Extracto
cáncer de ovario
epitelial es una enfermedad muy heterogénea y sigue siendo la neoplasia ginecológica más letal en el mundo occidental. Los enfoques terapéuticos deben tener en cuenta entre pacientes y la heterogeneidad intra-tumoral y caracterización detallada de
in vitro y modelos que representan a los diferentes subtipos de cáncer de ovario histológicos y moleculares es fundamental para permitir que los ensayos preclínicos fiable. Hay aproximadamente 100 líneas celulares de cáncer de ovario a disposición del público, pero sus características celulares y moleculares son en gran parte no descrita. Se han caracterizado 39 líneas celulares de cáncer de ovario, en condiciones uniformes para las características de crecimiento, ARNm /expresión de microARN, la secuenciación del exón, la respuesta al fármaco para la terapéutica clínicamente relevantes y estudiado toda la información disponible sobre las características clínicas originales y sitio de origen. Se probó la asociación estadística entre las características celulares y moleculares de las líneas y las características clínicas. De las 39 líneas celulares de cáncer de ovario, 14 fueron asignados como de alto grado seroso, cuatro de tipo seroso, un bajo grado seroso y 20 de tipo no seroso. Tres subtipos morfológicos: epitelial (n = 21), Ronda (n = 7) y el husillo (n = 12) fueron identificados que mostraron características biológicas y moleculares distintas, incluyendo la sobreexpresión de movimiento de las células y genes de migración asociada en el subtipo del husillo. Comparación con los datos clínicos originales mostró asociación de los tumores de husillo como con metástasis, etapa avanzada, la citorreducción subóptima y mal pronóstico. Además, los perfiles de expresión de husillo, Ronda y morfologías epiteliales agrupados con el C1-estromal se ha descrito previamente, C5-mesenquimal y C4 subtipo de ovario perfiles de expresión, respectivamente. perfilado completa de 39 líneas celulares de cáncer de ovario, bajo condiciones uniformes controlados demostró características celulares y clínicamente relevantes genómica. Estos datos proporcionan una base racional para la selección de modelos para desarrollar enfoques de tratamiento específicos para los subtipos histológicos y moleculares de cáncer de ovario
Visto:. Beaufort CM, Helmijr JCA, Piskorz AM, Hoogstraat M, Ruigrok-Ritstier K, N Besselink , et al. (2014) de ovario línea celular de cáncer de paneles (OCCP): La importancia clínica de
In Vitro
morfológicas subtipos. PLoS ONE 9 (9): e103988. doi: 10.1371 /journal.pone.0103988
Editor: Richard Pearson, Peter MacCallum Cancer Centre, Australia |
Recibido: 15 Noviembre 2013; Aceptado: July 5, 2014; Publicado: 17 Septiembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Beaufort et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyado en parte por el Centro para el tratamiento personalizado del cáncer (una colaboración entre la UMC Utrecht, Erasmus MC de Rotterdam y los Países Bajos Instituto del cáncer de Amsterdam), la KWF-Alpe (UU 2011 a 4977) y la Organización Europea para la Investigación y Tratamiento del cáncer (subvención nr. EORTC STRF 2008-03, JH). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer de ovario
epitelial es la neoplasia ginecológica más letal en el mundo occidental y la enfermedad avanzada sigue siendo incurable para la mayoría de los pacientes. A pesar de las pruebas de las diversas estrategias de tratamiento y nuevos agentes citotóxicos, terapia primaria óptima y las tasas de supervivencia no han cambiado sustancialmente desde la introducción del tratamiento platino y taxano [1] -. [3] |
ideas recientes han indicado que el cáncer de ovario es un término colectivo para los cánceres invasivos de la pelvis que se derivan de diferentes tejidos con características histológicas y epidemiológicas distintas. Las cinco principales histiotypes han demostrado tener unos perfiles genéticos específicos y deben ser tratados como enfermedades distintas. serosa (HGS) El carcinoma de alto grado representa el 80% de los cánceres de ovario y se define por
TP53
mutación (96%), defectos de reparación del ADN recombinación homóloga (~ 50%),
CCNE1
amplificación y la inestabilidad genómica [4] - [6]. Por el contrario, los carcinomas serosos de bajo grado son
TP53
de tipo salvaje y con frecuencia muestran mutaciones activadoras de la vía Ras [7], [8]. Los restantes son histiotypes mucinoso, endometrioide y de células claras [3]. Las mutaciones activantes vía de Ras se encuentran en ~ 40% de los tumores mucinosos mientras que los tumores de células claras endometrioide y tienen
PIK3CA gratis (componentes PI3Kinase, 12%, 31%, respectivamente), y
ARID1A
mutaciones ( 30%, 46%, respectivamente) [4], [5], [9], [10].
