Extracto
aberrante acetilación de histonas juega un papel esencial en el proceso neoplásico a través del silenciamiento epigenético de tumor genes supresores (ETG); Por lo tanto, la inhibición de histona desacetilasas (HDAC) se ha convertido en un objetivo prometedor en la terapéutica del cáncer. Para investigar la correlación de acetilación de histonas con las características clínico-patológicos y la expresión TSG, se analizó la expresión de H3 acetilada (AcH3), RARβ2, E-cadherina y β-catenina por inmunohistoquímica en 65 pacientes con carcinoma de células escamosas del cuello uterino. Los resultados revelaron que la ausencia de AcH3 se asoció directamente con pobre diferenciación histológica y la metástasis ganglionar, así como la reducción de expresión /negativo de RARβ2, E-cadherina y β-catenina en muestras de tumores clínicos. Además, demostró que la HDAC clínicamente disponibles inhibidores de ácido valproico (VPA) y el ácido hidroxámico suberoilanilida (SAHA), en combinación con el ácido trans-retinoico (ATRA), puede superar las barreras epigenéticos a la transcripción de RARβ2 en células de cáncer cervical humano. análisis de inmunoprecipitación de la cromatina mostró que el tratamiento de combinación incrementó el enriquecimiento de la histona acetilada en la región promotora RARβ2-RARE. En vista de estos resultados, se evaluaron los efectos antitumorales inducidos por el tratamiento VPA y ATRA combinados en un modelo de xenoinjerto implantados con carcinoma de células escamosas humano pobremente diferenciado. En particular, el VPA restauró la expresión RARβ2 través de la modulación epigenética. efectos antitumorales aditivos fueron producidos en xenoinjertos de tumores mediante la combinación de VPA con el tratamiento ATRA. De manera mecánica, el tratamiento de combinación reactiva la expresión de las ETG RARβ2, E-cadherina, P21
CIP1
y P53 y redujo el nivel de p-STAT3. Secuencialmente, la regulación positiva de involucrina y loricrina, que indican la diferenciación terminal, contribuyó fuertemente a la inhibición del crecimiento del tumor junto con apoptosis parcial. En conclusión, la terapia dirigida con inhibidores de HDAC y agonistas RARβ2 puede representar un nuevo enfoque terapéutico para los pacientes con carcinoma de células escamosas del cuello uterino
Visto:. Feng D, Wu J, Tian Y, Zhou H, Zhou Y, Hu W , et al. (2013) Orientación de las histonas desacetilasas para reactivación de los genes supresores de tumor y su potencial terapéutico en un modelo de xenoinjerto de cáncer de cuello uterino humano. PLoS ONE 8 (11): e80657. doi: 10.1371 /journal.pone.0080657
Editor: José Najbauer, Universidad de la Escuela Médica de Pécs, Hungría
Recibido: 25 de abril, 2013; Aceptado: 6 Octubre 2013; Publicado: 19 Noviembre 2013
Copyright: © 2013 Feng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (30901606, 81001168,81072127, 81372779 y 81372777) y la Fundación de Anhui Provincial de Ciencias Naturales (110406M176 y 110406M178). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
estudios recientes han sugerido que la alteración en la estructura de la cromatina que resulta de la acetilación de histonas puede ser importante para el proceso neoplásico [1] - [3]. El estado de acetilación de las histonas está determinada por la histona deacetilasa (HDAC) y la histona acetil transferasa (HAT). El desarrollo del cáncer es impulsado por los cambios genéticos y epigenéticos en el nivel celular que activan e inactivan los oncogenes y genes supresores de tumores (ETG), respectivamente [4]. silenciamiento transcripcional por la desacetilación de histonas es uno de los mecanismos bien establecidos de TSG inactivación [1], [5] - [7]. Algunos estudios han demostrado que las histonas desacetilada en regiones promotoras suprimen la expresión de las ETG, como
retinoblastoma
[8], los receptores de ácido retinoico-β (
RARβ
) [9],
p21
[10],
p53
[6],
p16
[11],
e-cadherina
[5], y muchos otros. Por lo tanto, la inhibición de las enzimas HDAC ha sido ampliamente aceptada como una estrategia para la modulación de la expresión génica a través de la inducción de hyperacetylation de histonas y la re-expresión de las ETG silenciados.
