algunos parámetros de la colección no eran ideales por ejemplo cfDNA colección con una etapa de centrifugación como anteriormente.
extracción de ADN de plasma
Para la comparación de la estabilización de la sangre y el volumen de plasma se utilizó el QIAamp circulante Kit ácido nucleico (Qiagen, Hilden, Alemania). Además, una comparación de tres kits de extracción de ADN se realizó en volúmenes iguales de plasma (2 ml de cada uno) (Fig 1B). Se utilizaron los siguientes kits: PME-libre de ADN circulante Extracción protocolo Kit (Analytik Jena, Jena, Alemania) durante 2-5 extracciones ml utilizando solución de lisis sistema GS /encuadernación solución VL y DSP Virus Kit /Patógenos Midi realizado en QIAsymphony (Qiagen) y el QIAamp circulante ácido nucleico Kit (QIAGEN). extracciones QIAsymphony se realizaron en el Laboratorio de aplicaciones Qiagen (Hilden). Todas las muestras de plasma se procesaron de acuerdo con los protocolos del fabricante con la excepción de la PME kit donde una incubación de 20 min inicial en lugar de se realizó 10 min y los pasos de centrifugación de plasma se realizaron a 3750 x g vs 4.500 x g. Todos los ADN se eluyó en 80 l dentro del intervalo especificado por el kit.
extracción de ADN a partir de tejido FFPE
ADN se extrajo de 2 x 5 micras secciones de tejido FFPE recién cortadas de acuerdo con el fabricante de protocolo usando el kit de ADN QIAamp Tissue FFPE (Qiagen) y se eluyó en 100 l de tampón.
ADN cuantificación
Todos los ADN eluido se mezcló a fondo (vórtex) antes de la medición por PCR cuantitativa (qPCR ) que se llevó a cabo utilizando el kit ABI TaqMan RNasa P Detección Reactivos y TaqMan PCR universal Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.) en un instrumento Quantstudio Dx (Life Technologies, CA. EE.UU.). Las reacciones se prepararon utilizando 10 l de Master Mix, 1 l de mezcla de ensayo, 5 l de ADN y 4 l de agua libre de nucleasa (Qiagen, Hilden, Alemania). Las condiciones de ciclación fueron 95 ° C durante 10 minutos y luego 94 ° C durante 15 segundos y 60 ° C durante 1 minuto a ciclos 40x. Una serie de 10 diluciones seriadas de ADN genómico humano (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) a partir de 100 ng /l a 0.195 ng /l se usó por duplicado para producir la curva estándar. El tamaño de amplificación del ensayo de RNasa P fue de 87 pares de bases, que es adecuado para su uso en ctDNA.
pruebas de KRAS
KRAS
estado de la mutación se caracterizó a partir de ADN derivado de tejido FFPE utilizando el
KRAS TheraScreen
kit RGQ PCR (Qiagen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El kit TheraScreen emplea amplificación refractario sistema de mutación (ARMS) la tecnología PCR en combinación con la tecnología de detección de escorpiones [33]. El estado de mutación de una muestra dada se establece por comparación de la específica
KRAS
ensayo de mutación en contra de un ensayo de control en
KRAS
exón 4 para generar un cambio de ciclo umbral (Ct). El Ct es la obtiene restando el CT de control desde el CT ensayo de mutación. El Ct se compara con los criterios de cortar validados para el Ct con el fin de establecer el estado de mutación.
KRAS
detección de mutaciones se llevó a cabo de la misma manera en muestras de pacientes con ctDNA
KRAS
mutaciones detectadas en el ADN derivado de tejido FFPE coincidente. Las muestras procesadas por métodos analíticos diferentes pre-se analizaron en la misma corrida RotorGeneQ (RGQ). Las muestras de plasma solamente se evaluaron para la conocida
KRAS
mutación tal como se obtiene en el tejido emparejado.
El análisis estadístico
Se realizó un análisis estadístico mediante el emparejado de Student
t
-test en Microsoft Excel donde p & lt; 0,05 se consideró significativo. El análisis de regresión lineal y el cálculo de R
2 se realizaron en GraphPad Prism (versión 6.01) y los valores de p se calcularon sobre la base de la desviación de cero. Los gráficos se generaron en GraphPad Prism.
