Extracto
El cáncer de ovario es una enfermedad altamente letal con mal pronóstico y sobre todo en tumores de alto grado. Nuevas pruebas ha informado de que la regulación positiva aberrante y la activación de GRB7, ERK, así como FOXM1 están estrechamente asociados con aggresivenesss de los cánceres humanos. Sin embargo, la interacción entre estos factores en la patogénesis de los cánceres humanos sigue siendo poco clara. En este estudio, se encontró que GRB7 (
P Hotel & lt; 0,0001), la fosforilación de ERK (
P Hotel & lt; 0,0001) y FOXM1 (
P
= 0,001) eran con frecuencia aumentado y asociado con tumores de alto grado, así como una alta tendencia en asociación con el cáncer de ovario en estadio avanzado por análisis inmunohistoquímico. Curiosamente, las expresiones de GRB7 (
P Hotel & lt; 0,0001), la fosforilación de ERK (
P Hotel & lt; 0,001) y FOXM1 (
P Hotel & lt; 0,001) mostró una significativa patrón de aumento escalonado a lo largo de Grado 1 a cánceres de ovario de grado 3. Los estudios bioquímicos utilizando Western blot demostraron que la expresión o desmontables de GRB7 forzada mostraron GRB7 podría elevar los niveles de fosforilación de ERK y FOXM1, mientras que la expresión forzada de FOXM1 no podía alterar los niveles de fosforilación de ERK GRB7 y. Pero la inhibición de la señalización de ERK por U0126 o PD98059 podría reducir el nivel de FOXM1 en GRB7 que sobreexpresan las células de cáncer de ovario, lo que sugiere que GRB7, ERK y FOXM1 se regulan ordenada. Por otra parte, la inhibición de la actividad de ERK por U0126 o PD98059, o disminución de la expresión FOXM1 por Thiostrepton /invasión, el crecimiento del tumor inhibió significativamente la migración de células
in vitro
y
in vivo
. En conjunto, nuestros resultados confieren que la orientación GRB7 /ERK /cascada de señalización FOXM1 puede ser una opción terapéutica molecular prometedora en la lucha contra el cáncer de ovario
Visto:. Chan DW, Hui WWY, Cai PCH, Liu MX, Yung MMH, Mak CSL, et al. (2012) Orientación GRB7 /ERK /FOXM1 vía de señalización deteriora agresividad de las células de un cáncer ovárico. PLoS ONE 7 (12): e52578. doi: 10.1371 /journal.pone.0052578
Editor: Muy-Teck Teh, Barts & amp; La London School de Medicina y Odontología de la Universidad Queen Mary de Londres, Reino Unido
Recibido: 30 Agosto, 2012; Aceptado: noviembre 20, 2012; Publicado: December 20, 2012
Derechos de Autor © 2012 Chan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Fundación Wong Compruebe Ella Beneficencia. La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario es la enfermedad más letal entre los tumores malignos ginecológicos [1], [2]. La alta tasa de mortalidad de cáncer de ovario es debido a un mal pronóstico y se detectan mayoría de los casos en la etapa tardía. El cáncer de ovario es un tumor heterogéneo que presenta una amplia gama de citológico, clínica y características genéticas alteradas [3], [4]. los cánceres de ovario de alto grado se caracterizan por los núcleos de alto grado, un índice mitótico alto, más agresividad, mal diferenciado, menos sensible a la quimioterapia, así como baja tasa de supervivencia [4], [5], [6]. Las características patogénesis y clínico-patológicas relativamente peores de los cánceres de ovario de alto grado causan mala gestión clínica de este tipo de enfermedad. Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes puede ayudar en el desarrollo de la terapia mejor curativa en los cánceres de ovario agresivos.