De todos los ETG, RARβ2, y E-cadherina desempeñar un papel esencial en la modulación del crecimiento y diferenciación celular en ambas células sanas y malignas [9]. La capacidad del ácido retinoico para actuar como un agente quimiopreventivo se facilita principalmente por su interacción con RARβ2 [9], [12]. E-cadherina es una molécula de adhesión intercelular en células epiteliales, que se une a beta-catenina para formar un complejo que juega un papel importante en el mantenimiento de la integridad morfológica de la epitelio normal [13], [14]. Los estudios de tumores epiteliales han demostrado consistentemente que la regulación a la baja de RARβ2 es un evento crucial en la malignidad y que la expresión aberrante posterior de los complejos de E-cadherina /beta-catenina se correlaciona con la conversión de los tumores en estadio temprano en tumores malignos invasivos [15], [ ,,,0],dieciséis]. La pérdida de la expresión RARβ2 en las células tumorales se ha atribuido a el silenciamiento de la región promotora del gen a través de la desacetilación de histonas y la hipermetilación. Por lo tanto, el uso de inhibidores de HDAC, ya sea solos o en combinación con ADN metiltransferasa (DNMT) inhibidores, se ha demostrado que restaurar la transcripción y de crecimiento efectos reguladores de RARβ2 [9], [17], [18]. Nuestro trabajo previo también ha revelado que la combinación de ácido valproico (VPA), un inhibidor de HDAC clínicamente disponibles, y el ácido todo trans retinoico (ATRA) promueve efectos sinérgicos en la reactivación de RARβ2 latente y fuertemente la inhibición del crecimiento de células de cáncer cervical
in vitro Opiniones y
in vivo fotos: por promover la diferenciación a través de la vía PI3K Akt /[19]. Sin embargo, a nuestro entender, la correlación entre la acetilación de histonas y la expresión TSG en muestras de tejido de cáncer de cuello uterino humanos y la explotación potencial de acetilación de histonas en la terapia dirigida contra el cáncer no se han evaluado completamente. En este estudio, se investigó la acetilación de las histonas H3 y expresión TSG en el cáncer cervical y su asociación con los parámetros clínico-patológicos. Además, se evaluó el potencial terapéutico del inhibidor de HDAC de VPA combinado con ATRA en el tratamiento de un modelo de xenoinjerto de tumor derivado de carcinoma de cuello uterino humano.
Materiales y Métodos
Ética declaración
este protocolo de estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad médica de Anhui. Las muestras de tejido de pacientes incluidos en parafina utilizados en este estudio se obtuvieron como se describe en nuestro informe anterior [20]. Los tejidos cancerosos para la implantación en los ratones se obtuvieron de pacientes con cáncer cervical. escrito el consentimiento informado se obtuvo de cada paciente. La aprobación de
in vivo
experimento con animales fue concedida por el Comité para el Uso y Cuidado de Animales de la Universidad Médica de Anhui.
Pacientes y muestras
parafina fijados con formalina muestras incluidas derivados de lesiones cervicales en 65 pacientes con diagnóstico de carcinoma de células escamosas del cuello uterino fueron extraídos de los archivos del Departamento de Patología del hospital Provincial de Anhui afiliado a la Universidad médica de Anhui durante el período de 2002 a 2008. los estadios clínicos se determinaron mediante dos certificados ginecólogos de acuerdo con la Federación Internacional de ginecología modificado Obstetricia (FIGO) para el cáncer de cuello uterino publicado en 2000. los tumores fueron clasificados como bien - moderadamente o pobremente diferenciados - por lo menos por dos patólogos de acuerdo con los criterios propuestos por la Organización Mundial de la Salud. Toda la información clínico-patológico se muestra en la Tabla 1. Todos los pacientes fueron tratados con histerectomía radical. Ninguno de los pacientes había recibido ninguna terapia específica del tumor antes de la escisión quirúrgica.
Cultivo celular y tratamiento
líneas celulares de cáncer cervical humano HeLa, SiHa, CaSki y C33A se compraron de la American Type Culture Collection (ATCC) y se cultivaron en DMEM (Gibco, EE.UU.) con suero bovino fetal 10% (Gibco). VPA (Sigma-Aldrich, EE.UU.) se disolvió en PBS y se utilizó a una concentración final de 3 mmol /L. SAHA y ATRA se adquirieron de Sigma-Aldrich, disuelto en DMSO, y se utilizan a concentraciones finales de 10 mmol /L y 1 mol /L, respectivamente. Las células se trataron con VPA o SAHA solo o en combinación con ATRA durante 48 h. Las células de control se trataron con el vehículo solo.
