Extracto
Debido a su agresividad y la falta de terapias eficaces, adenocarcinoma ductal pancreático tiene un pronóstico sombrío. Se requieren urgentemente desarrollar nuevas estrategias para mejorar el tratamiento y la supervivencia. Numerosos antígenos fucosilados en sueros sirven como marcadores de tumores para la detección y evaluación de la eficacia del tratamiento del cáncer. El aumento de expresión de fucosiltransferasas También se ha informado para el cáncer de páncreas. Estas enzimas aceleran la transformación maligna a través fucosilación de precursores sialiladas, lo que sugiere un requisito crucial para fucosa por las células de cáncer de páncreas. Con esto en mente, hemos desarrollado nanopartículas de fucosa unida como vehículos para la administración de medicamentos contra el cáncer específicamente a las células cancerosas. liposomas L-fucosa unida que contienen cisplatino o Cy5.5 fueron entregados efectivamente en CA19-9 que expresan las células de cáncer de páncreas. El exceso de L-fucosa disminuyó la eficiencia de la introducción Cy5.5 por liposomas L-fucosa unida, lo que sugiere la entrega L-fucosa mediada por receptor. liposomas-L-fucosa unida inyectado por vía intravenosa que llevan cisplatino fueron entregados con éxito a las células de cáncer de páncreas, que media la inhibición del crecimiento tumoral eficiente, así como la prolongación de la supervivencia en modelos de xenoinjerto de ratón. Esta modalidad representa una nueva estrategia para la terapia de metas de células de cáncer pancreático
Visto:. Yoshida M, R Takimoto, Murase K, Sato Y, Hirakawa M, Tamura F, et al. (2012) Orientación Anticancer Drug Delivery de células de cáncer pancreático utilizando un enfoque de nanopartículas Fucose-Bound. PLoS ONE 7 (7): e39545. doi: 10.1371 /journal.pone.0039545
Editor: José Najbauer, Ciudad del Centro Médico Nacional de la Esperanza y el Instituto de Investigación Beckman, Estados Unidos de América
Recibido: 15 Marzo, 2012; Aceptado: 22 de mayo de 2012; Publicado: 11 Julio 2012
Derechos de Autor © 2012 Yoshida et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue parcialmente apoyado por el Ministerio de Educación, Ciencia, Deportes y Cultura, subvención-en-Ayudas a la Investigación Científica (B), 21390231, de 2009, JK. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. No se recibió financiación externa adicional para este estudio
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
pancreático adenocarcinoma ductal es uno de los más agresivos. malignidades y tiene un pronóstico sombrío. Se estima que la mortalidad por cáncer de páncreas ocupa el octavo lugar en las muertes relacionadas con el cáncer en todo el mundo. La tasa de supervivencia global a 5 años de sólo el 1% al 4% se debe a la incapacidad para detectar esta enfermedad en una etapa temprana, su agresividad, y la falta de terapias conservadoras eficaces [1] - [4]. Incluso los pacientes que son capaces de someterse a una resección quirúrgica mayoría recaída, lo que resulta en un resultado generalmente desfavorable [3]. A pesar de que casi el 80% de los pacientes diagnosticados en una etapa inoperable muy avanzada (IV) son tratados con gemcitabina, gemcitabina en combinación con erlotinib, o FOLFIRINOX, el tiempo medio de supervivencia es informado de que sólo el 5,7 meses, 6,8 meses y 11,1 meses, respectivamente [1], [5], [6].
Una explicación plausible de la pobre respuesta de cáncer de páncreas avanzado es que los resultados de la quimioterapia sistémica en la entrega extremadamente ineficiente de los medicamentos contra el cáncer en el tumor debido a su hipovascularización [7 ]. En un esfuerzo por superar la deficiente prestación de los fármacos contra el cáncer, hemos desarrollado la quimioterapia infusión arterial con gemcitabina y 5-fluorouracilo para el cáncer de páncreas avanzado no resecable después de la redistribución de suministro vascular a través de embolizaciónsupra [8]. En un ensayo de fase I /II de prueba, una tasa de respuesta global del 33,3% y una mediana de supervivencia de 22,7 meses; se logró un mejor resultado que con la monoterapia con gemcitabina intravenosa [1] (IC del 95%: 9,5 a 24,5). Sin embargo, la supervivencia global a 2 años era todavía sólo un 25% debido a un mal control de las lesiones metastásicas [8]. Esto indica que se requieren aún terapias más eficaces. la administración específica de medicamentos contra el cáncer de las células del cáncer puede resultar en una eficacia mejorada.