por otra parte, los grandes estudios han identificado varios subtipos moleculares de HGS basados en genes y microARN expresión [4] , [11]. Estos subtipos sugieren asociaciones con procesos biológicos específicos (como estroma reactivo, mesenquimales, inmunorreactivas y la proliferación) y de mal pronóstico, por ejemplo, en el estroma-subtipo C1 identificado por Tothill et al. [4], [11]. explorar más a fondo las características clínicas de estos subtipos biológicos diferentes y la identificación de un tratamiento óptimo podría identificar nuevas estrategias terapéuticas.
Es imperativo que los modelos experimentales in vitro manejables, tales como líneas celulares, representan con precisión los diferentes subtipos histológicos y moleculares con el fin de probar nuevas estrategias de tratamiento subtipo específico. A nivel mundial, hay cerca de 100 líneas celulares de cáncer de ovario generados como se describe en la literatura [12] - [17] y alrededor de 70 de estos están disponibles en la ATCC, ECACC, RIKEN, DSMZ, JCRB o Tecnología de Investigación del Cáncer. Desde 1990, un promedio de aproximadamente 100 trabajos /año se publicó que se basan en líneas celulares de cáncer de ovario como un modelo. Una limitación importante de estos estudios es el hecho de que para la mayoría de líneas de células de ovario de su origen no está bien definido y debido a la inadecuada caracterización no se sabe que se representa histológico distinto o subtipo molecular.
Se describen una amplia y caracterización uniforme de una colección de 39 líneas celulares de cáncer de ovario comúnmente utilizados para
in vitro
estudios. Se identificaron histológico, así como subtipos morfológicos que se asocian con características patológicas clínicas de carcinomas de ovario, así como el pronóstico. Por otra parte, los subtipos morfológicos asocian con los subtipos moleculares identificados por Tothill et al. [11]. En resumen, estos resultados pueden servir como una guía para seleccionar las líneas celulares apropiadas que representan diferentes subtipo histológico y molecular del cáncer ovárico de
in vitro
estudios terapéuticos.
Materiales y Métodos
líneas celulares y cultivo de
Las líneas celulares estudiadas fueron Caov3, CAOV4, ES-2, OV-90, OVCAR3, TOV-112D, TOV-21G, UWB1.289, UWB1.289 + BRCA1 (adquirido de ATCC ), 59M, A2780, A2780CIS, A2780ADR, 'COLO720E', COV318, COV362, COV362.4, COV413A, COV413B, COV504, COV644, OAW28, OAW42, OV56, OV7, OV17R, pEA1, PEA2, PEO1, PEO4, PEO14, PEO16, PEO23, SKOV3 (adquirido de la colección europea de cultivos celulares, ECACC a través de Sigma), 2774, A2780, HOC7, SKOV3, SKOV6 (cortesía de Gunter Daxenbichler, Departamento de Obstetricia y Ginecología de la Universidad de Innsbruck, Austria), IGROV1 (cortesía del Dr. Irene Hamelers, Instituto de biomembranas, Universidad de Utrecht, Países Bajos). Tabla S1 resume la fuente original de las líneas celulares. Las líneas de células A2780 y SKOV3 fueron ambos obtenidos de un laboratorio académico y también adquirieron de ECACC, y se describen aquí como "A2780 ECACC 'y' SKOV3 ECACC '. Treinta y nueve de las 40 líneas celulares se cultivaron como monocapas, a excepción de la línea celular semi-adherente 'COLO720E' para la que se pasaron flotante y las células unidas. Se adjuntan las células fueron totalmente desagregados por tripsinización entre los pasajes. Las líneas celulares se mantuvieron a 37 ° C en una incubadora con aire humidificado con 5% de CO2.