proteína unida al receptor del factor de crecimiento 7 (GRB7) es un adaptador de la señalización que funciona a las señales de par de receptores de superficie celular específico a vías de señalización [7]. evidencias emergentes han informado de que GRB7 se sobreexpresa y acompañado generalmente con la sobreexpresión de erbB2 en los cánceres humanos [8], [9]. análisis clinicopatológicas han demostrado que el GRB7 upregulated se asocia con comportamiento metastásico [8], [10], [11], [12]. Además, la activación constitutiva de ERK ha sido implicado en una variedad de comportamientos tumorigénicas tales como la proliferación celular, la diferenciación, la metástasis, la angiogénesis y la quimiorresistencia en los cánceres humanos [13], [14], [15], [16]. Además, Forkhead Box M1 (FOXM1) se ha identificado como un factor de transcripción oncogénico que se upregulated frecuentemente en numerosos cánceres humanos [17], [18], [19]. Recientemente nosotros y otros han encontrado que la regulación al alza de FOXM1 aumenta la proliferación celular, la migración /invasión y sobre todo su expresión está implicado en la progresión del cáncer [17], [20], [21], [22]. Curiosamente, los tres factores anteriores parecen converger hacia las propiedades agresivos contra el cáncer como de alto grado y tumores en estadios avanzados, sin embargo, la relación de su mecanismo de regulación no ha sido completamente dilucidado. Por lo tanto, la delimitación de la interacción de sus mecanismos reguladores ayudarán a explorar una posible diana terapéutica en el cáncer de ovario.
En este estudio, mostramos que las expresiones de GRB7, ERK y FOXM1 se correlacionaron significativamente con la progresión de cáncer de ovario. También se describe el mecanismo de regulación de GRB7 ERK /FOXM1 cascada /señalización y la inhibición de esta señalización utilizando el U0126 inhibidor químico o un inhibidor de FOXM1 Thiostrepton notablemente podido derogar la migración de células de ovario de cáncer /invasión, y
in vitro
y vivo
el crecimiento del tumor
In. Nuestros resultados enfatizan la importancia de la vía GRB7 /ERK /FOXM1 en las propiedades oncogénicas y sostienen esta vía para una prometedora diana terapéutica en el cáncer de ovario de alto grado.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y Las drogas
Dos líneas celulares de cáncer de ovario: A2780cp (regalos de Prof. BK Tsang, Departamento de Obstetricia & amp; Ginecología, Universidad de Ottawa) [23], y OVCA433 (obtenido de la American Type Culture Collection, Rockville, MD), así como dos GRB7 clones que expresan de forma estable; C19 en OVCA433 y C15 en A2780cp que se generaron previamente [12] se incluyeron en este estudio. Todos fueron cultivadas a 37 ° C en 5% de CO
2 en medio esencial mínimo o medio de Eagle modificado de Dulbecco suplementado con suero bovino fetal 10%. MAPK /ERK quinasa 1/2 (MEK1 /2) inhibidores de PD98059 y U0126, y el inhibidor de FOXM1 Thiostrepton se obtuvieron de Calbiochem (La Jolla, CA, EE.UU.).
Plásmidos y transfección celular
El pEGFP /GRB7 que expresa plásmidos se utilizaron como anteriormente [12]. Cuatro 29mer Hush ARNhc shRNA construye contra GRB7 en pGFP-V-RS vector se adquirieron de OriGene Tecnologías para la generación de células GRB7 estables desmontables (Cat. No. TG312621, OriGene Technologies, Inc, Rockville, MD, EE.UU.). El no efectiva 29-mer revueltos shRNA (TR30013) (OriGene Technologies) se utilizó como control negativo. Para desmontables FOXM1 humano, el Kit TriFECTa® RNAi que contiene tres siRNAs dirigidos FOXM1 humano se adquirió de IDT (Integrated DNA Technologies, Inc., Iowa, EE.UU.). Transfección de células se llevó a cabo utilizando Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Los patrones de expresión se analizaron por transferencia Western. El vector parental pEGFP-C1 se utilizó como control del vector vacío.
inmunohistoquímica y Western blot Los análisis
inmunohistoquímica (IHC) tinción para GRB7, la fosforilación de ERK y FOXM1 se realizó en una matriz de tejido de cáncer de ovario (OVC1021) (Pantomics Inc, San Francisco, CA) usando primario policlonal anti-GRB7 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA), anti-fosfo-ERK (Chemicon International, Inc., Temecula, EE.UU.), y anti-FOXM1 (Abcam, Inc., Cambridge, MA, EE.UU.). El porcentaje de células inmuno-positivos en tumores y epitelio normal se evaluó mediante la proporción de células inmuno-positivos varió de 10 a 100%, y la intensidad de la tinción anotaron como 0 (negativo), 1 (leve), 2 (moderada) , 3 (fuerte) y 4 (marcado). La inmunorreactividad para cada caso se obtuvo como un porcentaje de las proporciones de células inmuno-positivo multiplicado por la intensidad de la tinción. El factor de cambio de cada tinción se obtiene dividiendo el nivel de expresión de cada muestra de cáncer por el valor de tinción inmunorreactiva media de ovarios normales y cistoadenoma mixto límite. La cuantificación de la tinción inmunohistoquímica se anotó ciegamente al menos por dos observadores independientes.