administración de fármacos anti-cáncer específicamente a las células cancerosas sigue siendo un reto importante. Varios enfoques, tales como liposomas, polímeros, polimersoma, y micelas que llevan fármacos contra el cáncer, se han utilizado para la entrega de medicamentos a las células cancerosas, con la expectativa de pasiva de orientación a través de efectos de retención (EPR) mejorada de permeación y [9]. Sin embargo, se ha informado de portadores basados en lípidos que sean eliminadas rápidamente del torrente sanguíneo por el sistema reticuloendotelial (RES) [9]. A fin de superar este problema, la modificación química de portadores de fármacos con ciertos polímeros sintéticos se ha empleado con frecuencia en un intento de aumentar
in vivo
longevidad [10]. La modificación más popular y exitosa es el recubrimiento con polietilenglicol (PEG) para lograr la "estabilización estérica", lo que dificulta la interacción de componentes de la sangre con su superficie y reduce la unión de las proteínas del plasma, la toxicidad, la inmunogenicidad, y la acumulación en las RES [11 ], [12]. Un ejemplo de ello, es la doxorrubicina en los liposomas recubiertos de PEG (Doxil® y Caelyx®), que se utilizan ampliamente en la práctica clínica para el tratamiento de tumores sólidos en pacientes con carcinoma de mama [13]. Sin embargo, la evidencia reciente ha demostrado que el PEG, que antes se consideraba que sea biológicamente inerte, todavía podría inducir ciertos efectos adversos a través de la activación del sistema del complemento [14]. Otros enfoques utilizan nanopartículas basadas en polímeros u orgánicos (Abraxan®) se usan clínicamente, pero éstos están limitados por la falta de liberación controlada de fármacos en sitios específicos debido a la longevidad en el torrente sanguíneo, lo que conduce a los efectos adversos [15].
Otra manera de orientar activamente las células cancerosas es a través del uso de nanovehículos conjugados con moléculas que se unen a antígenos o receptores en las células del cáncer [17], [18]; Sin embargo, siguen existiendo obstáculos con esta estrategia, tales como la absorción no específica por el RES y por las células que no son objeto [9], [16]. Por ejemplo, cuando los anticuerpos se utilizan en su estado nativo para la modificación de nanovehículos, el dominio Fc de un anticuerpo monoclonal intacto puede también unirse a los receptores Fc sobre las células normales, como ocurre con los macrófagos, lo que lleva a un aumento de immnunogenecity y la absorción por el RES [ ,,,0],19], [20]. Aunque la eficacia de estas modificaciones se ha demostrado, también se han observado efectos secundarios letales, probablemente debido a la unión no específica [21] entre los restos de direccionamiento de agente y no objetivo en la superficie celular. Por lo tanto, se requiere con urgencia un portador específicos de la orientación de las células cancerosas que no sufre de captura por el RES o de los sitios que no son objeto.
De acuerdo con ello, nos centramos en las características biológicas de cáncer de páncreas, antígenos especialmente fucosilados, como sialil Lewis XI (SLX) antígeno y de hidratos de carbono antígeno-19-9 (CA19-9) que se encuentran en el suero y tejidos de pacientes tumorales [22] - [25]. Estos se utilizan como marcadores de tumores para la detección y evaluación de la eficacia del tratamiento del cáncer. De varios de tales antígenos fucosilados, CA19-9 se ha identificado como un marcador tumoral ampliamente útil para el adenocarcinoma de páncreas debido a su elevación frecuente en esta enfermedad (~ 80%) [26], [27]. También se ha demostrado que la tasa de supervivencia postoperatoria es significativamente peor en pacientes con adenocarcinoma de páncreas cuyos niveles de CA19-9 son elevados más notablemente [28].
fucosa, un azúcar desoxihexosa, juega un papel fisiológico en la modificación de diversas moléculas en los mamíferos. Por ejemplo, fucosilación juega un papel importante en la determinación del grupo sanguíneo, reacciones inmunológicas, y las vías de transducción de señales [29]. Síntesis de fucosa se produce a través de dos vías principales [30]; es decir,
de novo Opiniones y salvamento. En el primer caso, GDP-fucosa se sintetiza a partir de GDP-manosa mediante dos reacciones enzimáticas. En este último fucosa, libre de derivados de fuentes extracelulares o lisosomales [31], o de fuentes de la dieta (o medio de cultivo
in vitro
) se transporta a través de la membrana plasmática en el citosol. Aunque los mecanismos precisos siguen sin estar claros, aumento de los niveles de fucosa se encuentran con frecuencia en el suero y la orina de pacientes con cáncer, incluyendo cáncer de páncreas, cáncer colorrectal, y cáncer gástrico [32] - [34], lo que sugiere que fucosilación se incrementa en el cáncer las células.