Todas las líneas celulares se cultivaron inicialmente usando el medio y los suplementos como se recomienda por los proveedores. En contraste con otros estudios, se cultivaron todas las líneas celulares en las mismas condiciones de cultivo para evitar sesgos debido a concentraciones variables de los suplementos dentro de diferentes medios de comunicación (por ejemplo, factores de crecimiento) o de diferentes porcentajes de suero. Todas las líneas celulares se cultivaron en RPMI-1640 glutamax, Gibco /Invitrogen suplementado con 10% de FCS (Lonza, fuente: brasileño, Lot nr 1SB002), 100 U /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina, 50 mg /ml de gentamicina. Todos los experimentos y aislamientos de ácidos nucleicos se realizaron después de cultivar las líneas celulares durante al menos un mes usando estas condiciones estándar.
UWB1.289 es una línea celular BRCA1 nulo de mujer con una línea germinal
BRCA1
2594delC mutación. UWB1.289 + BRCA1 es estable transfectadas con un plásmido pcDNA3 que contiene un
BRCA1
Insert y se mantuvo con 200 mg /ml de geneticina (G418) para mantener la selección de las células transfectadas. A2780ADR y A2780CIS se desafiaron una vez al mes con 100 nM de doxorubicina y cisplatino 1 mM, respectivamente.
short tandem repeat análisis
Se utilizó el sistema PowerPlex 16 (Promega) de acuerdo con el protocolo del fabricante utilizando una ABI PRISM 3100 para generar un STR (Short repetición en tándem) de huellas dactilares de cada línea celular para determinar la identidad única y /o la falta de contaminación de co-cultivo. Además, el perfil de STR se comprobó antes y durante el cultivo de las células para asegurar que la contaminación cruzada o sustitución errónea no se produjo.
Curvas de crecimiento y sensibilidad a los fármacos de ensayo
El ensayo colorimétrico MTT , que mide la actividad metabólica de las células viables, se utilizó para generar curvas de crecimiento y determinar la quimiosensibilidad de las líneas celulares.
en primer lugar, las curvas de crecimiento se generaron por duplicado para determinar el número óptimo de las células a utilizar para el medicamento la sensibilidad del ensayo. Esto se hizo para evitar la inhibición del crecimiento debido a la siembra no suficientes células o agotamiento del medio después de la siembra demasiadas células. El mayor número de células que muestran el continuo crecimiento exponencial después de cinco días fue seleccionado para los ensayos de MTT respuesta a los fármacos (Tabla S1, S1) del archivo.
Curvas de respuesta se generaron para carboplatino, cisplatino, oxaliplatino, doxorubicina y 5-fluorouracilo (soluciones intravenosas, Pharmachemie, Países Bajos), paclitaxel (solución intravenosa, Ebewe Pharma, Austria), Docetaxel (disuelto en DMSO, Sigma), y Gemcitabina (para uso intravenoso, disuelto en PBS, Sun Pharmaceutical Industries Europe BV, Países Bajos) . La viabilidad celular se evaluó por cuadruplicado utilizando el ensayo MTT después de una exposición 5 días a 18 concentraciones del compuesto. software de Phoenix WinNonLin 1.1 (Pharsight) se utiliza para ajustar una curva dosis-respuesta y para calcular los valores de inhibición del crecimiento del 50% (GI50) con intervalos de confianza del error y del 95% (véase también el archivo S1).
ADN y el total aislamiento de ARN
el kit NucleoSpin (Machery-Nagel) se utilizó de acuerdo con el protocolo del fabricante para aislar el ADN de células recogidas con tripsina y se lavaron con PBS.
para el aislamiento de ARN total (incluyendo microRNAs), células de crecimiento exponencial se lisaron directamente en frascos de cultivo con ARN-Bee para evitar cambios en la expresión debidos a la recolección o de lavado. ARN total fue aislado de lisados como se describe anteriormente [18]. Tres aislados independientes de ARN de cada línea se agruparon para el análisis de la expresión del mRNA y microRNA para disminuir el posible sesgo de los valores atípicos.