Por Western blot, las células se lisaron con tampón de lisis celular (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) que contiene de cóctel inhibidor de la proteasa (Roche, Indianapolis , IN) y PMSF (fluoruro de fenilmetilsulfonilo) (Sigma Chemical Co. St. Louise, MO). Las muestras se resolvieron mediante SDS-PAGE y electrotransferencia sobre Immobilon-P de transferencia de membrana (Millipore Corporation, Bedford, MA). Las transferencias se bloquearon con leche desnatada 5%, seguido de incubación con anti-GRB7, FOXM1 (Santa Cruz), GFP (Abcam), fosfo-ERK, ERK (Cell Signaling), y
β-
actina (Sigma Chemical Co, St Louis, MO). Las transferencias se incubaron después con anticuerpo de cabra anti-conejo o conjugado de anticuerpo secundario anti-ratón con peroxidasa de rábano picante (Amersham Pharmacia Biotech, Cleveland, OH) y se visualizaron mediante quimioluminiscencia mejorada (ECL) (Amersham).
Cell Viabilidad Análisis
la viabilidad celular se midió por el kit de proliferación celular II (XTT) durante 5 días de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Roche). Los datos fueron recolectados a partir de al menos tres experimentos independientes.
La migración celular y la invasión Ensayos
Para cuantificar las células capacidades migratorias e invasivas de las células del cáncer de ovario, la migración celular y la invasión celular kits de ensayo Transwell (Chemicon International, Inc., Temecula, CA) se utilizaron en este estudio de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En breve, 1,5 × 10
5 células se resuspendieron en suero libre medio de cultivo (Thiostrepton, PD98059 o se añadió U0126 cuando sea necesario) y se sembraron en la cámara superior, mientras que el medio completo se colocó en la cámara baja como quimio-atrayente . La placa se incubó a 37 ° C y 5% de CO
2 durante 12 horas para el ensayo de migración de células, y 48 hrs para el ensayo de invasión de las células permitiendo que las células pasen a través de los poros en la membrana. La célula migra e invadió las tasas fueron calculadas después de la tinción celular y recuento mediante el uso de al menos tres campos diferentes para cada filtro transwell. Los experimentos se repitieron tres veces.
En Vivo
tumorigenicidad Ensayo
Para examinar el
in vivo
efectos de U0126 y Thiostrepton en el desarrollo de tumores, 5 × 10 sc
6 se inocularon células A2780cp en
BALB /c nu /nu
ratones hembra de 3-4 semanas de edad y en grupos de cinco. La formación de tumores en ratones desnudos se controló por cada 3 días. 25 a 50 mmol /kg de U0126 o de 200 a 300 mmol /kg i.p. Thiostrepton (Calbiochem, La Jolla, CA, EE.UU.) se administró una vez por cada 3 días con un total de 4 inyecciones en cinco ratones desnudos cuando cada tamaño del tumor se convirtieron en ~ 3 mm de diámetro. Como grupo control, DMSO solo fue administrado i.p. para el mismo tiempo de tratamiento. Los tamaños de los tumores se midieron usando calibradores de diapositivas y se calcularon mediante la siguiente fórmula: volumen = (anchura)
2 * longitud * π /6. Las curvas de crecimiento de los tumores se representan gráficamente a partir del volumen media ± SEM de los tumores a partir de 5 ratones. Los efectos secundarios tales como cambios de peso corporal fueron monitorizados estrechamente. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de la Universidad de Hong Kong sobre el uso de animales vivos en la Enseñanza y la Investigación (CULATR No.2560-11).
Análisis estadístico
Los parámetros clínicos fueron analizada por el software SPSS 13.0 (SPSS, Chicago, IL). La prueba exacta de Fisher (para datos paramétricos) y la prueba de Mann-Whitney (para datos no paramétricos) se utilizaron para comparar los valores entre los subgrupos. de Student
t-test
se utilizó para analizar la viabilidad celular, la migración /invasión y
in vivo
resultados del crecimiento del tumor. Un
p-valor
fue considerado significativo cuando menos de 0,05.
