Extracto
Los rápidos avances en la espectrometría de masas han permitido que las estimaciones de las concentraciones absolutas a través de proteomas enteras, lo que permite la interrogación de muchas cuestiones biológicas importantes. Aquí, nos centramos en un aspecto cuantitativo del metabolismo de las células del cáncer humano que ha sido limitado por la escasez de datos disponibles sobre la abundancia de enzimas metabólicas. Integramos los datos de las mediciones recientes de la concentración de proteínas absoluta para analizar las estadísticas de la abundancia de proteínas a través de la red metabólica humana. A nivel mundial, nos encontramos con que las enzimas de la glucólisis comprenden aproximadamente la mitad de la cantidad total de proteínas metabólicas y pueden constituir hasta el 10% de todo el proteoma. A continuación, utilizar este análisis para investigar varios problemas pendientes en el metabolismo de cáncer, incluyendo el desvío de flujo glucolítico para la biosíntesis, la contribución relativa de las vías de asimilación de nitrógeno, y el origen del potencial redox celular. Nos encontramos con muchos consistencias con los modelos actuales, identificamos varias inconsistencias, y encontramos las generalidades que se extienden más allá de la comprensión actual. Juntos, nuestros resultados demuestran que un análisis relativamente simple de la abundancia de enzimas metabólicas fue capaz de revelar muchos conocimientos sobre la organización de la red metabólica de las células cancerosas humanas
Visto:. Madhukar NS, Warmoes MO, Locasale JW (2015 ) Organización de la enzima concentración a través de la red metabólica en las células cancerosas. PLoS ONE 10 (1): e0117131. doi: 10.1371 /journal.pone.0117131
Editor Académico: Vasu D. Appanna, Universidad Laurentian, Canada |
Recibido: 16 Septiembre, 2014; Aceptado: 19 de diciembre de 2014; Publicado: 26 Enero 2015
Derechos de Autor © 2015 Madhukar et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: CPC, Kinetic y Gibss energías libres se suministran como material complementario en las Tablas S1 y S2. los datos de cuantificación de proteínas LTQ partir de la cual los datos de CPC utilizados en este manuscrito se derivan está disponible en: http://wzw.tum.de/proteomics/nci60
Financiación:. JWL reconoce el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud ( http://www.nih.gov/) premios CA168997 y AI110613 y el Instituto Internacional de Ciencias de la vida. NSM fue apoyada por el Programa de Formación de Tri-Institucional en Biología Computacional y Medicina (http://www.triiprograms.org/cbm/), Número de programa: 1T32GM083937. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Metabolismo constituye un componente fundamental de la fisiología celular. Se permite el procesamiento de los nutrientes a través de redes de reacción química, lo que resulta en la producción de energía y componentes de biosíntesis y regulación de los procesos de transducción de señales, al afectar los niveles de metabolitos que controlan la actividad de las proteínas. Su función es esencial para la salud humana y su estado aberrante es una característica de muchas enfermedades [1,2]. Una comprensión cuantitativa, predicción del metabolismo tiene un sinnúmero de posibilidades [3-5], pero se ha visto limitado por la falta de datos disponibles en el nivel de los niveles de metabolitos, expresión de la enzima, y el flujo.
Una limitación importante en este comprensión nivel de sistemas se debe a la falta de medidas cuantitativas de la abundancia de proteínas [6]. La concentración de proteína absoluta es esencial para la cinética de la enzima y por lo tanto la comprensión flujo a través de una ruta metabólica [7]. Para cualquier reacción química que implica una enzima, la tasa de la reacción es proporcional a la abundancia de la enzima, por lo que la concentración absoluta de un lugares de enzimas límites en flujo metabólico y sirve como una estimación razonable de su actividad y, si se compara con otras enzimas en la competencia para un sustrato, se puede utilizar como una estimación del uso relativo de ese sustrato. Otros factores tales como las tasas constantes de Michaelis y el volumen de negocios también son importantes, pero cada uno de estos parámetros es independiente de la concentración de la enzima. Así, un análisis de las concentraciones de proteína a través y dentro de las vías y, en comparación con las enzimas que utilizan el mismo sustrato, puede dar estimaciones de los flujos relativos que emanan de las enzimas en comparación
.
