Extracto
El P2X7 cerrada-ATP se ha demostrado que desempeñan un papel importante en la capacidad de invasión y metástasis de algunos tumores. Sin embargo, los posibles vínculos y mecanismos subyacentes entre P2X7 y cáncer de próstata no se han dilucidado. Aquí, hemos demostrado que P2X7 fue altamente expresado en algunas células de cáncer de próstata. Down-regulación de P2X7 por siRNA significativamente atenuada ATP o la migración y la invasión de células de cáncer de próstata in vitro, y la invasividad tumoral inhibido y metástasis BzATP impulsada en ratones desnudos. Además, el silenciamiento de P2X7 ATP notablemente atenuado o BzATP- impulsado cambios en la expresión de genes relacionados con la EMT /invasión del caracol, E-cadherina, claudina-1, IL-8 y MMP-3, y debilitó la fosforilación de PI3K /AKT y ERK1 /2 in vitro. Se observaron efectos similares en ratones desnudos. Estos datos indican que P2X7 estimula la invasión de células y la metástasis en células de cáncer de próstata a través de algunos genes de EMT /relacionados con la invasión, así como PI3K /AKT y ERK1 /2 vías de señalización. P2X7 podría ser una prometedora diana terapéutica para el cáncer de próstata
Visto:. Qiu Y, Li W-h, Zhang H-q, Liu Y, Tian X-X, Fang W-G (2014) P2X7 media la capacidad invasora impulsado por la ATP en las células del cáncer de próstata. PLoS ONE 9 (12): e114371. doi: 10.1371 /journal.pone.0114371
Editor: Jean Kanellopoulos, Universidad de Paris Sud, Francia |
Recibido: 15 de Junio, 2014; Aceptado: 6 de Noviembre de 2014; Publicado: December 8, 2014
Derechos de Autor © 2014 Qiu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas a WGF de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81321003, 30971152), y el Programa 973 (2010CB529402) de la Ministerio de Ciencia y Tecnología de China. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es uno de los tumores malignos más comunes, y también una de las principales causas de muerte por cáncer en todo el mundo masculina [1]. La mayoría de los pacientes no mueren del tumor primario local, pero de metástasis a distancia. El proceso de la metástasis del cáncer consiste en eventos secuenciales e interrelacionados [2]. Por un lado, las células cancerosas pueden adquirir capacidades migratorias e invasivas de transición epitelio mesenquimal (EMT), que les permita adquirir la capacidad para infiltrarse en los tejidos circundantes y en última instancia a la metástasis a sitios distantes [3]. Por otro lado, las interacciones entre las células cancerosas y microambiente tumoral son esenciales para la diseminación metastásica de células tumorales [4]. Nuestros estudios previos se han centrado en una importante molécula microambiente tumoral, adenosina 5'-trifosfato (ATP).
Además de tener un papel intracelular en el metabolismo celular como fuente de energía, ATP ha sido ampliamente aceptado como un extracelular molécula de señalización, y puede ser liberado al medio extracelular en ambas situaciones fisiológicas y patológicas, tales como la neurotransmisión, los tejidos de daños, et al [5], [6], [7]. Ahora está claro que el ATP es uno de los componentes bioquímicos abundantes del microambiente del tumor y desempeña un papel clave en la interacción huésped-tumor. ATP extracelular actúa como una molécula de señalización a través de la interacción con los receptores P2 y media una variedad de procesos biológicos tales como la proliferación celular, la migración y la invasión [8], [9], [10]. receptores P2 se dividen en dos familias distintas: receptores acoplados a proteína G P2Y (P2Y1, 2, 4, 6, 11, 12, 13 y 14) y los receptores P2X catión de canal permeable por ligando (P2X1-7) [11]. se ha informado de una serie de receptores P2 que se expresa en células de cáncer de próstata [10], [12]. Nuestro estudio anterior demostró que la ATP extracelular era un agente pro-invasiva importante y P2Y2 fue uno de los principales receptores, que median la migración promovida por el ATP y la invasión de células de cáncer de próstata [10]. Sin embargo, también encontramos que mediada por ATP pro-invasión no puede ser abolida por completo después de silenciamiento máxima de P2Y2, lo que indica que algún otro subtipo (s) del receptor podría estar implicado en este proceso. Entre la familia de receptores P2X, P2X7 es el último miembro clonado [13], y fue inicialmente considerado como un receptor citolítica desde su activación prolongada conduce a la muerte celular [14]. Recientemente, se encontró que P2X7 se expresa abundantemente en las células cancerosas de leucemia, neuroblastoma, melanoma, así como en la próstata, de mama y cáncer de tiroides [15], [16], [17], [18], [19], e incluso se propuso ser un biomarcador de cáncer en etapa temprana [17], [20], [21]. Por otra parte, se informó de la activación de P2X7 tener efectos anti-apoptóticos, estimular el crecimiento de células tumorales [22], [23], e incluso promover la invasividad celular en algunas células del cáncer [24], [25], lo cual es contradictorio a la inicial P2X7 suposición de que era un "receptor de muerte". En este estudio, que tuvo como objetivo investigar el papel de P2X7 en la invasión y la metástasis del cáncer de próstata, y para revelar los mecanismos subyacentes.