Resultados
GRB7, ERK fosforilación y FoxM1 son elevados frecuentes en el cáncer de ovario
han informado anteriormente de que GRB7 [12], la fosforilación de ERK y FOXM1 [21] se sobreexpresan en muestras de cáncer de ovario en particular en tumores de alto grado. Sin embargo, aún no se ha dilucidado la interacción entre estos factores en los cánceres de ovario. Mediante análisis inmunohistoquímico (IHC) en una matriz de tejido de cáncer de ovario (OVC1021), se encontró que todos estos factores fueron upregulated congruentemente en muestras de cáncer de ovario que era consistente con nuestros resultados anteriores [12], [21]. Como era de esperar, la GRB7 sobreexpresada (& gt; 4 pliegues) se correlacionó con el aumento de la fosforilación de ERK (& gt; 2 pliegues) (
P Hotel & lt; 0,0001, de la prueba exacta de Fisher) (GT &; 3 pliegues) y FOXM1 (
P Hotel & lt; 0,0001, prueba exacta de Fisher) (Tabla 1). Además, GRB7 (
P Hotel & lt; 0,0001, prueba exacta de Fisher), la fosforilación de ERK (
P Hotel & lt; 0,0001, de prueba exacta de Fisher), y FOXM1 (
P
= 0,001, prueba exacta de Fisher) se correlacionaron significativamente con tumores de alto grado y tenía una alta tendencia en asociación con el cáncer de ovario en estadio avanzado (GRB7,
P = 0,021
; fosfo-ERK,
P
= 0,065; y FOXM1,
P = 0,065
, la prueba exacta de Fisher) (Tabla 1). Es de destacar que un aumento progresivo significativo de GRB7 (
P Hotel & lt; 0,001, de la prueba de Mann-Whitney), la fosforilación de ERK (
P Hotel & lt; 0,001, de la prueba de Mann-Whitney), y FOXM1 (
P Hotel & lt; 0,001, prueba de Mann-Whitney) se observó patrón de expresión de Grado 1 a tumores de grado 3 (Fig. 1A y 1B) y un patrón menos evidente desde la primera a la fase avanzada de cáncer de ovario (Figura S1 ), lo que sugiere que estos factores juegan un papel importante en la progresión del cáncer de ovario. Tomados en conjunto, estos datos indican que hay una interacción estrecha entre GRB7, la actividad de ERK y FOXM1 en la regulación de cáncer de ovario oncogénesis sobre todo en tumores de alto grado.
(A) se evaluaron Las expresiones de GRB7, la fosforilación de ERK y FOXM1 mediante análisis inmunohistoquímico utilizando anticuerpos específicos en una matriz de tejido de cáncer de ovario (OVC1021, Pantomics). (B) Representante imágenes muestran el incremento escalonado de la GRB7, la fosforilación de ERK y expresiones FoxM1 de grado 1 al grado 3 cáncer de ovario (subtipo seroso) (200 × aumentos).
regulación molecular de GRB7 /ERK /FOXM1 señalización en las células del cáncer ovárico
Dado que el aumento de la GRB7, la fosforilación de ERK y FOXM1 se correlaciona significativamente con tumor de ovario de alto grado, que se puede regular de forma coordinada con el fin de mediar funciones oncogénicas en la progresión del cáncer de ovario . Estábamos interesados tanto, para investigar el mecanismo de regulación entre estos factores en las células de cáncer de ovario. Para este propósito, tanto A2780cp y OVCA433 células se trataron en primer lugar con U0126 inhibidor de MEK1 /2. transferencia Western mostró que la fosforilación de ERK y FOXM1 se redujeron notablemente, pero no se observó cambio en la expresión GRB7 (Fig. 2A). Además, el tratamiento de Thiostrepton logrado reducir el nivel de FOXM1, mientras que los niveles de fosforilación de ERK GRB7 y todavía estaban sin cambios (Fig. 2B). Para excluir la función no específica de Thiostrepton en el tratamiento de dosis alta, mediada por siRNA desmontables enfoque FOXM1 se llevó a cabo en las células A2780cp. Al igual que en el tratamiento de la Thiostrepton, el agotamiento de FOXM1 no alteró la expresión de GRB7 y la fosforilación de ERK (Fig. 2B). Esto indica que la supresión de la actividad ERK podría disminuir el nivel de FOXM1, mientras que la reducción de la expresión FOXM1 no afecta ni a la expresión o actividad GRB7 ERK. A fin de probar esta observación, de manera estable desmontables de GRB7 endógena en un GRB7 alta línea celular que expresa, OVCA433, utilizando el enfoque shRNA mostraron claramente que no sólo GRB7 sino también la fosforilación de ERK y FOXM1 se redujeron (Fig. 2C). Por el contrario, la expresión forzada de GRB7 aumento de la fosforilación de ERK y FOXM1 en A2780cp y OVCA433 células (Fig. 2D). Por otro lado, el tratamiento de cualquiera de U0126 o PD98059 MEK1 /2 inhibidores podría reducir no sólo la fosforilación de ERK pero también FOXM1 en células que expresan ectópicos GRB7 (Fig. 2D). En conjunto, estos resultados confieren que regula al alza GRB7 positivamente la actividad de ERK que a su vez eleva FOXM1 en células de cáncer de ovario.