Resultados
Cuantificación de ADN siguiendo diferentes de procesamiento de plasma Pasos para
Para saber si los métodos de procesamiento de plasma pueden influir en los niveles de contaminantes presentes ADNg , se recogió sangre de 20 pacientes con NSCLC y procesado el plasma en diversas condiciones (Fig 1A y figura 2). tubos de recogida de EDTA y el tiempo de incubación más largo fue significativamente (p & lt; 0,01) asociado con un mayor rendimiento de ADN, media ± SD: tubo de EDTA /2 horas de incubación (2,49 ± 1,60 ng /l) versus tubo de EDTA /72 hr de incubación (15,12 ± 16,44 ng /l) (figura 2A). A (p & lt; 0,01) bajo pero significativo aumento en el rendimiento de ADN también se observó con tubos de extracción de sangre de ADN libre de células (cfDNA BCT) a las 72 horas (3,31 ± 1,82 ng /l) en comparación con cfDNA BCT /2 hr (2.39 ± 1.42 ng /l) (Fig 2B). No hubo diferencia significativa en los rendimientos de ADN total observada cuando el plasma se procesó dentro de 2 hr utilizando ya sea del tipo de tubo (Fig 2C). El rendimiento de ADN a partir de plasma procesado después de 72 hr utilizando tubos cfDNA BCT fue significativamente (p & lt; 0,01) más bajo que el plasma procesados utilizando tubos de EDTA (Fig 2D) "
Toda la sangre se recogió de 20 pacientes de NSCLC y se procesa utilizando. diversos tipos de tubos, tiempos de incubación y etapas de centrifugación un subconjunto de estos pacientes (n = 5) tenían sangre entera procesada para evaluar una única etapa de centrifugación doble vs. ADN se midió usando el ABI TaqMan® RNasa P de detección de reactivo Kit a:.. Blood se recolectaron utilizando tubo de recogida de sangre EDTA (EDTA) y se procesa después de 2 hr o 72 hr. B: se recogió sangre mediante tubo libre de células de recogida de sangre de ADN (cfDNA BCT) y se procesa después de 2 hr o 72 hr C:. se recogió sangre usando tubos y EDTA o cfDNA BCT procesan después de 2 horas D:. La sangre fue recolectada usando tubos con EDTA o cfDNA BCT y procesada después de 72 hr:. La sangre recogida en tubos con EDTA después de 2 horas de incubación y se procesan utilizando centrifugación simple o doble F.: La sangre se recoge en tubos con EDTA después de una incubación de 72 horas y se procesa mediante centrifugación, ya sea simple o doble. Los resultados se muestran para cada paciente. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de Student apareado donde; ** P & lt;.
0,01
Un subconjunto de estas muestras de los pacientes (n = 5) se evaluó además la influencia de simple o un paso doble centrifugación en los rendimientos de ADN (Figura 2E y 2F). En caso de transformación dentro de 2 horas, centrifugar las muestras de plasma en dos ocasiones no tuvo un efecto significativo en el rendimiento de ADN en comparación con solo giro (Figura 2E). Sin embargo, cuando se procesan después de 72 horas, un paso doble centrifugación generado una disminución en el rendimiento de ADN significa (19,35 ± 24,3 ng /l) en comparación con el procesamiento sola centrifugación (35,47 ± 32,1 ng /l). Se observó una reducción en el rendimiento en 4 de las 5 muestras analizadas (Fig 2F) sin embargo esto no fue estadísticamente significativa (p = 0,058). Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que los niveles de rendimientos de ADN pueden variar en función del método por el cual el plasma se procesa con métodos no óptimos.
KRAS
detección de mutaciones siguiendo diferentes pasos de procesamiento de plasma
la aplicación de los distintos métodos de procesamiento de plasma también fue investigado por
KRAS
la detección de mutaciones en 20 muestras de pacientes (figura 1A). Antes de realizar
KRAS
la detección de mutaciones en cualquiera de ADN derivado del plasma, el correspondiente tejido FFPE emparejado se proyectó utilizando el
KRAS TheraScreen
kit RGQ PCR para identificar pacientes con tumores positivos de mutación (n = 10 /20; datos no mostrados). En esta cohorte, 50% (n = 5) tenían
KRAS
mutaciones identificadas en el plasma emparejado procesado en tubos de recogida de cfDNA BCT dentro de 2 hr y 40% (n = 4) en 72 hr. Sin embargo, esta tasa de detección se redujo en comparación con un método no óptimo considerado, por ejemplo, tubos de recogida de EDTA después de 2 h, 40% (n = 4) de las mutaciones se detectaron cayendo a 20% (n = 2) después de 72 horas (Tabla 1) en las mismas muestras. Los valores individuales (CT), amplificable ADN de Kras (KRAS) de control total y los valores de Ct para las 10 muestras de plasma se muestran en la Tabla S1. Cabe señalar que
KRAS
estado de la mutación se estableció usando el Qiagen TheraScreen
KRAS
manual RGQ PCR, Ct cortado valores intervalo de 6,6 a 8 para las mutaciones detectadas. Debido al bajo número de muestras con
KRAS
mutaciones que eran detectables en ctDNA, no es posible fijar la significación estadística.