microARN y la expresión génica análisis
Para el análisis de la expresión de microARN, TaqMan Arrays microARN humano a Tarjetas v2.0 fluídico (Applied Biosystems) que contiene ensayos de QRT-PCR para cuantificar 381 microRNAs únicos se utilizaron de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los datos de expresión se normalizó utilizando la mediana de todos los microRNAs Ct medidos como se describe por Vandesompele et al. [19] (véase también el archivo S1). Los datos de expresión normalizados para los 384 microRNAs se dan en la Tabla S2. Se midió
La expresión génica utilizando el GeneChip Human exón 1,0 ST Array (Affymetrix) según el protocolo del fabricante (véase también el archivo S1). La expresión de datos adquiridos se pre-procesados utilizando el algoritmo robusto análisis multichip (RMA) en el software de la Consola de expresión Affymetrix que realiza la corrección de fondo, la normalización y la sonda conjunto de resumen por cada transcrito resultante en un valor de expresión por gen. Los datos de expresión génica ha sido depositado en la Expresión Génica Omnibus (GSE53418)
análisis de la mutación de instantáneas
Análisis de instantánea se realizó tal como se describe anteriormente [20] -. [22] utilizando un Applied Biosystems Snapshot Kit Multiplex. Los cambios de nucleótidos y de aminoácidos correspondiente evaluados fueron de PIK3CA, BRAF, HRAS, ANR y KRAS se enumeran en los métodos de suplemento (
Archivo
S1).
La mutación y amplificación de los análisis con la secuenciación del exón SóLIdAS
Procesamiento de las muestras para la secuenciación en la plataforma de secuenciación SOLiD5500 (Life Technologies) se realizó en una manipulación de líquidos robot SciClone NGS (Perkin Elmer), basado en el protocolo para la preparación de biblioteca manual [23]. Sure-Select de enriquecimiento para los genes de interés se realizó de una manera multiplexada de hasta 16 muestras por reacción (basado en Nijman et al. [24]) utilizando un kit de enriquecimiento de diseño personalizado.
Los datos fueron asignadas a la genoma de referencia (GRCh37 /hg19) usando BWA y SNP y llamadas indel se realizó utilizando un análisis de tuberías personalizado. Sobre la base de la base de datos COSMIC [9] y la revisión por Berns et al. [5], se seleccionaron 53 genes que a menudo están mutados o amplificadas en el cáncer de ovario de análisis (ver métodos de suplementos en Archivo S1 de la lista de genes).
Para el análisis de amplificación de genes, robustos puntuaciones Z se calcularon por el exón como se describe por Iglewicz y Hoaglin [25]. Un gen se amplifica con una puntuación Z mayor que 2 y altamente amplificada, si es mayor de 3.
La secuenciación del exón SóLIdAS se ha depositado en el Archivo Europeo de nucleótidos (PRJEB5114).
análisis de la mutación by-amplicón Etiquetado secuenciación profunda (Tam-Sec)
las secuencias codificadoras de TP53, BRCA1, BRCA2, PTEN, PIK3CA, EGFR y APC genes fueron amplificados y secuenciados utilizando el método de Tam-Sec y la matriz de acceso Fluidigm 48.48 (Fluidigm CA, EE.UU.) según el protocolo del fabricante, tal como se describe anteriormente [26]. Se realizó el análisis de secuencias y verificación variante como se describe anteriormente [26], [27]. El primer secuencias están disponibles bajo petición. Los datos de Tam-Sec ha sido depositada en el Archivo de nucleótidos Europea (PRJEB5183).
La inestabilidad de microsatélites
La inestabilidad de microsatélites se determinó mediante el análisis de MSI System Version 1.2 (Promega) de acuerdo con el protocolo del fabricante y como se realiza habitualmente electroforesis utilizando un ABI PRISM 3100. MSI se determina en cinco marcadores de repetición de mononucleótidos (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 y MONO-27).
análisis FACS
se cosecharon y se tiñeron con anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromo adecuadamente tituladas Las células (como se describió anteriormente [28]). En resumen, las células se tiñeron con anticuerpos contra luminal de citoqueratina (CK) conjugado con PE (mezcla de citoqueratina 8, 18 -clone C11 y citoqueratina 19 -clone A53-B /A2-, Veridex LCC, Raritan, NJ), CD24- FITC (clon SN3, eBiosciences, San Diego, CA), CD44-PeCy7 (clon IM7, eBiosciences) y EpCAM-FITC (clon EBA-1, BD Biosciences, San José). CK tinción fue precedida por una etapa de fijación y permeabilización utilizando FIX & amp; reactivos PERM (An Der Grub Bio Research GmbH, Austria). La expresión de proteínas se midió en un citómetro de flujo FACSCanto (BD Biosciences). Se calculó la relación de señal a ruido (s /n) (es decir geométrica intensidad media de fluorescencia (MFI) de la población teñida dividido por el MFI de la población sin teñir) para corregir la fluorescencia de automóviles.