Los estudios anteriores han llevado a cabo extensos análisis de la transcripción abundancia de genes metabólicos [3]. Estos estudios se han centrado en los cambios que acompañan a la transformación oncogénica y tienen puntos de vista no cubiertas en las vías, los genes y las reacciones que son alterados [1,3,8-11]. Sin embargo, también se ha demostrado que no es, en muchos casos, sólo una modesta correlación entre la transcripción y la abundancia de proteínas debido a muchos factores, tales como la regulación de traducción y la proteína de la estabilidad que influyen en la relación entre el mRNA y de la proteína [12 a 14]. Además, estos estudios se han centrado en las comparaciones de tumor normal en lugar de las distribuciones de concentración a través de la red, que tiene una diferente, pero no obstante relevante, biología asociado con su análisis.
Los avances en la proteómica base de espectrometría de masas han permitido documento de identidad con la profundidad y la cuantificación de los proteomas de mamíferos a partir de muestras biológicas [15-17]. Estas tecnologías han permitido también que para las estimaciones de la abundancia de proteínas de muestras biológicas utilizando un modelo de regresión. Con estos datos en la mano, es entonces posible evaluar la distribución de las concentraciones de proteína a través de la red metabólica y para hacer evaluaciones cuantitativas de la abundancia de la enzima a través de vías, en los puntos de ramificación donde divergen los flujos metabólicos, y para enzimas que utilizan sustratos comunes. Por ello, realizó este análisis y descubrió varios resultados sorprendentes relacionados con la organización de las concentraciones de proteínas a través de la red metabólica humana.
Métodos
Curación de un metabólico, Camino-Based, Proteoma
para comenzar nuestro análisis hemos considerado el panel de línea celular NCI-60, que es un conjunto de líneas celulares desarrolladas y mantenidas por el Instituto Nacional del cáncer que se ha utilizado ampliamente para el análisis integrados molecular y perfiles de sensibilidad a los fármacos [18]. La cuantificación proteómico para el panel NCI-60 hace uso de un número normalizado copia proteína celular (CPC) métrica (ver Tabla S1), que se deriva de la cuantificación etiqueta libre cuantificación (LFQ) de Gholami et al. [19]. El conjunto de datos proteoma NCI-60 que contiene los datos LFQ está disponible gratuitamente en http://wzw.tum.de/proteomics/nci60. Comenzamos mediante la filtración de proteínas en el conjunto de datos de CPC que fueron detectados en una sola muestra o tipo de tejido. Estas proteínas de la muestra también contenían un CPC promedio mucho más bajo que el resto de las muestras (~ 3000 CPC y 71.000 CPC) que indica que podrían no ser relevantes para realizar predicciones globales sobre el metabolismo. Cada proteína en esta lista se asigna a 86 vías metabólicas conocidas usando la Enciclopedia de Kyoto de genes y genomas (KEGG, versión 69.0, 1 de enero de 2014) mapeo de genes a las vías. Cualquier proteína que se incluye en al menos una vía se incluye como parte del proteoma metabólico. Los valores promedio de CPC en todas las líneas de células para cada metabólica y proteína no metabólica se utilizaron para calcular el porcentaje metabólico. Los porcentajes de la vía se calcularon de una forma similar, sin embargo, una proteína podría estar implicado en múltiples vías, y por lo tanto la suma de todos los porcentajes no es necesariamente igual a 100%. Para el cálculo de las distintas funciones de distribución de probabilidad de las diferentes clases de proteínas, todas las mediciones de la CPC a través de líneas de células se introducen en PRISM (versión 6.03), con un análisis estandarizado de centros de computación de basura.