amplificable Total
ADN KRAS
(
Control de KRAS
) de detección en todas las muestras mostraron una tendencia similar a la observada para el rendimiento de ADN (qPCR) en la figura 2 (S1 Tabla). Una disminución en el valor de CT se demostró por métodos no óptimos indican una mayor concentración de ADN contaminante; media CT ± SD: EDTA incubación tubo /2 horas (29,0 ± 1,0), tubo de EDTA /incubación 72hr (25,5 ± 1,5), cfDNA BCT /2 h de incubación (29,4 ± 1,1), y cfDNA BCT /72 h de incubación (28.5 ± 1.0) , respectivamente (Tabla S1). Estos resultados demuestran que tanto
KRAS
detección de la mutación y también amplificable total
KRAS
ADN puede ser influenciado en función del método de procesamiento de plasma utilizado.
Cuantificación de ADN siguiente plasma diferente entrada
Como era de esperar, se observó un aumento significativo en el rendimiento de ADN con el aumento de volumen de la muestra (p & lt; 0,01) a partir de 15 pacientes (figura 3). Un aumento en el rendimiento aumentará la concentración y el número de copias absolutos de ctDNA disponibles para el análisis haciendo así la detección de mutaciones más probable. El rendimiento de ADN media de 3 ml de plasma fue de 4,39 ± 4,55 ng /l en comparación con 3,03 ± 3,24 ng /l (2 ml de plasma) y 1,79 ± 1,81 ng /l (1 ml de plasma). De estos 15 pacientes, 7 tenían
KRAS
mutaciones en el tejido emparejado correspondiente En esta cohorte, un paciente (número 23) tenía un detectables
KRAS
mutación en plasma para las tres volúmenes de las muestras de los pacientes restantes que tienen valores de Ct fuera de los criterios de corte para la prueba (Tabla S2). Esto puede ser debido a esta colección particular de muestras de plasma emparejados se introduce en tubos de EDTA ordinarias, con sólo un solo giro que refleja la tasa de detección usual que surge en los métodos no óptimos [34]. Además, estas muestras específicas se derivan principalmente de la etapa I o II NSCLC (13/20) que podría contener niveles más bajos de ctDNA del tumor [35]. Curiosamente,
KRAS
control de amplificación mostró una tendencia similar a la del rendimiento de ADN (qPCR) en la figura 2. Bajo los valores medios de CT para el
KRAS
de control se observaron con un aumento del volumen plasmático. Los valores más bajos de CT demostraron un aumento significativo (p & lt; 0,001) en
KRAS
detección de control (media CT ± SD) para 3 ml de plasma (26,5 ± 1,7) comparado con 2 ml de plasma (27,1 ± 1,8) y 1 ml de plasma (28,1 ± 1,7) muestras (S2 tabla). Estos datos demuestran que el volumen plasmático variada de entrada puede tener un impacto en el rendimiento de ADN y amplificable total de
KRAS
. Para
KRAS
detección de mutaciones, sin embargo, se requiere una cohorte más amplia de muestras mutantes detectables para su posterior análisis.
Tres volúmenes de plasma (1 ml, 2 ml y 3 ml) se procesaron de cada muestra en una cohorte de 15 pacientes con CPNM. Se extrajo el ADN usando el kit QIAamp CNA y se midió por qPCR usando el kit de reactivo de detección ABI TaqMan® RNasa P. Los resultados se muestran para cada paciente. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de Student apareado donde; ** P & lt;. 0.01
Mientras que no hay ninguna conclusión se puede hacer de una sola muestra, todas las muestras se incrementaron en rendimiento de ADN como se esperaba. El aumento del número de
KRAS
copias de ADN amplificables obtenidos a través de la extracción de más de plasma, podría influir en la tasa de detección en estas muestras si los métodos más sensibles, por ejemplo, Se emplearon digital de PCR.