Aumento de expresión fucosiltransferasas (FUTS) también ha sido reportado en varios tipos de cáncer. Para la síntesis de CA19-9, FUTS añadir L-fucosa en α (1,3) y α (1,4) la vinculación con precursores sialiladas [35] - [37]. FUTS son enzimas clave que aceleran la transformación maligna a través de la fucosilación de diferentes precursores sialilados [32], [35] - [37]. Se ha informado de que la actividad mejorada de FUT3 se asocia con mayor potencial metastásico de células de adenocarcinoma de páncreas [38], lo que sugiere que fucosilación puede jugar un papel importante en la progresión de la enfermedad. Estas observaciones indican una elevada exigencia de L-fucosa por diversas células del cáncer [22], [24].
Con esto en mente, hemos desarrollado L-fucosa unida a las nanopartículas como vehículos para la administración de fármacos contra el cáncer específicamente a estas células
a través de
endocitosis mediada por receptor. Hemos modificado el tamaño de las nanopartículas para permitir la penetración a través de los poros capilares más pequeños dentro de la vasculatura del cáncer, pero no a través de la barrera sangre-cerebro, a través de efectos de EPR [16]. Además, con el fin de evitar la captura no específica por el RES, la hidrofilización de la superficie de los liposomas se llevó a cabo en un esfuerzo para prolongar la retención sistémica y la encapsulación del medicamento contra el cáncer, el cisplatino. Aquí nos presenta que los liposomas-L-fucosa unida inyectados por vía intravenosa que contienen cisplatino pueden ser entregados con éxito a las células de cáncer de páncreas que expresan antígenos fucosilados. Esto dio lugar a la inhibición del crecimiento tumoral eficiente, así como la supervivencia prolongada en ratones portadores de tumores.
Resultados
Producción y propiedades fisicoquímicas de liposomas L-fucosa unida
L aminado -fucose fue reticulado a través de 3,3'-ditiobis [sulfosuccinimidilpropionato] (DTSSP) a los liposomas preparados por el método de diálisis de colato modificado para lograr una concentración final de 25 mg /ml (F25) o 50 mg /ml (F50). BS
3 y Tris se acopla entonces a hidrofilizar la superficie del liposoma (Figura 1A), que puede evitar la captación por el RES en el hígado y el bazo y en los macrófagos y las células endoteliales vasculares, y también se puede evitar la adsorción a opsonina proteínas en plasma. En consecuencia, la retención sistémica de los liposomas se prolonga [39]. El examen por microscopía electrónica de transmisión mostró que casi todos los L-fucosa unida a liposomas (Fuc-liposomas) eran de forma esférica y, en el caso de Cy5.5-encapsulación, fueron aproximadamente 80 a 90 nm de tamaño (Figura 1B, C, y en la Tabla S1). Este tamaño de partícula está de acuerdo con las mediciones realizadas por el Zetasizer Nano-S90 (Figura 1C). El potencial zeta, que representa la carga eléctrica negativa de la superficie del liposoma, estaba por debajo de -40 mV (Figura 1D, y en la Tabla S1, S2), que está suficientemente hidrofiliza para la función de sigilo. la distribución del tamaño de partícula se mantuvo estable después de almacenamiento a 4 ° C durante 6 meses.
(A) La preparación de liposomas esquema que muestra las cadenas de azúcar. HSA, BS
3, Tris, y DTSSP indican los siguientes, respectivamente: albúmina de suero humano; bis (sulfosuccinimidil) suberato; Tris (hidroximetil) aminometano; 3,3-ditiobis (sulfosuccinimidilpropionato). (B) Electron imagen microscópica de liposoma L-fucosa unida. La barra de escala muestra de 50 nm. (C, D) Caracterización físico-química de Fuc-liposoma-Cy5.5. Tamaño medio de partícula (C) y el potencial zeta (D) de los liposomas que se prepararon en agua se determinó mediante espectrofotometría de dispersión de luz dinámica.