La glucólisis Pathway Analysis
Para cada proteína implicada en la ruta glucólisis /gluconeogénesis a partir de la base de datos KEGG, la distribución se clasificó como los valores de CPC en todas las líneas celulares. La ruta glicolítica núcleo se define como los pasos progresivos a través de las que se convierte la glucosa en la glucólisis entrar en lactato o se pueden desviar a múltiples diferentes vías biológicas. Con el fin de visualizar las diferencias en los recuentos de proteínas a través de la glucólisis núcleo, una vía fue creado en Cytoscape (versión 3.1.1) con el tamaño de nodos correspondientes a la CPC promedio de las respectivas proteínas [20,21].
Rama de Análisis de Punto
con el fin de aislar las vías metabólicas que contienen pasos de ramificación, se utilizó la matriz de la estequiometría Recon 2,2 a vías separadas en un único metabolito actuó como un reactivo a múltiples diferentes reacciones de éstos se definieron como nuestras ramas [ ,,,0],22]. Dado que algunas ramas podrían participar más de un metabolito reactivo, se excluyó cualquier repetición nuestra búsqueda produjo. Para cada conjunto de ramas (cada conjunto tienen el mismo metabolito reactivo) sólo se incluyeron aquellos en los que todas las enzimas que catalizan fueron incluidos en nuestro proteoma metabólica. Se calcularon dos métricas de los CPC de estas enzimas de ramificación, cada uno basado en el número de enzimas consideradas. Para todas las vías de ramificación que clasificó las enzimas implicadas en función de su CPC promedio a través de todas las líneas celulares, con la divergencia de ramificación (BD) Partitura define como: Para los puntos en los que había al menos tres posibilidades distintas de productos de ramificación, que Rehicimos este cálculo, esta vez incluyendo los tres primeros clasificados en las enzimas en lugar de simplemente los mejores 2.
a continuación se separa las ramas en 2 categorías adicionales: uno se inclina manera vías donde decenas de ramificación produjeron una puntuación superior. 8, e igualmente distribuido vías donde la puntuación más alta 2 BD era inferior. 2 o 3 la puntuación más alta de BD era inferior a 0. Las ramas fueron filtradas para asegurarse de que no hay reacciones se repitieron en cada conjunto. En ambas series de ramas, ya sea la parte superior o la parte superior 2 3 implicó enzimas dependientes de las cuales se utilizó el tipo de puntuación para diferenciarlos se separaron y se asigna a sus respectivos KEGG vías. Para cada conjunto, se resume el número de enzimas que caen en cada vía y la prueba exacta de Fischer se realizó una para ver si había algún vías que diferían significativamente entre los dos juegos de ramificaciones. Las proporciones de los conteos se calcula dividiendo el número de enzimas One Sided implicados por el número de enzimas igualmente distribuido para cada una de las vías KEGG.
Análisis del cofactor
define oxidorreductasas como proteínas que o bien tenían NADP + /NADPH o NAD + /NADH como los reactivos o productos. Ambos reactivos y productos se incluyeron con el fin de permitir que para las proteínas con las reacciones reversibles. Números de la CE de las reacciones apropiadas se obtuvieron mediante la base de datos Braunschweig enzima (BRENDA, versión 2014.2, julio de 2014) la base de datos y luego se asignan a sus Uniprot apropiada (Release 2013_11) o Entrez (fecha de lanzamiento del 15 de diciembre
º 2013) identificadores [22] . Se realizó un análisis similar para las aminotransferasas, la sustitución de compuestos de NAD con α-cetoglutarato con el fin de realizar un seguimiento del uso de nitrógeno en toda la célula. Un gran riqueza gráfica representación de uso cofactor se ha creado usando Cytoscape.
Kinetic Análisis de parámetros
Para cada proteína metabólica se utilizó la base de datos para extraer todo BRENDA experimentalmente informó K
M valores. La interfaz Simple Object Access Protocol (SOAP) se utilizó para obtener las propiedades cinéticas de todas las proteínas metabólicas. Se excluyeron todos los valores no se hace referencia como un experimento de tipo salvaje (como K
M valores obtenidos después de una mutación en las proteínas) y refinó más la lista mediante la exclusión de cualquier medición de valores atípicos. A continuación, utiliza una lista publicada previamente de disponibles? G ° valores [23] trazó el registro
10 (CPC), ingrese
10 (K
M),? G ° valores de proteínas para los que hemos obtenido los tres de estas variables (ver Tabla S2). Para el análisis de conectividad, CPC,? G ° y K
M valores se aumentara entre 0 y 1, posteriormente visualiza en Cytoscape y de forma manual distribuido en cuatro grupos.