La tinción inmunohistoquímica e inmunorreactividad evaluación
Los bloques de parafina de los tumores se cortaron en 5
μ m
rodajas y luego procesados usando el estándar deparaffinisation y rehidratación técnicas. peroxidasas endógenas se bloquearon utilizando 3% de peróxido de hidrógeno. Para la recuperación de antígenos, los portaobjetos se procesan mediante el calentamiento por microondas en citrato de sodio 0,01 M (pH 6,0). Los portaobjetos se pre-incubaron en suero de cabra al 5% en TBS (pH 7,6) antes de añadir anticuerpos primarios. Se utilizaron las siguientes diluciones de anticuerpos primarios: 1:100 de la histona H3 acetilada (Santa Cruz, EE.UU.), 1:100 para RARβ2 (Santa Cruz), 1:50 para E-cadherina (Abcam, UK), 1:100 para β -catenina (Abcam), 1:100 para involucrina (Santa Cruz), 1:500 para loricrina (Abcam) y 1:200 para Ki67 (Boster, china). La unión de los anticuerpos primarios se visualizó usando el kit de detección ChemMate (Boster). Las diapositivas fueron ligeramente counterstained con hematoxilina de Mayer durante 30 segundos
Se valoró semicuantitativamente sobre la base de la intensidad de la tinción y distribución mediante la puntuación inmunorreactividad de la siguiente manera:. Puntuación de intensidad × puntuación proporción [16], [21]. La puntuación de la intensidad se define como 0, negativo; 1, débil; 2, moderado; o 3, fuerte, y la puntuación de porcentaje se definió como 0, negativo; 1, & lt; 10%; 2, 11-50%; 3, 51-80%; o 4, & gt; 80% de células positivas. La puntuación total varió de 0 a 12. La marcación fue dividido en tres niveles sobre la base de la puntuación final: inmunoreactividad negativo se definió como una puntuación total de 0; inmunorreactividad baja se definió como una puntuación total de 1 a 4; y de alta inmunoreactividad se define como una puntuación total superior a 4. Los tejidos tumorales teñidas fueron anotados por dos investigadores que fueron cegados a los datos clínicos.
El aislamiento de ARN y PCR en tiempo real cuantificación
Un microgramo de ARN total, que se extrae de los tejidos, se convirtió a cDNA utilizando Superíndice III de la transcriptasa inversa (Takara, Japón). PCR (QRT-PCR) cuantitativa en tiempo real se realizaron con 50 ng de ADNc, cebadores específicos (Tabla 2), el SYBR
Premezcla Ex Taq
™ Kit (Takara), y un real Opticon® 2 PCR en tiempo instrumento (MJ Research, EE.UU.). los niveles de expresión génica se determinaron utilizando el método de la curva estándar y se expresaron en relación con la expresión de GAPDH.
Los anticuerpos y inmunotransferencia
La histona H3 acetilada (AcH3, 1:500), RARβ2 (1 :500), y involucrina (1:500) anticuerpos se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology. El Stat3 (1:1000), p-Stat3 (1:2000), P21 (1:1000), y GAPDH (1:2000) anticuerpos se obtuvieron de Cell Signaling Technology. El E-cadherina (1:500), β-catenina (1:5000), y loricrina (1:2000) anticuerpos fueron adquiridos de Abcam. La P53 (1:500), caspasa-3 (1:1000) y Bcl-2 (1:200) anticuerpos se obtuvieron de Boster Technology. La proteína se prepara a partir de los tejidos de acuerdo con el kit (# 89900, Thermo, EE.UU.) Manual excepto por la adición de una etapa de extracción de ácido de histonas [19]. Después de la electroforesis, las proteínas se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF) y se sondearon con los anticuerpos primarios indicados. La incubación con anticuerpos secundarios específicos de especie (Señalización Celular) se realizó a temperatura ambiente durante 1 hora. Las transferencias se desarrollaron con sustrato quimioluminiscente (Thermo), y la autorradiografía se realizó con película X-OMAT (Kodak, Rochester, NY).