Estadísticas y visualización
los análisis estadísticos se realizaron en las 33 líneas celulares que se generan a partir de materiales de pacientes de cáncer de ovario único. Duplicados (SKOV3 y A2780),
in vitro
derivados (A2780ADR, A2780CIS, COV362.4 y UWB1.289 + BRCA1) y la línea celular posiblemente contaminado "COLO720E 'se quedaron fuera de estos análisis. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando métodos no paramétricos en el paquete estadístico Stata, versión 12.0 (Stata Corporation, College Station, TX). P-valores fueron de dos caras y P & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
herramientas de matriz BRB (v4.3.1) se utilizó para seleccionar los genes expresados diferencialmente y microRNAs entre los tres subtipos morfológicos.. En primer lugar, los microARN con & gt; 80% de los valores que faltan se separaron por filtración. A continuación, los valores perdidos que no fueron marcados debido a la baja calidad fueron reemplazados con el valor mínimo sobre todos los microARN y muestras seguido de la normalización 2log. En BRB, se seleccionaron los 50% microRNAs más variables y los ARNm y el algoritmo de comparación de clase se utilizó para calcular la permutación p-valor después de 10.000 permutaciones. P & lt; 0,05 se consideró significativo. La agrupación jerárquica se hizo en medio de mRNA y microRNA centrado datos de expresión génica utilizando Eisen clúster 3.0. Para los datos que figuran GSE9891 múltiples sondas por gen se promediaron los que más se parece al enfoque adoptado por los arrays de exones (es decir, el resumen conjunto de sondas en el software de la Consola de expresión Affymetrix). A continuación, la línea celular de expresión génica de datos y los datos de GSE9891 (excluyendo las muestras LMP) eran mediana centrado por separado para corregir las diferencias entre las plataformas utilizadas y posteriormente combinados antes de la agrupación jerárquica. La identificación de la función biológica de los genes relacionados con la morfología se realizó con IPA (v16542223 de Ingenuity Systems).
Resultados
Figura 1 se presenta un resumen del plan experimental que incluye el cultivo de todas las líneas celulares con la misma condiciones de cultivo para evitar sesgos debido a las concentraciones variables de los suplementos en diferentes medios de comunicación (por ejemplo, factores de crecimiento) o suero.
STR repetición corta en tándem, MSI inestabilidad de microsatélites, PFS supervivencia libre de progresión
.
Breve repetición en tándem (STR) análisis
El número medido de repeticiones para cada uno de los 16 loci STR, así como los perfiles de STR referencia de los bancos de datos públicos y la literatura se dan en la Tabla S3.
La concordancia entre los picos de los perfiles de referencia y los perfiles generados en este estudio fue del 100% para 22 líneas celulares, 90 a 99% durante diez líneas celulares y 79-89% para cuatro líneas celulares. Durante tres líneas celulares, no hay referencias disponibles (Tabla S3).
Una línea celular, 'COLO720E', mostró sólo el 4% de concordancia con los perfiles STR publicados por Korch et al. [29]. COLO720E se ha descrito para ser mezcla de las líneas de células COLO684 y COLO685 que son ambos derivados de adenocarcinoma uterino [30]. 'COLO720E' tenía dos mutaciones de TP53 descrito (c.1118del1, c.C413T), el apoyo a la posibilidad de que dos poblaciones de células. Sin embargo, estas dos mutaciones TP53 se informó recientemente por Anglesio et al. aunque su línea celular COLO720E no coincide con la referencia STR a disposición del público [31]. Desde 'COLO720E' Recientemente se ha retraído desde el repositorio línea celular ECACC, se excluyó de los análisis de datos adicionales.