Resultados
Análisis global de metabólica del Proteoma
Para investigar la expresión y cuantificación de proteínas metabólicas primero ensambla el subconjunto de proteínas implicadas en el metabolismo. Se consideró que un conjunto de datos reciente que utiliza mediciones de proteómica profundos en el panel de la línea celular NCI-60 y un modelo de regresión para estimar la abundancia de proteínas a partir de datos de espectrometría de masas (S1 cuadro) [19]. Definimos proteínas metabólicas como cualquier proteína asignado a una ruta metabólica conocida en la base de datos KEGG [3,24]. La cuantificación de la magnitud relativa de este subconjunto, se encontró que en promedio, a través de las líneas celulares 59 miden, el componente metabólico representó aproximadamente el 18,5% del proteoma total (Fig. 1a). Al examinar la distribución también se observó una distribución normal aproximadamente log y se encontró que la distribución de las proteínas metabólicas siguió más o menos el mismo patrón que el de la distribución total de proteína (Fig. 1b).
(a) diagramación gráfico de sectores el porcentaje total de las proteínas del metabolismo a través de todas las líneas celulares. proteínas metabólicas se diferencian por una inserción de color diferente. (B) la función de distribución de probabilidad de los valores de copia proteína celular (CPC) para todas las proteínas y los subconjuntos de subconjunto diferente-metabólicas se indican mediante diferentes colores. Entrar
10 valores fueron agrupada con una diferencia de 10 bin
0,3 y la frecuencia relativa, o el porcentaje de los valores que caen en que Bin, se representaron.
El examen de las proteínas que comprenden enzimas metabólicas , nos lo solucionaron proteínas de acuerdo con las 86 rutas metabólicas KEGG metabólicas fueron asignados. Debido a que una sola proteína con frecuencia está involucrado en múltiples reacciones bioquímicas, no nos limitamos cada proteína de vía única, pero cuenta cada proteína a través de cada una de las vías a la que pertenecía la enzima. De los 86 KEGG vías, encontramos 6 vías no contenía proteínas detectadas y decidió no seguir examinando esas vías. Sobre la base de esta división hemos sido capaces de cuantificar los recuentos de proteínas totales y fracción de todas las proteínas que estaban involucrados en una vía específica a través del conjunto de líneas celulares (Fig. 2). De manera espectacular, se encontró que las concentraciones de enzimas glucolíticas que ser muy grande y en total resultaron en casi la mitad de la cantidad total de proteína dividida en enzimas metabólicas en las células. Este hallazgo probable confirma la suposición de que la mayor parte de flujo metabólico se produce dentro de la glicólisis y el metabolismo central de carbono [1,25-29]. Es importante destacar que las enzimas que intervienen en el ciclo del ácido cítrico (TCA) fueron típicamente un orden de magnitud o dos por debajo de expresión que de la glucólisis y estos números lugar límites en el flujo que se puede mantener en cada una de estas vías. Otras vías cuyos sustratos se derivan inmediatamente de carbono tales glicolítica como la vía de las pentosas fosfato y los que implican la síntesis de ácidos grasos, también tenía concentraciones de proteína mucho más bajos que los de la glucólisis.
Para cada distribución de la mediana, desviación estándar, max y min se indican. El recuadro contiene una mirada ampliada en las vías con los porcentajes más altos del proteoma metabólica.