cromatina ensayo de inmunoprecipitación
inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) se realizó utilizando el kit EZ-chip de ensayo (Millipore, EE.UU.) con un anticuerpo chip-grado para la histona H3 acetilada (H3K9ac, Abcam). Brevemente, las células de cáncer cervical se cultivaron en placas de 150 mm de cultivo. Las células se trataron a continuación, ya sea con VPA (3 mmol /L) o SAHA (10 mmol /L) solo o en combinación con ATRA (1 mol /L) durante 48 h. Las células fueron luego reticulado con 1% de formaldehído durante 10 min a temperatura ambiente, y la reacción se inactivó con 0,125 M de glicina. Se rasparon las células, se resuspendieron en tampón de lisis (1% de SDS, EDTA 10 mM, y mM Tris-HCl 50, pH 8,1) suplementado con un cóctel inhibidor de la proteasa en hielo, y se sonicó para obtener fragmentos de ADN de 200 a 1000 pb de longitud , como se confirmó por electroforesis en geles de agarosa al 1%. El ADN cortado se centrifugó a 12000 x
g
a 4 ° C durante 10 min, y el sobrenadante se recogió. El diez por ciento del sobrenadante se reservó para su uso como ADN de entrada y se procesa para su utilización como un control positivo. cromatina Soluble se inmunoprecipitó durante la noche con un anticuerpo anti-H3K9ac. El complejo de la cromatina inmunoprecipitada se cosechó utilizando perlas de G-agarosa de proteína, y de la reticulación se invirtió mediante la adición de NaCl a una concentración final de 200 mM a 65 ° C durante 5 h. El ADN se purificó usando columnas de centrifugación los proporcionados con el kit. Las muestras de ADN, así como el material de entrada y de las muestras de inmunoprecipitación simuladas, se utilizaron como plantillas para tiempo real semi-cuantitativa y PCR para determinar el enriquecimiento relativo del promotor RARβ2-RARE. Los cebadores para el promotor RARβ2-RARA se muestran en la Tabla 2.
Implantación de xenoinjertos de tumores humanos en ratones originales y la terapia con medicamentos
Cuatro semanas de edad BALB /c se obtuvieron ratones desnudos desde el Centro de animales de Laboratorio de la Academia de Ciencias de china (Shanghai, china) y se mantuvieron en una instalación para animales libres de patógenos durante 1 semana antes de su uso. Un espécimen de cáncer cervical de carcinoma de células escamosas pobremente diferenciado, lo cual fue confirmado por histología, se obtuvo con el consentimiento informado del paciente sometido a una cirugía dentro de 1 hora después de la histerectomía. La muestra se lavó con solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4) que contenía 10.000 U /ml de penicilina y estreptomicina y luego seccionado en pequeñas piezas de aproximadamente 2-4 mm
3 para la implantación. Estos pequeños bloques de tejido se implantaron en el tejido subcutáneo de tres ratones desnudos en el dorso usando un trocar
.
Después de 6-8 semanas, una parte de los nódulos tumorales que se desarrolló se escindió en condiciones estériles. Esta pieza ha sido subdividido en pequeños fragmentos de inmediato y se inyecta en otros ratones desnudos. Una vez que se establecieron tumores palpables, 20 ratones fueron colocados al azar en cuatro grupos: control, VPA, ATRA, y de la combinación. VPA se diluyó en cloruro de sodio 0,9%, mientras que ATRA se disolvió en aceite de sésamo purificado. Los ratones se les administró VPA (300 mg /kg /d) y /o ATRA (15 mg /kg /d) diariamente a través de inyección intraperitoneal (i.p.) y aguja de sonda intragástrica (i.g.), respectivamente. El grupo de control recibió el vehículo solo siguiendo el mismo horario. El volumen del tumor se midió con un calibre dos veces por semana y se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula: (longitud x anchura
2) /2. Los animales fueron tratados durante 4 semanas y luego se sacrificaron. Los tumores se cosecharon y se fijaron con paraformaldehído al 4% para la evaluación patológica o se congelan en nitrógeno líquido para la PCR, chip, y el análisis de inmunotransferencia al igual que los tumores de masas se registraron. la inhibición del crecimiento del tumor (TGI) se calculó restando del 100% de la masa tratada tumoral media /media la masa del tumor de control x 100%.