Transferencia de Fuc-liposoma-Cy5.5 y en -FAM las células cancerosas
in vitro
experimentos, se evaluó la producción de CA 19-9 en las células de cáncer de páncreas y se encontró que BxPC-3, AsPC-1, PK59, y HuCCT1 secreta cantidades sustanciales de esta molécula (Figura 2A). Además, el análisis de citometría de flujo reveló también que la cantidad de CA19-9 unido a la membrana fue alta en las células que secretan CA19-9 (Figura S1). CA19-9 unida a la membrana no se pudo detectar por ELISA en las líneas celulares que no secretan CA19-9 (Figura S1). Basándose en estos resultados, hemos dividido las líneas celulares de cáncer pancreático en dos grupos de acuerdo con el nivel de CA19-9; es decir, alta productores y no productores células CA19-9.
(A) La concentración de CA 19-9 secretada a partir de diferentes líneas celulares de cáncer de páncreas. Cinco millones de células se incubaron en medio libre de suero durante 48 horas y la concentración de CA19-9 se midió por ELISA. (B) BxPC-3 células se incubaron con Fuc-Liposoma-FAM en presencia o ausencia de exceso de L-fucosa durante 2 horas, después se lavaron y se observaron por microscopía láser confocal. Barra de escala, 10 micras. Análisis de citometría (C) de flujo de las células-liposoma-Cy5.5 tratados con Fuc. BxPC-3, PK59, AsPC-1 (CA19-9 la producción de células de cáncer) y PANC-1, PK45H, MIA PaCa-2, KP4 (CA19-9 no la producción de células de cáncer de páncreas) se trataron las células con Fuc-Liposoma-Cy5 0,5 durante 2 horas con o sin exceso de L-fucosa y se analizaron por citometría de flujo. Se indicaron las células Cy5.5 positivos. NT, ningún tratamiento: F0, F0-liposoma-Cy5.5: F25, F25-liposoma-Cy5.5: F50, F50-liposoma-Cy5.5: F50 + Fuc, el exceso de L-fucosa. (D) HuCCT1 (CA19-9 producir) las células se incubaron con Fuc-Liposoma-Cy5.5 por hora se indica en la presencia o ausencia de exceso de L-fucosa, a continuación, se lavó dos veces con solución salina tamponada con fosfato y se analizaron por citometría de flujo. (E) Efecto de los monosacáridos sobre la introducción de Cy5.5 en células de cáncer de páncreas por Fuc-liposomas. Análisis citométrico de flujo de células-Liposoma-Cy5.5 tratados con Fuc. Las células se trataron con Fuc-Liposoma-Cy5.5 o liposoma-Cy5.5 durante 2 horas con o sin exceso de monosacáridos y se analizaron por citometría de flujo.
A continuación, investigaron si CA19-9 productoras las células cancerosas podrían ser objeto el uso de estos Fuc-liposomas. Con base en los resultados de los experimentos preliminares, hemos añadido Cy5.5 o FAM encapsulados L-fucosa-liposomas (Fuc-Liposoma-Cy5.5, Fuc-Liposoma-FAM) para CA19-9 producir o no producir las células de cáncer para confirmar la especificidad de entrega. Como se muestra en la Figura 2B, la microscopía de fluorescencia reveló que F50-Fuc-liposomas pero no F0-Fuc-liposomas introducidos eficazmente FAM en el citosol de BxPC-3. Además, el análisis de citometría de flujo mostró que F50-Fuc-liposomas pero no F0-Fuc-liposomas introdujo efectivamente Cy5.5 en el citosol de BxPC-3 células ASPC-1, y PK59 que secretan abundante CA19-9 dentro de 2 horas (Figura 2C y 2D, la figura S2). El exceso de L-fucosa inhibe la absorción de Cy5.5 en las células productoras de CA19-9 pero ningún cambio notable en las células CA19-9 no productores, lo que sugiere la introducción específica-L fucosa. Por otra parte, la cantidad de Cy5.5 transferirse a células de cáncer de páncreas parecía aumentar en proporción directa con el nivel de expresión CA19-9 (Figura 2C, y la Figura S2A). El exceso de L-fucosa, pero no D-glucosa, D-manosa, D-xilosa, D-galactosa o disminución de la eficiencia de este proceso (Figura 2E), lo que indica que la introducción de Cy5.5 por Fuc-liposomas es de hecho L-fucosa dependiente .
receptor mediada por la captación de Fuc-liposoma en las células
Para verificar la captación dependiente de L-fucosa de Fuc-liposoma, la absorción de
marcado con 14C L-fucosa por AsPC -1 fue examinado. La incorporación de
marcado con 14C-L-fucosa en AsPC-1 se aumentó de una manera dependiente del tiempo, y se inhibió en presencia de un exceso de L-fucosa fría (Figure3A), lo que sugiere la presencia de L-fucosa específica proteína de unión. Inhibición de la endocitosis por chroloquine condujo a la supresión de la absorción de Cy5.5 en BxPC-3 células (Figura 3B). A continuación realizó un
14C-L-fucosa ensayo de unión al receptor utilizando células AsPC-1 y detectado un receptor de alta afinidad-L-fucosa específica (3.25 × 10
6 receptores /célula, Kd = 28,74 nM), lo que indica que la absorción de la L-fucosa está mediada por sus receptores (Figura 3C, 3D).