Análisis de la glucólisis
Hemos observado que la proporción del proteoma que las células cancerosas se dedique a enanas glucólisis la proteína cantidad dedicada para otras vías metabólicas (Fig. 2). Esto es especialmente notable teniendo en cuenta que las únicas 32 proteínas fueron asignados a la vía glucolítica mientras que las vías tales como Purina Metabolismo, pirimidina metabolismo, y la fosforilación oxidativa se asignaron más de 60 proteínas. Aunque existe variabilidad a través de líneas de células, este análisis sugiere que las proteínas glicolíticas pueden representar hasta el 10% de todas las proteínas en una célula de cáncer. También observamos una bimodalidad de la distribución de todas las proteínas glicolíticas que surge de una abundancia de proteínas altamente expresadas y algunas isoformas que presentan los niveles de expresión más pequeños (Fig. 3B). Esta observación luego nos motivó a investigar más a fondo la organización de la expresión de proteínas en la glucólisis. Examinamos enzimas a lo largo de la vía en el orden en que se producen las reacciones enzimáticas. Curiosamente, un patrón no monótona emerge en la progresión de los niveles de enzimas como la glucosa se metaboliza a través de la glucólisis para producir lactato, con un pico en la fosforilación de la gliceraldehído-3-fosfato a 1,3-biphosphoglycerate catalizada por la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) -y más tarde pico adicional que se produzca en la conversión de 2-fosfoglicerato a fosfoenolpiruvato-catalizadas por enolasa (Fig. 3c). Este patrón aparentemente no aleatoria probablemente tiene consecuencias biológicas en la forma en el control metabólico se distribuye a lo largo de la vía y, posiblemente, la forma en los puntos de ramificación en la vía están coordinados. Por lo tanto, tratamos de investigar esta relación hipotética más.
(a) Distribución de los valores de copia proteína celular (CPC) para todas las proteínas glicolíticas /gluconeogénesis en todas las líneas celulares. Para cada proteína se indican la mediana, desviación estándar, máximo y mínimo. (B) la función de distribución de probabilidad de los valores de CPC para todas las proteínas metabólicas y los subconjuntos de subconjunto diferente-glucolíticas /gluconeogénesis se indican mediante diferentes colores. Los valores se binned con una diferencia de 10 bin
0,2 y la frecuencia relativa, o el porcentaje de los valores que caen en que Bin, se representaron. (C) Distribución de 11 proteínas glicolíticas en un orden secuencial a. punto central indica el valor promedio del CPC para cada proteína con barras que indican las mediciones máximo y mínimo en todas las líneas celulares. (D) Diagrama de Camino de la actividad de la glucólisis. cuadrados azules indican ramifican en otras vías biológicas, hexágonos azules indican los metabolitos intermedios, y círculos de color púrpura indican enzimas que reaccionan. Tamaño del círculo de color púrpura es proporcional al valor de CPC medio de esa enzima en todas las líneas celulares.
Numerosos puntos de la conversión de glucosa a lactato se produce mediante el cual el sustrato puede ser desviado a otra vía y por lo tanto otra Producto final. De hecho, muchos han propuesto que metabolismo de la glucosa mejorada observada en células de cáncer es una consecuencia de una adaptación metabólica para aumentar la desviación de intermedios glucolíticas a las rutas biosintéticas [1,3,30,31]. Para investigar el grado en que el flujo glucolítico puede ser desviado a un producto distinto de lactato, se compararon los niveles de intensidad de enzimas glicolíticas con los niveles de punto de ramificación (BP) enzimas que actúan sobre el mismo sustrato (Fig. 3d). Hemos encontrado que a través de la glucólisis los niveles de expresión de las enzimas de BP fueron significativamente menores que las enzimas correspondientes a la vía principal. sin embargo interesante, es que en ciertos puntos de ramificación, tales como uno que emana de 3-fosfoglicerato, la expresión de la enzima que cataliza la etapa comprometida con la vía anabólica de ramificación era comparable y en algunos casos acordes con la expresión de la enzima correspondiente en la glucólisis . Cabe destacar que esto ocurre en el paso de phosphoglyceromutase (PGAM) en la glucólisis en el que 3PG puede continuar para ser metabolizado a lo largo de la glucólisis o puede ser desviado a De la síntesis de novo de serina por oxidación a través de la fosfoglicerato deshidrogenasa (PHGDH). Aunque en promedio la concentración de PHGDH fue menor, en muchas líneas celulares de cáncer, la concentración de PHGDH era comparable o incluso superior a la de PGAM en algunos casos.