Origen
La información de la literatura disponible sobre el origen de las líneas celulares 39 se resume en la Figura 2 (datos adicionales en la Tabla S1) [32] - [53]. Treinta y tres líneas celulares fueron generados a partir de material único del paciente, sin incluir las fuentes duplicadas (SKOV3, A2780), derivados in vitro (A2780ADR, A2780CIS, COV362.4, UWB1.289 + BRCA1) y la línea celular posiblemente contaminada 'COLO720E' . La histología fue descrito por 30/33 líneas celulares y mostró una distribución de frecuencia similar en comparación con los carcinomas de ovario con ser la mayoría serosa (21/33) (Figura 2)
Morfología
:. E epitelial , R Ronda, S husillo,
Histología & amp; Putativa Histología
: S serosa, HGS alto grado seroso, LGS bajo grado seroso, endometrioide E, C de células claras, Mx mixta, M mucinoso.
Origen
: Una ascitis, tejido tumoral T, el tejido TM de metástasis, en el tejido del tumor de ovario, P derrame pleural.
de Tiempo,: P enfermedad primaria, enfermedad recidivante R, RC a la resistencia clínica.
Platinum tratado
: T, el tratamiento basado en platino P no tratado, oh otra quimioterapia, la radioterapia R.
marcadores de proteínas
: rojo brillante ninguna expresión (señal-ruido: para & lt; 5), la luz roja baja expresión (señal-ruido: para 5-20), la expresión de color verde claro (señal-ruido -para relación 20-200), brillante (relación señal-ruido -para & gt alta expresión verde; 200), gris, no determinado.
Terapia respuesta
: verde a rojo sensible a escala resistentes.
Hora de
Duplicar verde menos de un día, 1-2days amarillo, naranja & gt; 2 días.
MSI
inestabilidad de microsatélites.
Las mutaciones génicas
: azul oscuro identificado por al menos dos métodos, de color azul claro identificado por un método, la luz roja identifica con un método pero no con el segundo método.
La amplificación génica
: naranja amplificado (SD 2-3x por encima de la mediana), rojo altamente amplificado (& gt; 3 x SD por encima de la mediana). La vía Wnt /bCatenin (WNT /bcat) y la reparación de recombinación homóloga (HRR) columnas muestran el número de genes mutados en estas vías.
El origen (ascitis, tejido tumoral o derrame pleural), el tiempo (enfermedad primaria, la recurrencia, en la resistencia clínica) y si el paciente había recibido quimioterapia basada en platino antes del cultivo era conocido en las líneas 32, 21 y 25 células respectivamente. Las líneas de células de tejido originado-eran en su mayoría de los pacientes platino-ingenua (7/8, 88%) y la enfermedad primaria (6/7, 86%), mientras que las líneas de células de ascitis originados eran más a menudo tratada con platino (9/15, 60%) y se cultivaron después
inestabilidad de microsatélites
La inestabilidad de microsatélites para los cinco marcadores estudiados se observó para las recaídas y resistencia clínica (10/12, 83%):. 2774, ambas fuentes SKOV3, IGROV1, TOV21G y 'COLO720E' (Figura 2). A2780ADR y A2780CIS mostraron inestabilidad para cuatro de los cinco marcadores (NR-21, BAT26, NR-24, MONO-27) y eran bi-alélica para el quinto BAT25 marcador. Por el contrario, la línea celular A2780 ECACC parental (también de la ECACC Europea colección de cultivos de células) mostró sólo la inestabilidad de microsatélites para un marcador (NR-21) y también era bi-alélica para BAT25. La segunda fuente A2780 de un laboratorio académico no mostró inestabilidad de microsatélites (sólo un pequeño cambio para la NR-21), pero también era bi-alélica para BAT25. Esto indica que las diferentes culturas de la misma línea celular pueden desarrollar o seleccionar las diferencias genéticas como ya hemos descrito anteriormente para diferentes líneas celulares A2780 [54].
A pesar de que los números son muy pequeñas, las cuatro líneas celulares mostraron significativamente menos MSI concordancia de su perfil STR al perfil STR referencia (prueba de Mann-Whitney, p & lt; 0,0013) y más mutaciones que las 29 líneas celulares no MSI (mediana de 13 frente a 2 mutaciones por línea celular, Mann-Whitney U test, p & lt; 0,001 ).