(A) El tratamiento con U0126 (5 M) mostraron una reducción significativa en la expresión de la fosforilación de ERK acompañado con FOXM1 en tiempo de ovario células de cáncer dependiente, mientras que no se encontró ningún cambio en la expresión en células GRB7 A2780cp. (B) Tratamiento de Thiostrepton (20 M) redujo notablemente la expresión de FOXM1 única pero ningún cambio en las expresiones de GRB7 y la fosforilación de ERK en células A2780cp (
la izquierda). El agotamiento de FOXM1 por siRNA desmontables no alteró la expresión de GRB7 y ERK fosforilación (
derecha). C, revueltos siRNA control. SI1, SI2 y SI3 siRNAs dirigidos tres regiones diferentes de FOXM1 humana y desmontables la expresión de FOXM1 en un 60%, 45% y 70%, respectivamente. (C) Dos de los cuatro GRB7 shRNA construcciones (SH1 y SH2) mostraron ~ 70% desmontables de GRB7 acompañada con una reducción de ERK fosforilación y FOXM1 expresiones en OVCA433 células. El control mezclado (NC) se utilizó como control negativo. (D) la expresión forzada de GRB7 aumento de la fosforilación de ERK y FOXM1. Sin embargo, el tratamiento con U0126 (10 mM) o PD98059 (20 mM) podrían suprimir la fosforilación inducida por ERK y FOXM1 en A2780cp y OVCA433 células de cáncer de ovario.
supresión de la actividad de ERK o expresión FOXM1 Disminuciones de ovario La migración celular y la invasión del cáncer
Se ha documentado que las exposiciones de tumor de ovario de alto grado de alta capacidad en la migración celular /invasión [4], [24]. Por lo tanto, nos preguntamos si la inhibición de la actividad de ERK o expresión FOXM1 por sus inhibidores específicos podría influir en la migración celular y la invasión de células de cáncer de ovario. Para comprobar esta hipótesis, una línea celular de cáncer de ovario de alto grado, OVCA433, se presentan altas capacidades migratorias e invasivas se expresó ectópica con GFP /GRB7 y tratados con inhibidores. Los resultados mostraron que el tratamiento de Thiostrepton, PD98059 y U0126 reduce notablemente la tasa de migración celular de las células OVCA433-GRB7 por 3,5 veces, 2,2 veces y 2,5 veces, respectivamente, en comparación con el control (Fig. 3A). Asimismo, el tratamiento de Thiostrepton, PD98059 y U0126 también redujo significativamente la tasa de invasión celular de las células OVCA433-GRB7 por 3,5 veces, 2,6 veces y 2,9 veces, respectivamente, en comparación con el control (Fig. 3B). Estos hallazgos sugieren que la inhibición de la señalización /ERK /FOXM1 GRB7 es capaz de afectar a la migración celular y la invasión de células de cáncer de ovario.