kit de extracción de ADN de comparación
volúmenes iguales (2 ml) de plasma de 10 pacientes fueron sometidos a extracción de ADN usando tres métodos distintos. Los tres métodos demostraron extracción exitosa de ADN (Fig 4) con QIAamp de Qiagen circulante kit de ácido nucleico dando el rendimiento de ADN más alto, es decir, media ± SD (3,03 ± 2.19ng /l) en comparación con el protocolo del kit de Extracción de ADN circulante libre PME de Analytic Jena ( 0,83 ± 0.88ng /uL; p & lt; 0,001) y en comparación con Virus DSP de Qiagen /Kit de patógenos Midi realizado en QIAsymphony (0,53 ± 0.53ng /l; p & lt; 0,01). Los kits manuales son simples de usar y adecuado para pequeñas a medianas tamaños de lote, mientras que el QIAsymphony requiere formación específica pero es más adecuado para un alto rendimiento y un procesamiento continuo.
volúmenes iguales de plasma (2 ml) de pacientes con CPNM 10 fueron procesados utilizando tres diferentes métodos de extracción de ADN: QIAamp circulantes de ácidos nucleicos kit (Qiagen kit CNA); PME libre de ADN circulante Kit de Extracción (Analytik Jena) y el virus del kit de DSP /Patógenos Midi realizado en QIAsymphony (QIAsymphony). ADN se midió mediante qPCR usando el kit de reactivo de detección ABI TaqMan® RNasa P. Los resultados se muestran para cada paciente. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de Student apareado donde; ** P & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001
Discusión
La terapia personalizada en cáncer a menudo se basa en las pruebas de mutaciones en el ADN utilizando un ensayo de diagnóstico de acompañamiento para identificar a los pacientes que lo hará. más probable responder a las terapias dirigidas. En la actualidad, el espécimen más comúnmente utilizados para la detección de cambios de mutación de ADN útil es el tejido tumoral, por lo general el tejido FFPE. Sin embargo, una muestra de tejido no siempre está disponible [3], ya sea debido al agotamiento del bloque de diagnóstico para otras investigaciones de patología molecular o porque el paciente nunca ha sido biopsia por otras razones clínicas. Cuando la disponibilidad de tejido es un problema la elección cuidadosa de las plataformas de diagnóstico altamente paralelas como Generation Sequencing siguiente (NGS) o láser asistida por matriz de desorción /ionización de tiempo de vuelo (MALDI-TOF), puede retrasar el agotamiento del bloque [36].
biopsias líquidos (por ejemplo, plasma) ofrecen una alternativa opción, temporal y menos invasiva para las pruebas de mutación exacta. Estudios anteriores han demostrado que las pruebas de mutación del ctDNA tiene una alta especificidad (& gt; 95%), pero la sensibilidad es menor (60%) en comparación con el tejido [3,37]. La mayor parte de la evidencia documentada en el CPNM hasta la fecha se refiere a
EGFR
pruebas. Algunos estudios han investigado
KRAS mutaciones
de ctDNA en pacientes con cáncer colorrectal [12,26,34].
Las tecnologías y métodos que pueden mejorar el aislamiento de ctDNA y reducir la contaminación de ADN de tipo salvaje son emergentes [31]: evitando tubos con heparina [38], el uso de plasma en vez de suero [39] y la evitación de las muestras de congelación [28]. Estos incluyen cambios de paso en el procesamiento de plasma para las etapas ejemplo de centrifugación (velocidad y número de giros) [40] y las mejoras más sofisticados, como tubos de una colección especializada, tubos es decir, células de recogida de sangre de ADN libre que estabilizan las células blancas en la sangre [30, 32]. Aunque el potencial utilidad clínica de los
KRAS
detección de mutaciones del plasma también ha sido explorada [41] en el CPNM, el efecto de estas modificaciones en el procesamiento de
KRAS
la detección de mutaciones en el CPNM aún no ha sido específicamente investigado.
El objetivo de este estudio fue identificar las etapas de procesamiento pre-analíticas óptimas para obtener ctDNA a partir del plasma de pacientes con cáncer de pulmón. En este estudio se midió el impacto de estas medidas en los rendimientos de ADN y
KRAS
tasas de detección de mutaciones.
PCR cuantitativa (qPCR) se piensa que es el método de cuantificación de ADN más adecuada, ya que caracteriza amplificable moléculas de ADN única [28]. El método utilizado emplea un amplicón par 87 de base que amplificar ctDNA que típicamente se degrada a 166 pares de bases (40). Hay que señalar sin embargo, que el uso de otros métodos es adecuado cuando se utiliza como parte de un método previamente validado.