Análisis de Puntos de Poder Global
Given los hallazgos interesantes que hemos detectado en la glucólisis, el próximo tratado para evaluar sistemáticamente la estructura de la concentración de proteínas a través de la red metabólica humana. Con el fin de analizar los niveles relativos de las enzimas de la PA fuera de la vía glucolítica núcleo, se utilizó la base de datos Recon 2 para extraer todos los puntos en las rutas metabólicas conocidas donde se produjo una PA. El BPS se filtraron para incluir sólo aquellos que contenía proteínas detectadas en el conjunto de datos de proteómica cuantitativa. Este filtrado dio lugar a 251 bps con al menos dos enzimas medidos, y 105 con por lo menos tres. Para cada BP, se calcularon dos puntuaciones Branch Divergencia separadas (Fig. 4a, ver Métodos) en base a la parte superior de dos o tres proteínas más altamente expresado que participan en la rama. La primera puntuación considera la fracción de la concentración de proteína en la proteína abundante más alto que participan en la rama de comparación con la proteína segunda más alta. El segundo considera la fracción de la concentración de proteína en la proteína abundante más alto que participan en la rama en comparación con el segundo y tercero de proteína más alto. Una inspección de estos resultados (Fig. 4c) reveló una distribución no gaussiana con un pico cerca de uno para la primera métrica (Fig. 4b). Para la puntuación que considera los dos más altos proteínas expresadas, se encontró que la distribución alcanzó su punto máximo en uno que indica que el caso más común en los casos BPs a lo largo de la red metabólica humana fue cuando los niveles de proteína se concentraron a lo largo de una vía predominante en el metabolismo. Sin embargo, también se observó que existen muchas excepciones como la distribución exhibió una larga cola con suficiente densidad cerca de cero. Una inspección del histograma para la segunda métrica (Fig. 4c) reveló una estructura similar con la distinción clara que muestra que, en la cola, las concentraciones de proteínas se distribuyen a lo largo de múltiples enzimas y por lo tanto a través de múltiples rutas. A continuación se investigó qué vías tienden a tener proteínas distribuidas uniformemente a través de los puntos de ramificación y que tendían a tener la expresión se produce en una sola ruta. Se encontró que para los puntos de ramificación con una ruta predominante, se observaron más comúnmente vías de participación de la biosíntesis de ácidos grasos, el metabolismo de ácidos grasos y el metabolismo alanina. Esta observación es evidente tanto en las estadísticas (Fig. 4d) y la relación de los recuentos (Fig. 4e). Para vías con proteínas distribuidas uniformemente a través de los puntos de ramificación, la única señal de estadística observada fue en el metabolismo de las purinas, sin otras señales estadísticas para vías comunes observados sugieren que estos centros fueron esparcidas al azar en toda la red metabólica.
( a) método para el cálculo de varias puntuaciones de divergencia sucursal en 2 circunstancias diferentes Diagrama aclarar. cuadrados de color naranja indican reactivo y producto metabolitos con óvalos azules para indicar las enzimas que reaccionan. (B) Histograma de la rama de divergencia Las puntuaciones basadas en los 2 primeros valores. Cada bandeja está incluido extremo inferior con un tamaño bin de 0,1. (C) Histograma de la rama de divergencia Las puntuaciones basadas en los 3 primeros valores. Cada bandeja está incluido extremo inferior con un tamaño bin de 0,1. (D) del lote que indican los valores de p para las vías que tienen significativamente diferentes conteos en las vías de un solo lado y distribuida de manera uniforme (definida como un valor de p & lt; 0,05). (E) Relación de los recuentos de una cara en distribuye por igual el recuento de las vías importantes.
Análisis del cofactor
Otra conclusión valiosa que se puede extraer de este tipo de conjunto de datos sería cómo ciertos cofactores o sustratos cruciales se distribuyen a través de ciertas reacciones enzimáticas. Se examinó la distribución de enzimas que utilizan ciertos cofactores, y se consideró un análisis de las funciones metabólicas celulares cruciales, incluyendo el mantenimiento de potencial redox que implica tanto cofactores esenciales NADH y NADPH y la asimilación de nitrógeno.