TUNEL ensayo
Tras la recepción de cada muestra de tumor, una pequeña porción del tumor se fijó en paraformaldehído al 4% y se incrustó en parafina. Después de la desparafinación, las secciones se lavaron y se permeabilizaron durante 5 min en hielo con 0,1% Triton X-100 y después se incubaron con proteinasa K (Sigma-Aldrich) durante 10 min a temperatura ambiente. tinción TUNEL se realizó utilizando un
in situ
kit apoptosis de detección (Keygene Tecnología, China), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secciones se cubrieron con TUNEL mezcla de reacción de etiquetado (tampón de equilibrado, biotina-11-dUTP, enzima TdT) y se incubaron a 37 ° C durante 1 h en una cámara de humedad. Las secciones se marcaron adicionalmente con estreptavidina-FITC en la oscuridad durante 30 min. Después de la contratinción con DAPI (2 mg /ml), células TUNEL positivas fueron contados a partir de imágenes de fluorescencia tomadas de 10 campos al azar a 200 × magnificación.
El análisis estadístico
Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el paquete de software SPSS (versión 13; SPSS Inc., EE.UU.). La correlación entre los parámetros clínico y los datos de inmunohistoquímica se evaluó mediante la prueba de chi-cuadrado o la prueba exacta de Fisher. La asociación entre la expresión de AcH3, RARβ2, E-cadherina y β-catenina se analizó mediante la prueba de chi-cuadrado para la tendencia lineal. La concordancia entre observadores en la puntuación inmunoreactividad entre dos investigadores fueron evaluados por kappa-estadísticas. De acuerdo con Fleskens [22], los valores kappa-& lt; 0.20 indicar un mal acuerdo; ,21-0,40 Acuerdo justo; Moderado acuerdo 0.41-0.60; 0,61-,80 buen acuerdo; y 0,81-1,00 excelente acuerdo. ANOVA se utilizó para analizar la significación estadística para el enriquecimiento relativo de promotor RARβ2 en chip de ensayo y los
in vivo y modelos de xenoinjertos. Un
P-valor de
. & Lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
características clinicopatológicas
Un total de 65 casos de células escamosas del cuello uterino primaria se analizaron carcinoma. Sus características clínico-patológicas, incluyendo la diferenciación del tumor, puesta en escena de la información y las metástasis ganglionares, fueron revisados y se resumen en la Tabla 1.
Asociación de las variables clinicopatológicas con los niveles de expresión de AcH3, RARβ2, E-cadherina, y β- catenina
los resultados representativos de nuestro análisis inmunohistoquímica para AcH3, RARβ2, e-cadherina, y β-catenina se muestran en la Figura 1. en el epitelio cervical normal, los cuatro parámetros se tiñeron positivamente en las células de la suprabasal a la capa basal, con distinta expresión de AcH3 en los núcleos, RARβ2 en el citoplasma y núcleos, y e-cadherina y β-catenina principalmente en la membrana (Figura 1). En el tejido canceroso, la intensidad de la inmunorreactividad de estos cuatro parámetros era fuerte en tumores bien diferenciados y reduce en carcinoma moderadamente diferenciado, con etiquetado débil o negativa en carcinomas pobremente diferenciados (Figura 1A).
(A) La paneles de la izquierda muestran las secciones de tejido cervical normal. AcH3 tinción fue fuerte en las células del tumor en carcinomas bien diferenciados. AcH3 expresión fue reducido o ausente en los carcinomas diferenciados moderadamente y mal, respectivamente. Se observaron patrones similares de expresión para la tinción de RARβ2, E-cadherina y β-catenina. (B) No hubo diferencias significativas en las puntuaciones de la inmunorreactividad para AcH3, RARβ2, E-cadherina y β-catenina entre bien, moderadamente, y carcinomas de células escamosas pobremente diferenciados.
La tinción inmunohistoquímica fue marcado por dos investigadores. La Tabla 3 muestra la concordancia entre los dos investigadores de los tres niveles de inmunoreactividad para AcH3, RARβ2, E-cadherina y β-catenina. Una comparación de los resultados con las estadísticas kappa-mostró una concordancia excelente para RARβ2 y E-cadherina puntuación (κ = 0,840, 0,876) y un buen acuerdo para AcH3 y puntuación β-catenina (κ = 0,710, 0,657). La κ-valor total fue 0,778 (concordancia), lo que indica la concordancia entre las puntuaciones de inmunorreactividad proporcionadas por los dos investigadores.