subtipos morfológicos
Tres fenotipos morfológicos fueron distinguidos en base a dos observaciones independientes de las características morfológicas y de crecimiento durante el cultivo de baja densidad hasta un 70/80% de confluencia, es decir, la forma celular, celular tamaño y patrón de crecimiento durante el cultivo, así como la tasa de proliferación. Figura S1 muestra imágenes representativas de seis ejemplos de cada uno de los tres subtipos morfológicos para ilustrar las diferencias en la forma celular, el tamaño y el patrón de crecimiento entre los subtipos morfológicos. El subtipo morfológico 'epitelial' se caracterizó por las células epiteliales como aplanadas que crecieron en placas de agrupaciones regulares o irregulares (n = 21). En el subtipo "Ronda" (n = 7), tamaño de la celda era pequeña con una forma redonda y la alta tasa de proliferación. Las células crecieron por separado o como grupos irregulares, adheridas débilmente a los platos de cultivo de tejidos y, a menudo crecieron en la parte superior de la otra. Las células con el subtipo 'husillo' (n = 12), se estiran y en forma de huso y crecieron como células individuales o grupos irregulares.
Se observó una asociación entre la morfología y el origen de las 33 líneas de células únicas, 74 % de las líneas de células epiteliales se originó a partir de ascitis (14/19), las cuatro líneas celulares eran redondos de cultivo de tejido, mientras que las líneas de células de husillo se originaron por igual de ascitis, derrame pleural o tejido (todo 3/9, 33%) (p exacta de Fisher = 0,002). Aunque no es significativo, las líneas de células epiteliales fueron más a menudo de origen serosa (83%) en comparación con Ronda (33%) y el husillo (56%) líneas celulares.
Curiosamente, el (de exacta, p = 0,095 Fisher) subtipo morfológico se asoció significativamente con la quimioterapia basada en platino antes (10/14 epitelial había recibido previamente un tratamiento a base de platino en comparación con 4/4 vueltas y 7/7 líneas no tratadas; husillos exacta de prueba, p & lt de Fisher; 0,002).
marcadores de proteínas
La expresión de CD44, CD24, EpCAM y luminales de citoqueratina se da en la figura 2.
El CD44 marcador de células madre se expresó en 31/33 de las líneas celulares y se asoció con la morfología (Kruskal-Wallis p = 0,0037). Curiosamente, 6/9 líneas celulares de husillo mostraron alta expresión CD44 combinada con la expresión de CD24 ausente que se ha sugerido como una característica de poblaciones de células madre. Por el contrario, CD44
alta /CD24
-. Expresión no se observó en las cuatro líneas de células redondas y en solo 6/20 líneas de células epiteliales
El marcadores EpCAM epitelial luminal y citoqueratina de se expresaron en la mayoría de las líneas de células epiteliales (19/20 y 18/20, respectivamente), pero sólo en una línea de células redondas (1/4). Todas las líneas celulares mostraron una expresión para husillos ausente o muy bajo de EpCAM pero 5/9 hicieron luminal expresa citoqueratina de. EpCAM y la expresión de luminal citoqueratina se asoció con morfología (Kruskal-Wallis, p & lt; 0,001 y p & lt; 0,024 respectivamente). Así como seroso frente a histología no seroso (Mann-Whitney, p = 0,004 y p = 0,108 respectivamente)
mutación génica y la amplificación
El estado de mutación de 53 genes se determinó con tres técnicas: Snapshot, la secuenciación del exón sólido y /o Tam-Seq. los datos discordantes entre estas tres técnicas fueron verificados de forma manual utilizando la secuencia de datos en bruto. Tabla S4 enumera todos los datos de la mutación que se resume en la figura 2. En total, se detectaron 178 mutaciones en 45 genes en todas las 39 líneas celulares. El gen más frecuentemente mutado fue TP53, mutado en 27/33 líneas celulares incluyendo 7/8 de alto grado seroso, 9/10 serosa y de forma inesperada en 3/3 de bajo grado seroso.
Se determinó la amplificación de CCNE1, MYC, TPX2 y erbB2 mediante la comparación de la cobertura de secuencia para cada exón a la cobertura global media [55]. La amplificación se observó para CCNE1 (n = 5), MYC (n = 3), TPX2 (n = 3) y erbB2 (n = 2) (Figura 2, Figura S2A-C). Cuando comparamos la amplificación genómica de cada gen con la expresión de ARNm, MYC y TPX2 fueron altamente expresado en la mayoría de las líneas celulares incluyendo las líneas que mostraron amplificación (datos no mostrados). Las líneas celulares que muestran
ErbB2
o
CCNE1
amplificación mostraron la más alta expresión de estos genes. Para
CCNE1
esta asociación fue significativa (Mann-Whitney p & lt; 0,001, Figura S2D).