OVCA433 células con expresión estable de GFP /GRB7 (OVCA433-GRB7) fueron tratados con DMSO como control, Thiostrepton (20 M), PD98059 (20 mM) y U0126 (10 mM) durante 6 horas y se analizaron por (a) ensayo de migración celular Transwell. La imágenes representativas y gráfico de barras mostró una reducción significativa en el número de células migratorias a través de la membrana recubierta con Matrigel en las células OVCA433-GRB7 tratados con Thiostrepton, PD98059 y U0126 de control de DMSO (*
P Hotel & lt; 0,02, Estudiante
t-test
) a las 8 horas; ensayo de invasión celular (B) Transwell. La imágenes representativas y gráfico de barras mostró una reducción significativa en la tasa de invasión en las células OVCA433-GRB7 tratados con Thiostrepton, PD98059 y U0126, en comparación con el control de DMSO (*
P Hotel & lt; 0,05, Estudiante
t
-test) a 15 horas.
Orientación GRB7 /ERK /FoxM1 inhibe el cáncer de ovario crecimiento tumoral
in vitro
y
in vivo
estudios anteriores han demostrado que la activación constitutiva de la actividad de ERK o aumento de la expresión de GRB7 y FOXM1 están estrechamente asociados con la tumorigenicidad de varios cánceres humanos [12], [16], [21], [25], [26]. Esto sugiere que hay una orientación a los componentes de esta cascada de señalización deben derogar la teoría, las propiedades oncogénicas en células de cáncer de ovario. De hecho, las publicaciones anteriores reportaron que desmontables de FOXM1 y ERK podría reducir el crecimiento celular y la invasividad de los cánceres humanos [27], [28], [29]. En este estudio, que tuvo como objetivo analizar las alteraciones oncogénicas mediante el uso de inhibidores farmacéuticos dirigidos específicamente cascada GRB7 /ERK señalización /FOXM1. por lo tanto, en primer lugar se evaluó el efecto supresor sobre la proliferación celular de líneas celulares de cáncer de ovario seroso dos de alto grado; A2780cp y OVCA433 usando U0126 (10 mM). Por ensayo de proliferación celular XTT, tanto A2780cp (
P = 0,02
, Estudiante
t-test
) y OVCA433 (
P = 0,03
, Estudiante
t
-test) mostraron reducción significativa en la tasa de proliferación celular en comparación con sus controles (Fig. 4A). Del mismo modo, tras el tratamiento de Thiostrepton (20 mM), A2780cp (
P = 0,015
, Estudiante
t-test
) y OVCA433 (
P = 0,025
, Estudiante
t-test
) también mostraron una profunda reducción en la tasa de proliferación celular en comparación con sus controles (Fig. 4B).
(a) XTT ensayos de proliferación celular mostraron que la inhibición de la fosforilación de ERK por U0126 (10 M) abrogó significativamente la tasa de proliferación celular en GRB7 expresan de forma estable OVCA433 células (
P = 0,020
, Estudiante
t-test
) y las células A2780cp (
P =
0.030, Estudiante
t-test
) en comparación con sus controles de vectores. (B) XTT ensayos de proliferación celular mostraron que la supresión de la expresión FOXM1 por Thiostrepton (20 M) redujo significativamente la tasa de proliferación celular en GRB7 expresan de forma estable OVCA433 células (
P
= 0,015, Student
t
-test) y las células A2780cp (
P = 0,025
, Estudiante
t-test
) en comparación con sus controles de vectores.
a continuación examinó el
in vivo
actividad tumorigénico de GRB7 en A2780cp por inoculación subcutánea GRB7 y control de vectores que expresan las células A2780cp en un flanco de ratones desnudos. Como era de esperar, las células que expresan de forma estable GRB7 A2780cp exhibió el crecimiento del tumor 30% más rápido en comparación con el control de vectores (
P = 0,020
, Estudiante
t-test
) (Figura S2). A continuación se investigó el efecto supresor sobre el crecimiento tumoral de GRB7 expresan de forma estable A2780cp tras el tratamiento de U0126 o Thiostrepton. Cuando el tamaño del tumor alcanzó ~ 3 mm de diámetro en el tumor de ratones lampiños con el día 6, U0126 en 25 y 50 micras /kg fue i.p. se inyecta en la cavidad peritoneal de ratones desnudos por cada 3 días. Después de 4 tiempos de inyección U0126, se encontró que había un 35% y 72% de reducción en el tamaño del tumor en comparación con el control de DMSO en el Día 18 cuando se inyecta con U0126 a 25 micras /kg (
P = 0,032
, Estudiante
t-test
) y 50 mM /kg (
P = 0,005
, Estudiante
t-test
) respectivamente (Figura 5A y 5B). Además, tras el tratamiento de Thiostrepton de 200 micras /kg y 300 micras /kg en el Día 9, había 47% y la reducción de 52% en el crecimiento del tumor en comparación con el control de DMSO en el Día 18, respectivamente (
P
& lt; 0,01, Estudiante
t-test
) (Figura 5A y 5B). Estos resultados ponen de manifiesto que la regulación al alza de GRB7 podría mejorar el crecimiento del tumor, mientras que utilizando U0126 o Thiostrepton podría reducir eficazmente el crecimiento de los tumores de las células de cáncer de ovario tanto
e in vitro
in vivo
.