(a) Incorporación de
marcado con 14C-L-fucosa en células AsPC-1. Las células se incubaron en presencia o ausencia de exceso de L-fucosa (exceso de calor) en el
marcado con 14C-L-que contiene fucosa medio durante el tiempo indicado, a continuación,
marcado con 14C-L-fucosa incorporación fue mesurado. (B) BxPC-3 células se incubaron con o sin chroloquine durante 24 horas, se trató con F50-Liposoma-Cy5.5 durante 2 horas a 37 ° C, y luego se analizaron por citometría de flujo. (C, D)
marcado con 14C-L-fucosa ensayo de unión utilizando células AsPC-1. El análisis gráfico de Scatchard reveló 3.25 × 10
6 receptores /célula, un K
d de 28,74 nM y una Bmax de 5.49 /10
6 células pmol. Los métodos se describen en
Materiales y métodos
.
Efecto de Fuc-liposoma-cisplatino en el crecimiento de líneas celulares de cáncer de páncreas
encapsula cisplatino en Fuc -Liposomes. partículas Fuc-Liposoma-Cisplatino fueron de aproximadamente 200 nm de tamaño, y la concentración final de cisplatino se estimó en 2 mg /ml (Figura S3 y Tabla S3). Este tamaño de nanopartículas debe permitir la penetración a través de los poros capilares más pequeños dentro de la vasculatura del cáncer por los efectos de EPR, pero no debe atravesar la barrera hematoencefálica [16]. Citotoxicidad de Fuc-liposomas El cisplatino se ensayó usando el ensayo de WST-1 (Figura 4). cáncer de páncreas células fueron expuestas a Fuc-Liposoma-cisplatino o liposomas El cisplatino durante 2 horas y después se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato para probar la eficacia y la especificidad de la transferencia de cisplatino en células CA19-9-productores. Debido a que se observó la mayor citotoxicidad usando F50-Liposoma-cisplatino (50 mg /ml Fuc-liposomas) (Figura 4A), se seleccionaron esta condición para los siguientes experimentos. En CA19-9 células productoras (BxPC-3, ASPC-1, PK59), F50-Liposoma-cisplatino ejerce efectos más potentes que los liposomas de control (F0-Liposoma-cisplatino), lo que indica la citotoxicidad de fucosa-dependiente (Figura 4B). Además de los efectos sobre las líneas celulares de adenocarcinoma de páncreas, el crecimiento de otros tipos de cáncer, tales como la línea celular gástrica y CRC Colo205, que producen CA19-9, también se suprimió eficazmente por F50-Liposoma-Cisplatino, lo que indica la aplicabilidad potencial de este tecnología de nanopartículas para el tratamiento de diferentes tipos de cáncer (datos no mostrados). No se observaron efectos citotóxicos de este agente en la no-CA19-9 células productoras (MIA PaCa-2, PANC-1, PK45H). Por otra parte, ninguna citotoxicidad en las células normales tales como células mononucleares de sangre periférica, fibroblastos, células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC), o queratinocitos primarios fue visto, probablemente debido a su bajo requerimiento de L-fucosa (figura S4). Debido a antígenos de grupos sanguíneos son determinadas por el patrón de glicoproteínas, incluyendo moléculas con grupos L-fucosa unidos moléculas expresadas en la membrana de los eritrocitos, estábamos preocupados de que los precursores eritroblastos también podrían ser inhibidos. Por lo tanto, hemos examinado CFU-E /BFU-E de formación de colonias por las células CD34 + en presencia o ausencia de F50-Liposoma-cisplatino. Sin embargo, la formación de colonias no fue inhibida, independientemente del grupo sanguíneo de las células CD34 + probado (Figura S5).
(A, B) Las células se trataron con Fuc-liposoma que contiene cisplatino durante 2 horas, después se lavó y se incubaron durante 72 horas. Las células viables se midieron mediante el ensayo WST.