En primer lugar, tratamos de analizar el uso relativo de nitrógeno, o que las aminotransferasas eran más prevalente dentro de una célula. Utilizando la base de datos BRENDA aislamos todas las aminotransferasas que fueron detectados dentro del conjunto de datos, y se encontró que las enzimas más abundantes fueron GOT2, GLUD1, y IDH2 (Fig. 5). Juntos este hallazgo identifica los nodos clave en la asimilación de nitrógeno. A continuación consideramos la utilización de los cofactores implicados en la oxidación y reducción, NADP
+ /NADPH, y NAD
+ /NADH. En primer lugar, consideramos NAD
+ /NADH y encontramos, en consonancia con nuestra observación de que las enzimas glucolíticas constituyen las enzimas más abundantes en las células, que GAPDH y LDH componen la mayor parte de la concentración de proteína utilizada para reacciones redox NADH acoplado mediada en las células. De menor abundancia eran aquellas enzimas que intervienen en el ciclo de Krebs y las reacciones biosintéticas y mantenimiento en el metabolismo secundario. Para NADPH, consistente con los hallazgos recientes que han identificado la oxidación de los folatos como una fuente importante de NADPH celular, la enzima MTHFD es una de las enzimas más abundantes que sintetizan NADPH [32]. Un gran consumidor de NADPH fue sintasa de ácidos grasos (FASN), que está en consonancia con la necesidad de
novo de la síntesis de lípidos y usados en la formación de la membrana plasmática en las células de proliferación rápidamente. Tanto los grandes consumidores (LDHA, Fasn) y productores (GAPDH, MTHFD y Mdh2) de NAD (P) H son objeto de importantes esfuerzos de investigación como dianas terapéuticas contra el cáncer [11,33-36].
Diagrama de Red de la glucólisis que ilustra la abundancia de las aminotransferasas y enzimas que utilizan NAD (P) /NAD (P) H como cofactor. El tamaño de los nodos corresponde a la abundancia promedio de las proteínas.
Las correlaciones con los parámetros cinéticos
Por último, observamos que que la velocidad de reacción o flujo a través de un punto en el metabolismo implica no sólo la concentración de enzima, pero los parámetros cinéticos y de la termodinámica de los compuestos químicos implicados en la reacción también. Estos parámetros incluyen la constante de Michaelis (K
M) y el nivel libre de Gibbs energías (? G °) de las reacciones (S2 Tabla). Por ello, investigó la relación entre estos tres parámetros fundamentales. Sorprendentemente ninguna correlación entre el nivel promedio de proteína y Delta G ° (Fig. 6a), K
valores de M y? G ° (Fig. 6b), y no se observaron nivel promedio de proteína y K
valores M (Fig. 6c). Para obtener información adicional sobre la relación entre estas tres variables, también visualizamos estas tres variables juntas para cada enzima. El uso de este enfoque distinguimos 4 grupos (Fig. 6d). La mayor parte de las enzimas visualizados en esta forma tenía? G moderada °, K
valores de M y el número de copias de proteínas (grupo 1) y, por tanto, fueron los responsables de la falta general de correlación entre estas tres variables. Este hallazgo está en contraste con un supuesto anteriormente en manos que se requieren concentraciones de proteína más grandes para las reacciones cerca del equilibrio [37]. Además, este análisis también proporciona una fuerte evidencia de que cada una de estas variables fundamentales para una reacción metabólica celular es desacoplada que permite la sintonización independiente de estos tres parámetros para la evolución de la red metabólica humana. Además, esta falta de correlación sugiere que, en general, la expresión de proteínas es un emblema de la velocidad de reacción ya que el K
M y Delta G ° para cada reacción que implica una concentración determinada proteína aparece correlacionadas. Sin embargo, hubo algunas excepciones a esta regla general. En primer lugar, las proteínas en el grupo 2 (Fig. 6d) corresponden en gran parte a las proteínas glicolíticas anteriormente mencionados sin gran K
M aparente o muy bajo? G ° valores. Esto se corresponde con la noción de que estas proteínas necesitan ser altamente expresado para asegurar un alto flujo glucolítico que puede resultar en la acumulación de intermedios glucolíticas y el flujo mejorado subsiguiente en las distintas ramas biosintéticas. Los otros dos grupos (grupo 3 y 4) contenían enzimas, ya sea con muy grandes K
valores M o muy bajos °? G. El extremo K
M valores indican que estas enzimas necesitan una acumulación sustancial de sustratos con el fin de resultar en un flujo hacia delante apreciable, mientras que las reacciones con ° muy bajos? G son reacciones altamente irreversible. De hecho, tres enzimas con gran K
valores M (GNPDA, GPT2 y GART) drenan directamente intermedios glucolíticas en rutas biosintéticas, mientras que tres enzimas con muy bajo? G ° (ATIC, PPAT y de QPRT) utilizar difosfato fosforribosil (PRRP) derivan de la vía del fosfato de pentosa de NAD (P) H y la síntesis de nucleótidos. También varias enzimas en el grupo 3 (GLS, NAGS, avena, GOT1 y ASL) están involucrados en arginina, aspartato, metabolismo de la glutamina, para los que los metabolitos tienen algunas de las más altas concentraciones y /o flujos intracelulares
.