ADN circulante existe de forma natural, pero a menudo es elevada en pacientes con cáncer [19]. La cantidad de ctDNA en una muestra varía depende de la configuración de la enfermedad y la etapa [35]. La detección de mutaciones de ctDNA basa en gran medida en la estabilidad de la muestra. Ha habido una emergencia de tubos de recogida de sangre alternativas que estabilizan las células sanguíneas, por ejemplo, CellSave Conservante Tubos (celular de la búsqueda, Ritan del Sur, Nueva Jersey, EE.UU.) y cfDNA BCT (Streck). En este estudio nos centramos en la evaluación de los tubos cfDNA BCT porque éstas eran el único producto disponible en el mercado diseñado específicamente para estabilizar la sangre para la evaluación ctDNA. La solución estabilizante contenida en tubos cfDNA BCT no afecta a análisis molecular aguas abajo por PCR [42] como también se observó en este estudio. Estudios anteriores han demostrado que los tubos cfDNA BCT preservar la sangre que permite la detección de ADN circulante libre usando plasma de donantes sanos [30,32] o plasma enriquecieron con células del cáncer [43]. Sin embargo, a lo mejor de nuestro conocimiento no existen estudios que han utilizado estos tubos para evaluar el rendimiento de ADN y las mutaciones específicas en el plasma de pacientes con CPNM.
Aquí demostramos que cuando se utilizan diferentes métodos de elaboración, como un 72 hr de incubación antes de la elaboración, tubos cfDNA BCT fueron mejores en la estabilización de la sangre en comparación con los tubos de recogida con EDTA como se ve por una reducción en los rendimientos de ADN. Como tal, cuando el procesamiento inmediato (& lt; 2 hr) de plasma no es posible, tubos cfDNA BCT proporcionan una alternativa superior a los tubos de recogida EDTA estándar. Esto es particularmente importante en un entorno clínico en el que se recoge la sangre, pero no es capaz de ser procesada inmediatamente
Se ha informado de que una centrifugación inicial lenta (& lt; 1.600 xg durante 10 min). Seguido de una segunda centrifugación, a alta velocidad (& lt; 16 000 xg durante 10 min) es necesario para el aislamiento de células libres de plasma [40,44], como se ve por una disminución en el rendimiento de ADN. Es importante destacar que los laboratorios clínicos no siempre tienen la capacidad de realizar una segunda centrifugación más rápido. Nuestro estudio confirma que la contaminación gDNA fue menor del plasma aislado con un doble centrifugación en comparación con una sola centrifugación apoyo observaciones anteriores. En estas circunstancias, se recomienda que una segunda centrifugación a la velocidad más baja es más eficiente en la eliminación de células de un solo centrifugación [45]. Por otra parte, el aumento del volumen de plasma, aumentó el rendimiento de ADN y bajado el
KRAS
de control como se esperaba [45].
Hay una serie de opciones de extracción de ADN que se puede utilizar para el análisis de ctDNA plasma o suero (S3 Tabla). Elegimos para comparar tres métodos, todos diseñados específicamente para la extracción de ADN, lo que permitió el uso de 2 ml de plasma de entrada de circulación. Hemos seleccionado un método automatizado (QIAsymphony), un método utilizado habitualmente (kit QIAamp CNA) y un método documentado menos (Analytik Jena). Si bien se observó que los métodos produjeron suficiente ADN para la aplicación de aguas abajo sin embargo los rendimientos difieren significativamente en todos los ensayos. Los diferentes rendimientos según lo medido por qPCR pueden ser consecuencia del aislamiento de fragmentos de distribución de diferentes dimensiones debido a la exclusión de tamaño de los ácidos nucleicos en un kit dado. Debido a la variación en el rendimiento de los kits comerciales, un método validado se debe utilizar en el análisis de muestras clínicas. Por lo tanto, la consideración cuidadosa se debe dar la hora de elegir un método óptimo de extracción ctDNA.
En conclusión, si bien individualmente algunos pasos de optimización tuvieron un efecto modesto en este estudio, la acumulación de múltiples modificaciones en última instancia conducir a mejores tasas de detección de mutaciones en ctDNA. En particular, la inclusión de los tubos cfDNA BCT ha demostrado mejorar la estabilización de la sangre periférica en comparación con tubos de EDTA después de la incubación de 72 h.