Las relaciones entre las características clínico-patológicos y la inmunorreactividad calificaciones de AcH3, RARβ2, E- cadherina y β-catenina se muestran en la Tabla 1. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas con respecto a la edad o etapa clínica entre estos cuatro parámetros. Sin embargo, la expresión de estos cuatro parámetros mostró una correlación significativa con la diferenciación histológica (
P
& lt; 0,01) y con metástasis nodal (
P
& lt; 0,01) (Tabla 1). La distribución de las células tumorales teñidas positivamente representa frente a sus puntuaciones inmunoreactividad en las muestras de los pacientes se muestran en la Figura 1B. AcH3, RARβ2, E-cadherina, y la expresión de β-catenina correlacionó positivamente con diferenciación histológica (r = 0,737, 0,531, 0,574, y 0,549, respectivamente,
P
& lt; 0,01) (Tabla 1). Para H3 acetilación, el 94,4% (17/18) de los casos bien diferenciados mostraron altos niveles de expresión, mientras que el 37% (10/27) de los casos moderadamente diferenciados mostraron altos niveles de expresión. Fuerte expresión no se observó en los casos pobremente diferenciados (0/20). La proporción de tumores con alta inmunoreactividad para la E-cadherina y la expresión de β-catenina fue más del 72% en pacientes con tumores bien diferenciados. Sin embargo, para la expresión RARβ2, sólo el 39% (7/18) de los pacientes tenían una puntuación total & gt; 4, mientras que el 61% (11/18) de los pacientes mostró inmunorreactividad baja. De manera similar, no había una correlación estadísticamente significativa entre H3 acetilación y la expresión de RARβ2, E-cadherina, y β-catenina (r = 0,560, r = 0,731, y r = 0,733, respectivamente,
P
& lt; 0,01) (Figura 1B).
inhibidores de HDAC en combinación con ATRA restaurar la expresión RARβ2 través RARβ2-RARA
Como se muestra en la Figura 2A, el inhibidor de HDAC SAHA (consistente con nuestro trabajo anterior sobre VPA [19]) solo o en combinación con ATRA hyperacetylation fuertemente inducida de la histona H3 y restaurado expresión RARβ2 en líneas celulares de cáncer de cuello uterino. Para comprender mejor el mecanismo de acetilación de histonas inducida por re-expresión de RARβ2, se realizó un ensayo ChIP utilizando un anticuerpo anti-H3K9ac para determinar la unión de la histona H3 acetilada a la región RARβ2 promotor (-168 /+ 22), que incluye la región central de la RARO (-55 /-35) y la caja TATA (Figura 2B). El hyperacetylation de la lisina 9 de la histona H3 (H3K9ac) se asocia generalmente con los genes transcritos activamente [23]. En comparación con el grupo de control, las células SiHa tratados con inhibidores de HDAC (10 mmol /L SAHA o 3 mmol /L VPA) solo durante 48 h mostró un aumento significativo en el enriquecimiento de RARβ2-RARE basado en semi-cuantitativa (Figura 2C) y PCR en tiempo real (Figura 2D). El efecto fue el más grande cuando las células se trataron con ambos inhibidores de la HDAC y ATRA (1 mol /L). Este tratamiento combinado fue más eficaz en la inducción de acetilación de histonas en la región RARβ2-RARA que cualquier droga sola. Estos resultados indican que el RARA en el promotor RARβ2 es funcional y que la acetilación de histonas en la región RARβ2-RARA está estrechamente relacionada con RARβ2 re-expresión en células de cáncer cervical.