Materiales y Métodos
Productos químicos y anticuerpos
ATP, BzATP, KN62, LY294002, U0126 y la digitonina se obtuvieron de Sigma (St Louis, MO, EE.UU.). anticuerpo de conejo anti-P2X7 (# APR-008) se obtuvo de Alomone Labs (Jerusalem, Israel), y anticuerpos de β-actina (# TA-09), ERK1 /2 (# SC-94) y E-cadherina (# SC-7870) se obtuvieron de Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz, CA, EE.UU.). Los anticuerpos de caracol (# 3895S), Claudín-1 (# 4933P), p-AKT (# 4056S), AKT (# 4691S), y p-ERK1 /2 (# 9101S) fueron adquiridos de Señalización Celular Tecnología (Danvers, MA , ESTADOS UNIDOS). de cabra conjugado con HRP anti-ratón (# ZB-2305) y de cabra anti-IgG de conejo (# ZB-2301) se obtuvieron de OriGene (Maryland, EE.UU.). Fluo-04 a.m. (# F14201) se obtuvo de Molecular Probes (Eugene, OR, USA). HBSS (# 14025092) fue adquirido de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.).
Líneas celulares y condiciones de cultivo
El 1E8 y 2B4 células se obtuvieron a partir de la célula de carcinoma de próstata humano PC-3M línea. 1E8 era altamente metastásico, mientras que 2B4 era [26] no metastásico. línea celular de cáncer de próstata y 22Rv1 BPH1 se adquirieron de la American Type Culture Collection. Todas las células se cultivaron en medio RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, NY, EE.UU.) suplementado con suero bovino fetal al 10% en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2 a 37 ° C.
Transcripción reversa y PCR en tiempo real
El ARN total se extrajo usando el reactivo Trizol (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. 2 g de ARN total se transcribe inversamente en cDNA utilizando MMLV transcriptasa inversa (Promega, Madison, Wisconsin, EE.UU.), y la PCR en tiempo real se realizó mediante ABI StepOne Real-Time PCR System (Applied Biosystems, EE.UU.). Los cebadores específicos fueron adquiridos de Invitrogen y se enumeran en la Tabla S1. Las condiciones de ciclo térmico fueron las siguientes: 10 min a 95 ° C, 30 ciclos de 15 s a 95 ° C y 1 min a 60 ° C. genes niveles relativos de expresión, la expresión normalizada de ß-actina, se calcularon utilizando el 2
-. △△ Ct método [27]
La lisis celular y Western Blot análisis
Todo el lisado celular se extrajo con tampón RIPA (Applygen Technologies Inc, Beijing, china) que contiene inhibidores de la proteasa y los inhibidores de fosfatasa (Roche, Mannheim, Alemania). La concentración de proteína se determinó utilizando un reactivo BCA (Applygen Technologies Inc, Beijing, China). Igual cantidad de proteínas fueron separadas por SDS-PAGE gel y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.), que se incubaron a 4 ° C durante la noche con anticuerpos primarios contra P2X7 (1:200), E-cadherina (1:500), Claudín-1 (1:1000), Caracol (1:1000), β-actina (1:1000), ERK1 /2 (1:1000), AKT (1:1000), p-ERK1 /2 (1:1000) o p-AKT (1:1000), respectivamente. Las proteínas inmunorreactivas se visualizaron por quimioluminiscencia (Applygen Technologies Inc) y se cuantificaron mediante análisis de densitometría usando un software Cantidad (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.).