Respuesta a la quimioterapia
inhibición del crecimiento
Para todos los medicamentos, la concentración que produce el 50% (valores de GI50) mostraron un rango de dos log entre las líneas celulares sensibles y resistentes (Figura 3). En particular, los valores medianos GI50 (nm) mostraron marcadas diferencias entre los fármacos con los compuestos más ampliamente separados, docetaxel y carboplatino, que tiene una diferencia de 10000 veces (Figura 3).
Las marcas se prolongan a 1,5 veces la altura de la caja (es decir, 25
percentil para la mediana y la mediana de 75
percentil) o, si no hay ningún valor en ese rango, a los valores máximo y mínimo o
.
mutaciones en la línea germinal
BRCA1
y
BRCA2
se han asociado con la respuesta a los fármacos de platino. Sin embargo, no hay una clara asociación entre la respuesta al disco de platino y la mutación o la expresión de
BRCA1
y
BRCA2 Hoteles en nuestros experimentos (datos no mostrados). Aproximadamente el 50% de las mutaciones BRCA no se conocían observados clínicamente relevantes (Tabla S4) y por lo tanto podría no afectar la función BRCA. Sin embargo, las dos líneas celulares con mutaciones de la línea germinal conocidas en BRCA1 (UWB1.289) y BRCA2 (PEO1) fueron relativamente sensibles a cisplatino.
La respuesta para todos los fármacos mostró una correlación positiva significativa con la tasa de proliferación de las líneas celulares, es decir, el tiempo de duplicación (Tabla 1).
la Tabla 1 muestra la asociación entre la respuesta a los fármacos y la expresión de los marcadores de proteínas CD44, CD24, EpCAM y luminal de citoqueratina. Curiosamente, las líneas celulares con una alta expresión de CD44 eran más sensibles a taxanos. Por el contrario, las líneas celulares que muestran alta expresión de citoqueratina de luminales eran relativamente resistentes a los tres fármacos de platino probados, y la doxorrubicina. Alta expresión de EpCAM también se correlacionó con la resistencia relativa al cisplatino. citoqueratina luminal y EpCAM están fuertemente correlacionados y la expresión ausente de ambos marcadores se observan con mayor frecuencia en las líneas de células redondas que eran, en general, muy sensible a la mayoría de los productos terapéuticos. Si se excluyen las cuatro líneas de células redondas, la única asociación significativa entre la respuesta observada fue oxaliplatino y la expresión de citoqueratina de luminales, lo que indica que este pequeño grupo de líneas celulares está causando principalmente otras asociaciones.
A continuación utiliza el rango de Spearman correlación para la prueba de correlación entre los valores de GI50 y la expresión de cada ARNm o microRNA con el fin de identificar los genes y microARN asociados con la respuesta a la terapia. El número de mRNAs asociados con la respuesta a los ocho agentes terapéuticos probados varió de 22-310 genes (p & lt; 0,001) y 1-10 microRNAs (p & lt; 0,01). La figura 4 muestra para cada mRNA y microRNA y la correlación significativa entre la expresión y la respuesta a cisplatino y paclitaxel.
X-ejes de correlación de Spearman, ejes Y -Log del valor de p.
subtipos histológicos putativos
líneas celulares designadas como putativo HGS o líneas celulares de células endometrioid /claras basadas en cuatro criterios. Criterios para el origen putativo HGS fueron: 1) el origen HGS con TP53 mutación y no MSI, o 2) origen serosa con mutación TP53 y amplificación de CCNE1, MYC o TPX2. Criterios para la célula de origen endometrioide putativo /claros fueron los siguientes:. 1) endometrioide y /o el origen de células claras, o 2) la mutación ARID1A
El uso de estos criterios, hemos deducido el subtipo histológico putativo de las líneas celulares de 39 como 20 no -serous (Figura 2, el último grupo de la columna 1 & amp; 2). y 19 líneas de células serosas que incluían 14 seroso de alto grado y la línea serosa uno de bajo grado (Figura 2, el último grupo de columnas 3-5)
a partir de las líneas celulares no serosas, grupo 1 (véase también la figura 2), contiene diez líneas celulares que se han descrito para ser no seroso y sólo en COV362 y 59 M, una amplificación MYC contradice esto.