(A) SAHA (10 mmol /L ) de tratamiento durante 48 h, ya sea solos o en combinación con ATRA (1 mol /L), indujo fuertemente la hiperacetilación de la histona H3 y restauró la expresión RARβ2 en HeLa, SiHa, CaSki, y las células C33A. (B) Representación esquemática de la región RARβ2-promotor. Los exones de RARβ2 están representados por cajas negras. La flecha indica el sitio de la transcripción-iniciación. La región de PCR (-168 a 22) para el chip de ensayo incluía la región central del RARO, la caja TATA, y 22 pb del exón 1. (C) datos de chip-PCR representativos. Los productos de PCR se visualizaron a través de un gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio. muestras (D) de ADN de la anti-H3K9ac IP, así como el material de entrada y las muestras de inmunoprecipitación simuladas fueron cuantificados por PCR en tiempo real. El tratamiento con 10 mmol /L SAHA o 3 mmol /L VPA condujo a un aumento significativo en el enriquecimiento RARβ2-RARE. El mayor incremento en el enriquecimiento RARβ2-RARA se observó con el tratamiento combinado. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P
. & Lt; 0,01
Tratamiento combinado de VPA y ATRA inhibe la progresión de xenoinjertos tumorales derivadas de donantes humanos
Cuatro semanas después de la implantación inicial del carcinoma cervical derivado de un donante humano, el tumor se hizo reconocible en el sitio del trasplante y continuó creciendo lentamente. Una tasa de crecimiento rápida se observó en la segunda generación; sólo se tarda 2 semanas para que se forme un xenotrasplante notable. El examen histológico reveló características que eran muy similares a los de carcinoma cervical del paciente original (Figura 3D)
Después de que los tumores eran palpables, los ratones se dividieron al azar en cuatro grupos:. control (vehículo), VPA (300 mg /kg VPA), ATRA (ATRA 15 mg /kg), y la combinación. Los diversos tratamientos se administraron diariamente durante 28 días. volúmenes de los tumores y los pesos de ratón se calculan cada dos días. La combinación de VPA y ATRA notablemente inhibió el crecimiento de xenoinjertos de tumores en comparación con ya sea solo fármaco o el tratamiento del vehículo (
P
& lt; 0,05) (A). Al día 28, se sacrificaron los ratones, y se cosecharon xenoinjertos de tumor (B). datos de la masa del tumor fueron consistentes con los volúmenes tumorales. Se observó una mayor regresión en el crecimiento tumoral para el tratamiento combinado que para las administraciones de un solo fármaco (
P
& lt; 0,05) (C). VPA y el tratamiento de combinación mejora notablemente el grado de diferenciación histológica. las células cancerosas individuales tenían abundante citoplasma eosinófilo queratinizado (puntas de flecha), y figuras de mitosis estaban ausentes. Los xenoinjertos de tumores tratados con vehículo o ATRA permanecieron pobremente diferenciado, similar a los tumores humanos originales. Las figuras mitóticas (flechas) son comunes en estas muestras y el citoplasma es eosinófilo a anfófilo, con queratinización mínima o ausente (D). *
P
. & Lt; 0,05, en comparación con el grupo tratado con un solo fármaco
Para determinar el efecto de VPA y ATRA en el crecimiento de xenoinjerto de tumor, los animales recibieron vehículo como control, VPA (300 mg /kg /d ip), ATRA (/kg /d ig 15 mg), o la combinación de tratamiento durante 28 días como se establecieron los tumores. El tratamiento no tiene toxicidad manifiesta en los ratones. Después de 28 días, el volumen medio del tumor para el grupo de tratamiento de combinación fue 66.84 ± 19.10 mm
3, mientras que los volúmenes de los tumores de los ratones tratados con vehículo, VPA, y ATRA eran 316.65 ± 94.58 mm
3, 119,83 ± 7,74 mm
3, y 208.64 ± 76.61 mm
3, respectivamente (Figura 3A y B). Consistente con los datos de volumen de tumor, el peso medio del tumor del grupo de control fue de 0,99 ± 0,09 g, mientras que los pesos de los tumores para el VPA, ATRA, y los grupos de tratamiento combinación fueron 0,402 ± 0,02 g, 0,618 ± 0,16 g, y 0,264 ± 0,09 g, respectivamente (Figura 3C). Estos datos indican que los xenoinjertos fueron suprimidos por 59,39%, 37,58% y 73,33% (porcentaje de inhibición del crecimiento del tumor,% TGI) para el VPA, ATRA, y tratamientos, respectivamente (Figura 3A) combinados. Los datos muestran que el tratamiento de combinación resultó en una mayor inhibición del crecimiento de xenoinjertos tumorales que cualquiera de los tratamientos con un solo fármaco.