La administración de D-manosa aumenta Distribución de Fuc-liposomas en tumores productores de CA 19-9 en un modelo de xenoinjerto
A continuación se investigó el tumor- la entrega específica de Fuc-liposomas en ratones portadores de tumores
in vivo
. Se ha demostrado que el aclaramiento de L-fucosa se retrasa en ratones deficientes en receptores D-manosa [40], de acuerdo con la presencia de receptores de manosa /fucosa en el hígado y las células de Kupffer [41] - [44]. Además, los liposomas de manosa unida acumulan en las células no parenquimatosas y células de Kupffer, cuando se administra a través de la vena de la cola [45]. Basándose en estos informes, se administró simultáneamente D-manosa con Fuc-liposomas en ratones portadores de tumor para inhibir la absorción de L-fucosa a través del receptor D-manosa. En primer lugar, hemos probado el efecto de D-manosa en la eficiencia de la captación mediada por Fuc usando citometría de flujo. Como se muestra en la Figura 2, se confirmó que Fuc-liposomas se introdujeron de manera eficiente en BxPC-3 células
in vitro
incluso en presencia de un exceso de D-manosa. A partir de entonces, se administró Fuc-liposomas
vivo
en y observado una acumulación de Cy5.5 en el tumor pero la reducción en el hígado cuando D-manosa se administró antes de la inyección Fuc-liposoma (Figura 5A y 5B, la Figura S6 ). Además, la acumulación de Cy5.5 se observó sólo en las células tumorales productoras de CA19-9, las células tumorales BxPC-3 y AsPC-1, pero no en CA19-9 no productores, (es decir, MIA PaCa-2). La acumulación de Cy5.5 en el tumor se mantuvo hasta 1 semana después de la administración de liposomas-Fuc (datos no mostrados) y no se observaron efectos secundarios aparentes.
(A) Fuc-liposomas o liposomas Cy5. 5 se administró a través de la vena de la cola (50 l /ratón). Se observó la regiones del tumor de células AsPC-1 (el lado posterior de una lesión bilateral flanco) en el ratón MIA PaCa-2, BxPC-3 y Cy5.5 y la acumulación se cuantificó usando el sistema de imágenes IVIS a las 96 horas después de la inyección. D-manosa (1000 veces de la L-fucosa) se inyectó simultáneamente con la inyección de liposomas. (B) flujo total del tumor y el hígado se calculó mediante el uso de software de estar imagen de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Fuc-liposomas Llevar Cisplatino El crecimiento del tumor suprime y prolongó la supervivencia de los ratones en el modelo de xenoinjerto
con el fin de probar los efectos de Fuc-liposoma-cisplatino en el crecimiento del tumor
in vivo
, hemos desarrollado un modelo de xenoinjerto de adenocarcinoma de páncreas en ratones. Estos animales fueron tratados con Fuc-Liposoma-Cisplatino dos veces a la semana. El crecimiento del tumor se inhibió significativamente por el tratamiento con F50-Liposoma-cisplatino en comparación con ningún tratamiento, F0-Liposoma-Ciplatin, o cisplatino solo, lo que sugiere que F50-Fuc-Liposoma podría entregar cisplatino específica y eficazmente (Figura 6A y 6B). En HE tinción de tejidos tumorales, se observaron muchas células viables en ratones no tratados. El número de células tumorales se redujo en los ratones tratados tratados con cisplatino y F0-Liposoma-Cisplatino en comparación con los ratones no tratados. Sin embargo, en ratones tratados con F50-Liposoma-cisplatino, las células tumorales desaparecieron casi por completo. TUNEL tinción reveló la presencia de un mayor número de células apoptóticas en los tumores tratados con F50-Liposoma-cisplatino que en los controles (Figura 6C), posiblemente debido a la más marcada acumulación de cisplatino en el tejido tumoral (Figura 6D). También hemos probado los efectos de Fuc-liposoma-cisplatino sobre la supervivencia en un modelo ortotópico de hígado y metástasis
in vivo utilizando células
BxPC-3-Luc. Como se muestra en la Figura 6E, la supervivencia de los ratones tratados con Fuc-liposomas El cisplatino fue significativamente prolongado en relación con los ratones no tratados, o con relación a los ratones tratados con cisplatino solo o F0-Liposoma-Ciplatin. En el modelo ortotópico, el tamaño del tumor en ratones tratados con cisplatino solo o F0-Liposoma-cisplatino fue casi el mismo tamaño, pero los tumores en ambos grupos eran más pequeñas en relación con sin tratar. Por el contrario, el tumor en ratones tratados con Fuc-liposoma-Cisplatino no fue detectada por
in vivo
de imágenes (Figura 6F).