(A) el GRB7 expresan de forma estable células A2780cp (ACP-Grb7) se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones desnudos. Los ratones se dividieron en 5 grupos (5 ratones por grupo) y tratados con DMSO como control, o U0126 (25 o 50 mu M /kg) o Thiostrepton (200 o 300 mu M /kg) por cada 3 días desde el día 6 (las flechas representan las inyecciones). El tamaño relativo del tumor se calculó con relación a los de la primera día del tratamiento (día 0) y se representan como tamaño medio relativo (%) ± SE para cada grupo (*
P
= 0. 032, **
P Hotel & lt; 0,01 y ***
P
= 0. 005, son significativamente diferentes del grupo control de DMSO, Estudiante
t-test
). (B) Las imágenes representativas y gráficos de barras muestran el peso medio del tumor de cada grupo tomada en el día 18. (*
P
= 0. 043, **
P
= 0. 001, y ***
P Hotel & lt; 0,02, son significativamente diferentes del grupo control de DMSO, Estudiante
t-test
) guía empresas
Discusión
en este estudio, se presenta evidencia de que GRB7, la fosforilación de ERK y FOXM1 se incrementan en el cáncer de ovario. Curiosamente, el aumento concomitante de GRB7, la fosforilación de ERK y FOXM1 se asocia con cánceres de ovario de alto grado. Es importante destacar, que muestran que estos factores son regulados coordinadamente en GRB7 /ERK /eje de señalización en las células de cáncer de ovario FOXM1. Funcionalmente, la inhibición de la actividad de ERK por U0126 o PD98059 y expresión FOXM1 por Thiostrepton notablemente inhibir el crecimiento de la migración de células de cáncer /tumor de ovario invasión y
in vitro
y
in vivo
. Estos hallazgos ponen en evidencia claramente que la cascada de señalización GRB7 /ERK /FOXM1 activada juega un papel importante en la patogénesis del cáncer de ovario de alto grado.
La activación constitutiva de la vía de señalización de ERK ha estado involucrado en el desarrollo del cáncer humano [30] , [31], [32]. De hecho, la orientación de esta vía para combatir los cánceres humanos ha atraído a un montón de esfuerzo para desarrollar fármacos eficaces en la última década [15], [33], [34], [35]. Nosotros y otros han encontrado recientemente que GRB7 y su variante, GRB7v, son frecuentemente regulados por incremento en cánceres de ovario y son capaces de aumentar la proliferación celular, la migración /invasión a través de la activación de ERK vía de señalización [12], [36], [37]. En el otro aspecto, las evidencias emergentes han encontrado que la regulación al alza del factor de transcripción aberrante FOXM1 está implicado en la patogénesis de diversos cánceres humanos [17], [21], [22], [38], [39]. Aunque todos estos factores aberrantemente activadas están asociados predominantemente con la patogénesis del cáncer, no existe ningún informe hasta ahora mencionar el enlace de señalización entre GRB7, la actividad de ERK y FOXM1 en células de cáncer humano. En este estudio, mediante el uso de análisis de IHC de la matriz de tejido de cáncer de ovario, se muestra que la fosforilación GRB7, ERK y FOXM1 se incrementan de forma concomitante en muestras de cáncer de ovario. Curiosamente, sus expresiones muestran un incremento escalonado a lo largo del grado del tumor de cáncer de ovario. De hecho, nuestro análisis correlación clínico proporciona evidencia adicional de que sus expresiones upregulated están significativamente asociados con tumores de alto grado. Como sabemos, éste es el primer informe que muestra el estado de expresión de estos factores que intervienen en la progresión de los cánceres de ovario hasta el momento. En conjunto, estos hallazgos indican que la fosforilación GRB7, ERK y FOXM1 forman una convergencia oncogénica en la patogénesis del cáncer de ovario de alto grado. Por lo tanto, la orientación de esta cascada de señalización puede lograr un buen resultado en el tratamiento de este tipo de enfermedad.