Es importante destacar que, el aspecto histológico mostró que VPA y el tratamiento de combinación mejora el grado de diferenciación histológica en los xenoinjertos tumorales . Como se muestra en la figura 3D, las células cancerosas de xenoinjertos tratados con VPA solo o en combinación con ATRA tienen abundante citoplasma eosinófilo queratinizado, mientras que las cifras mitóticas están ausentes o observaron sólo ocasionalmente. Sin embargo, las células cancerosas en los tejidos, tanto de los grupos control y tratados con ATRA fueron pobremente diferenciado. Las figuras mitóticas eran (2-4 por campo de alta potencia en el grupo control, pero ≤2 por campo de alta potencia en el grupo tratado con ATRA) común, y el citoplasma fue eosinófila a anfofılicos, mientras que la queratinización fue mínima o ausente, similar a el carcinoma originales. Estas observaciones se verificaron adicionalmente por tinción inmunohistoquímica para involucrina y loricrina (marcadores de diferenciación terminal de epitelio) en los tejidos de xenoinjertos de tumores (Figura 4). La expresión de la involucrina y loricrina se indujo de manera significativa en los tumores de ratones tratados con VPA solo, en comparación con los tumores de los ratones de control y ratones tratados con ATRA. Los mayores niveles de involucrina y de expresión loricrina fueron encontrados en los tumores de los ratones tratados con la combinación de fármacos. La proliferación celular se evaluó mediante tinción con Ki67. El tratamiento con VPA en combinación con ATRA condujo a una disminución significativa en las células Ki67 positivas en comparación con VPA, ATRA, o el tratamiento con vehículo (13,0%
vs
39.4, 71.2, y 78.6, respectivamente;.
P
& lt; 0,05) (Figura 5B). Además de inducir la diferenciación, VPA también promueve la apoptosis [24]. Para explorar este efecto, se realizó la tinción de TUNEL para evaluar la apoptosis en xenoinjertos de tumores (Figura 5A). En los tumores de los ratones de control, el número de células apoptóticas fue mínima (3,6 ± 1,14). El número de células apoptóticas en los tumores de ratones tratados con ATRA no fue significativamente diferente de los de los ratones tratados con VPA solo o el vehículo. Hubo un aumento significativo en células apoptóticas (20,60 ± 4,16) en los tumores tratados con la combinación.
El tratamiento con VPA aumentó solo de manera significativa el nivel de acetilación de histonas H3, restauró la expresión RARβ2, y se indujo la expresión de la terminal de marcadores de diferenciación involucrina y loricrina, mientras que el tratamiento con la combinación de VPA y ATRA condujo a un mayor efecto en la reactivación de estos genes de expresión en comparación con cualquiera de los tratamientos solo medicamento. Se observaron células positivas poco en los tejidos de los del grupo tratado con ATRA. Se evaluó
(A) la apoptosis de la célula usando el ensayo de TUNEL. Las células apoptóticas (verde) se cuentan a partir de imágenes de fluorescencia tomadas de 10 campos al azar a 200 × magnificación. El tratamiento con la combinación de VPA y ATRA aumentado de manera significativa la apoptosis en comparación con el vehículo o el tratamiento de un solo fármaco. proliferación (B) de las células se evaluó mediante la tinción de Ki67. La distribución de las células Ki67 positivas fue marcado por dos investigadores. Una disminución significativa en el número de células Ki67 positivas se observó en los tumores tratados con la combinación de fármacos en comparación con el tratamiento de VPA solo. No sólo era disminuir ligeramente en el número de células Ki67 positivas en el grupo tratado ATRA en comparación con el grupo control. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01, en comparación con el grupo control
VPA y ATRA restaurar la expresión RARβ2 a través de la modificación epigenética y de forma secuencial. inhibir el crecimiento tumoral mediante la reactivación de la expresión ETG
El estado de acetilación de la histona H3 de los xenoinjertos de tumor se determinó mediante inmunohistoquímica y análisis de transferencia Western. Como se muestra en las figuras 4 y 6, el tratamiento VPA aumentó significativamente el nivel de H3 acetilada en comparación con el control y el grupo ATRA. Cuando se combina con ATRA, VPA mostró un efecto aditivo evidente en la modificación epigenética de la histona. Para investigar el efecto de estos reactivos en el nivel de acetilación de histonas en la región RARβ2-promotor, se realizó un ensayo ChIP.