(A, B) Comparación de la supresión del crecimiento tumoral con cisplatino, F0-liposoma-cisplatino y F50-liposoma-cisplatino en ratones AsPC-1-cojinete. Se inyectó cisplatino (2 mg /kg), F0-Liposoma-cisplatino (2 mg /kg), o solución F50-Liposoma-cisplatino (2 mg /cisplatino /kg) a través de la vena de la cola de ratones portadores de ASPC-1 dos veces a la semana. A las 4, 8, 11, 15, 18, y 22 días después del trasplante, se midieron los volúmenes tumorales. imagen representativa de los ratones tratados con cisplatino (B). Los resultados se expresan como la media ± SD (n = 6). * P & lt; 0,01 en comparación con NT, cisplatino y F0. (C) El tejido tumoral se preparó en el día 22 después del tratamiento. Tinción HE (panel superior) y la tinción de TUNEL (panel inferior) se presentan. (D) La concentración de platino en el tejido del tumor medido por ICP. tasa de (E) Supervivencia de los ratones tratados con cisplatino solo, F0-Liposoma-Ciplatin, y F50-Liposoma-Ciplatin en el modelo de metástasis de hígado usando BxPC-3 células. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba de Wilcoxon generalizada. * P & lt; 0,01 en comparación con NT, cisplatino y F0. (F) La localización de las células BxPC3-Luc en el modelo ortotópico detectado usando un sistema de imágenes IVIS después de 3 semanas de tratamiento.
No se observaron efectos adversos, incluyendo cambios en el peso corporal, atribuibles a la administración de cualquiera de D se observaron manosa o F50-liposoma-cisplatino durante este estudio (Tabla S4).
Discusión
Hemos generado y caracterizado liposomas L-fucosa unida que contienen cisplatino, y han demostrado que Fuc -Liposome-cisplatino es mucho más eficaz que el cisplatino solo en la inhibición de la proliferación de las células cancerosas que producen CA19-9-
in vitro
y el crecimiento tumoral
in vivo
. experimentos farmacocinéticos junto con la cuantificación de cisplatino en comparación con los sistemas orientados que no son objeto de entrega tanto en
vitro
y
in vivo
confirmó además que la inhibición del crecimiento tumoral se debe a la administración dirigida. Por lo tanto, nuestra estrategia de utilización de las características biológicas de CA19-9 la producción de células de cáncer de páncreas es prometedor, con respecto a la orientación específica de las células cancerosas.
Hemos modificado la superficie del liposoma acoplando Tris a través de BS
3, y la reticulación aminado L-fucosa a través de DTSSP para lograr suficiente sigilo y la orientación de función (figura 1A). la distribución del tamaño de partícula se mantuvo estable después de almacenamiento a 4 ° C durante 6 meses. Nuestros liposomas son capaces de realizar varias clases de fármacos que se utilizan comúnmente para el tratamiento del cáncer, tales como doxorrubicina, oxaliplatino y CPT-11 (datos no mostrados)
.
Si bien se ha informado de que la tasa de supervivencia postoperatoria es significativamente peor en pacientes con adenocarcinoma cuyos niveles de CA 19-9 son notablemente elevada [28], nuestros resultados indican que estos pacientes con cáncer de páncreas expresando CA19-9 serían candidatos apropiados para el tratamiento con Fuc-liposomas que llevan medicamentos contra el cáncer.
Fucose se utiliza fisiológicamente para fucosilación de glicoproteínas en muchos tipos de células, especialmente en el hígado a través de los receptores de manosa /fucosa, que se expresan abundantemente en la misma [41] - [43]. En experimentos preliminares, se observó alta acumulación de Cy5.5 probablemente a través de las células no parenquimatosas y células de Kupffer. Sin embargo, tuvimos éxito en el mantenimiento de la acumulación de liposomas mediante la administración de manosa a través de la vena de la cola, lo que resultó en la selección y confirmación del tumor preclínico de seguridad para el potencial aplicación clínica [45].
Escherichia coli
, la captación celular de L-fucosa está mediada por importante symporter protón familia facilitador, FucP [46]. Recientemente, la estructura del transportador de L-fucosa fue identificado en
E. coli
[47]. Sin embargo, en los seres humanos, el mecanismo de captación celular L-fucosa es todavía controvertida, tanto con la difusión y el sistema de transporte activo propuesto como principales vías para la absorción de L-fucosa en la célula [31]. Nuestros Fuc-liposomas penetran en las células productoras de CA19-9 en 10 minutos y se inhiben por el exceso de L-fucosa, lo que indica la existencia de un sistema de transportador o internalización mediada por receptores específicos en las células, en lugar de simplemente una difusión no específica sistema. De hecho, los ensayos de unión al receptor revelaron receptores de alta afinidad L-fucosa específica sobre AsPC-1 en las células (Figura 3). Sin embargo, se necesita más investigación para resolver este problema.