GRB7 es un adaptador conocido que retransmite señales desde receptores de superficie celular a las cascadas de señalización corriente abajo específicos a través de la interacción proteína-proteína de su Src -homology 2 (SH2) de dominio a una variedad de tirosina quinasas [7], [40], [41]. Nosotros y otros han informado anteriormente de que GRB7 es frecuentemente sobreexpresado y promueve la proliferación celular, la migración celular y la invasión de células de cánceres humanos [10], [12], [42]. Dado a sus papeles importantes como moléculas de transducción de señal en la activación de vías de señalización oncogénicas, numerosos estudios han intentado desarrollar inhibidores dirigidos al dominio SH2 de GRB7 con el fin de inhibir la activación aberrante de las actividades de señalización relacionados y la eliminación de las células del cáncer [43], [44] , [45], [46]. Para ejemplos, la combinación de Grb7 péptido cíclico, G7-18NATE, con quimio-fármacos eran capaces de inhibir el crecimiento de células de cáncer de mama [47], [48] metástasis, o con el ligando de péptido específico para suprimir GRB7 mediada en páncreas carcinoma etc [11], [49]. Sin embargo, la especificidad y afinidad son los principales obstáculos encontrados en el desarrollo de estos inhibidores como GRB7-dirigida de agentes terapéuticos moleculares [26], [49], [50]. Aquí, nuestros datos muestran que GRB7 regula la actividad de ERK y la expresión FOXM1 ordenada y está de acuerdo con nuestros informes anteriores [12], [21], lo que indica que la GRB7 sobreexpresada mejora el crecimiento de células de cáncer de ovario y la migración de células /invasión a través de la elevación de ERK y FoxM1 actividades. Por lo tanto, hemos propuesto que la supresión de la ERK activada aberrante y FOXM1 debe ejercer efectos similares de la utilización de inhibidor GRB7 en la inhibición de las propiedades oncogénicas por encima de las células de cáncer de ovario. De hecho, nuestro
in vitro
y
in vivo
estudios tumorigénicas muestran claramente que el crecimiento de células de cáncer de ovario y la migración celular /invasión se reducen notablemente en tratamientos de PD98059 o U01260, y Thiostrepton a través de la orientación MEK /ERK y actividades FoxM1 respectivamente. Más importante aún, los efectos supresores tumorales derivadas de cualquiera U0126 /PD98059 o Thiostrepton son equivalentes. Estos hallazgos parecen proporcionar un enfoque alternativo en el desarrollo de terapias dirigidas-GRB7 en el cáncer de ovario.
En resumen, este estudio muestra que la activación aberrante de GRB7 /ERK /FOXM1 cascada de señalización se correlaciona significativamente con el desarrollo de cáncer de ovario . La orientación de este eje señalización de MEK /ERK o inhibidores FoxM1 podría obtener efectos prometedores en la terapia basada en la transducción de señales para esta enfermedad.
Apoyo a la Información
Figura S1.
análisis inmunohistoquímicos mostraron expresiones de GRB7, aumentó la fosforilación de ERK y FOXM1 se asociaron con estadios avanzados de cáncer de ovario.
doi: 10.1371 /journal.pone.0052578.s001 gratis (TIF)
figura S2.
expresión forzada de GRB7 aumenta el crecimiento del tumor en el modelo de xenoinjerto de ratón. El GRB7 expresan de forma estable A2780cp células (ACP-GRB7) y control de vector vacío A2780cp células (ACP-V) se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones desnudos (5 ratones por grupo). El tamaño del tumor se monitorizó por cada 3 días. Las imágenes representativas y gráficos de barras muestran el peso medio del tumor de cada grupo tomada en el día 18. (*
P = 0,02
, Estudiante
t-test
)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0052578.s002 gratis (TIF)
Reconocimientos
gracias al profesor Guan Jun-Lin, Departamentos de Biología celular y del Desarrollo, Universidad de Michigan, para proporcionar el GRB7 ADNc de longitud completa.