( a) diagrama de dispersión del registro de la K
M y media? G ° valor con cada punto representa una proteína metabólica diferente. (B) Diagrama de dispersión del logaritmo de la media copia proteína celular (CPC) y Delta G ° valores con cada punto representa una proteína metabólica diferente. plot (c) Dispersión del log de la media tanto K
M y el valor promedio del CPC con cada punto representa una proteína metabólica diferente. (D) Análisis de Conectividad de CPC,? G ° y K
M valores para las diversas enzimas.
Discusión
Es importante señalar que estos análisis se realizaron en los datos recogido de un panel de líneas celulares de cáncer en lugar de tejido humano y por lo tanto los resultados de este análisis va precedida de una serie de advertencias. Mientras que los análisis sobre las líneas celulares a menudo puede arrojar luz sobre la comprensión celular en general, existe una gran diversidad metabólica a través de diferentes tipos de tejidos que podrían afectar los resultados de cualquier análisis proteómico mundial. Por ejemplo, se cree que los cardiomiocitos para extraer una mayor parte de su energía de la oxidación de ácidos grasos y aproximadamente 50% de su volumen está ocupado por la mitocondria [39]. Además, se ha demostrado que las condiciones de los medios utilizados en el cultivo de tejidos tienen sustancial si no dominante efectos sobre el metabolismo celular y la actividad de la enzima influencia [38-40]. Por lo tanto las condiciones específicas de la línea celular y microambiente alteran la distribución de las proteínas. Sin embargo, un análisis de la abundancia de proteínas a través de la red proporciona información detallada sobre ejemplos concretos de cómo el cáncer de células de mamífero distribuyen sus concentraciones de enzima
En general, se consideró que un análisis de la concentración de proteínas de las enzimas metabólicas a través de la red metabólica de las células cancerosas humanas en un número diverso de células. Este análisis revela que un cálculo relativamente simple y evaluación podrían producir múltiples conocimientos sobre la organización de la red metabólica cáncer. Al contrario de anteriores nociones, no parecen ser más altamente expresado que cualquier otra proteína en las células de las enzimas metabólicas. La principal excepción es la glucólisis, que representaba hasta un 10% de todo el proteoma celular. La notable asignación de concentración de proteína para una sola vía metabólica subraya su centralidad en la utilización de la macronutriente importante, la glucosa, que se utiliza como fuente de energía. También proporciona una visión de los grandes flujos que se observan en la glucólisis y la forma en que estos flujos pueden ser tan rápido. El hallazgo también pone en duda muchos mecanismos de control que se han propuesto para regular la glicólisis. Por ejemplo, es probable, que en muchos casos, modificaciones post-traduccionales, tales como la acetilación o fosforilación pueden no tener papeles importantes de regulación desde su estequiometría está limitado por el pequeño número de quinasas y acetyltransferases que se expresan para llevar a cabo estas reacciones.