Los efectos adversos sobre la hematopoyesis, especialmente en la producción de glóbulos rojos, eran una preocupación importante con el uso de Fuc-liposomas que llevan medicamentos contra el cáncer, pero no hubo ningún cambio en o bien la formación de colonias
in vitro
o supresión de la médula ósea en
in vivo
durante el tratamiento. Aunque estos efectos adversos también tendrán que ser examinados para cuando se utiliza Fuc-liposomas que llevan fármacos contra el cáncer que no sean cisplatino, tales como doxorrubicina, sospechamos que, dado el requerimiento límite de las células normales para la L-fucosa o su suministro limitado a través de la normalidad los vasos sanguíneos, el efecto EPR y la toxicidad para las células espectadoras serían mínimas.
el presente informe es el primero en describir que tenía como objetivo el suministro de un fármaco citotóxico como un nanoconjugado L-fucosa puede inhibir de manera eficiente
in vivo
crecimiento de las células del cáncer pancreático. Por otra parte, las nanopartículas de L-fucosa que desarrollamos pueden ser explotados como vehículos de suministro para otros medicamentos contra el cáncer. Esta estrategia podría extenderse como un enfoque generalizado para el tratamiento de una amplia variedad de otros carcinomas CA19-9-productores, como colorrectal (~ 80% CA19-9 positivo), el tracto biliar (70~80% positivo), y gástrico carcinoma (20~50% positivo) [48], además de adenocarcinoma de páncreas (~ 80% positivo) [26], [27]. En conclusión, Fuc-liposoma que contiene medicamentos contra el cáncer debe proporcionar una nueva estrategia para el tratamiento activo del cáncer de focalización.
Materiales y Métodos
Materiales
dicloruro
Cis-diammineplatinum (II) ( El cisplatino), tetracloroplatinato de potasio (II), yoduro de potasio, solución acuosa de amoniaco (28%), nitrato de plata, dipalmitoilfosfatidil colina (DPPC), colesterol (Chol), dicetilfosfato (DCP), cholatehydrate de sodio (ácido cólico), albúmina de suero humano ( HSA), peryodato de sodio, óxido de deuterio (D
2O), hexacloroplatinato de sodio, tris (hidroximetil) aminometano (Tris), y L-fucosa se adquirieron de Sigma (St. Louis, MO, EE.UU.). Gangliósido se adquirió de Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, EE.UU.). Dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE) fue adquirido de Alexis (Plymouth Meeting, PA, EE.UU.). N-tris (hidroximetil) metil-3-amino-propano sulfónico (TAPS) y N- (2-hidroxietil) piperazina-N '- (2-etanosulfónico) de ácido se adquirieron de Dojin química (Kumamoto, Japón). cianoborohidrato de sodio se adquirió de Aldrich (Milwaukee, WI, EE.UU.). Bis (sulfosuccinimidil) suberato (BS
3) y 3,3-ditiobis (sulfosuccinimidilpropionato) (DTSSP) fueron adquiridos de Pierce Biotechnology (Rockford, IL, EE.UU.). Colesterol E-test Wako fue adquirido de Wako (Osaka, Japón). dicloroplatino de potasio se adquirió de Nacalai Tesque (Kyoto, Japón). Chroloquine se adquirió de Sigma.
Preparación de Cy5.5, FAM y cisplatino encapsulado en liposomas
Vea la sección S1 del texto.
Líneas Celulares
La líneas celulares de cáncer pancreático KP4, PK-59, PK-45h, MIA PACA-2, PANC-1, y HuCCT1 se obtuvieron de la célula Riken BRC Bank. AsPC-1 y BxPC-3 se adquirieron de la American Type Culture Collection. BxPC-3, AsPC-1, PANC-1, PK-45h, PK-59, y las células HuCCT1 fueron cultivadas en RPMI 1640 (Gibco) suplementado con 10% de FBS, L-glutamina, y 1% de penicilina-estreptomicina. KP4 y MIA PaCa-2 se cultivaron en DMEM (Gibco) suplementado con 10% de FBS, L-glutamina, y 1% de penicilina-estreptomicina.