ligado a enzimas (ELISA)
las células se cultivaron en presencia o ausencia de ATP, y se recogió el sobrenadante después de tratamiento diferente. El sobrenadante se almacenó a -80 ° C después de centrifugación a 12.000 rpm durante 15 min a 4 ° C. Los niveles de IL-8 y MMP-3 proteínas se midieron por separado usando la IL-8 ELISA kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y MMP-3 ELISA kit (Boster, Wuhan, China) siguiendo las instrucciones del fabricante. La concentración de IL-8 y MMP-3 se determinó mediante la comparación de la absorbancia con la proteína estándar, y luego normalizada a la proteína total.
Transfección de células
Para el silenciamiento de genes transitoria, dos oligonucleótidos distintos siRNA la orientación P2X7 se utilizaron con las secuencias de la siguiente manera: P2X7 siRNA1, 5'-CTAGGATAATGTCCAACTAAA-3 'y P2X7 siRNA2, 5'-CACAGTGTCTTTGACACCGCA-3'. Un siRNA scramble se utilizó como control negativo. células de cáncer de próstata 1E8 y 2B4 se transfectaron con el siRNA anteriormente usando Lipofectamine RNAi Max (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante.
Para el silenciamiento de genes estable, dos plásmidos con shRNA (ARN de horquilla corta ) dirigidos a P2X7 se construyeron usando el sistema de pGPU6 /GFP /Neo clonación (Genepharma Co, Ltd, Shanghai, china). Las secuencias de direccionamiento P2X7 fueron los siguientes: shRNA1, 5'-GCATGAATTATGGCACCATTA-3 ', y shRNA2, 5'-GCAATTCAGGGCGGAATAATG-3'. El /GFP /vector Neo pGPU6 con una secuencia de scramble shRNA se utilizó como control negativo. Transfección de células se realizó utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. clones de células, con la eliminación estable de P2X7 se establecieron en las células 1E8 por la selección de geneticina (G418).
En la sobre expresión génica, se construyó un vector de expresión de codificación de longitud completa P2X7 humano (hP2X7) (Genepharma Co, Ltd , Shanghai, china), y se transfectó en células de cáncer de próstata 22Rv1.
ensayo in vitro migración y la invasión de ensayo
se evaluaron las capacidades de migración y la invasión de células de cáncer de próstata utilizando cámara de Boyden ensayo de acuerdo con la el método descrito por Albini et al [28], con algunas modificaciones. La migración celular se analizó mediante el uso de cámaras de 24 pocillos Transwell que contenían 8 M de tamaño de poro polietileno tereftalato insertos de cultivo celular de membrana (Costar, San Diego, CA, EE.UU.). El compartimento superior se sembró con 0,5 × 10
5 células viables y el compartimiento inferior se llenó con 600 l NIH3T3 medio condicionado como un quimioatrayente. Después de la incubación con o sin ATP durante 12 horas a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2, se retiraron las cámaras. Las células en el lado superior de la cámara se retiraron con hisopos con punta de algodón, y las células en la parte inferior de las membranas se tiñeron con cristal violeta después de la fijación en formaldehído al 4%. La capacidad invasora de células se evaluó mediante los mismos insertos como se mencionó anteriormente, pero con la membrana cubierta con una película de Matrigel (BD, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE.UU.). En este caso, 1 × 10
5 células viables se sembraron en el compartimiento superior. Las membranas se cortaron y montaron en portaobjetos y se observaron las células bajo el microscopio a 200 × magnificación. Cada experimento se repitió al menos tres veces, y los resultados de la migración y la invasión se normalizaron a los controles.
Ética declaración
Todos los ratones fueron criados en un entorno libre de patógenos específicos (SPF). Todos los animales fueron manejados de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Todos los procedimientos y protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Pekín (núm LA2011-72).
Ensayo in vivo
El macho BALB /c ratones desnudos (4 se compraron semanas de edad) del Departamento de la Universidad de Pekín Centro de Ciencias de la Salud Animal y fueron distribuidos aleatoriamente en tres grupos (n = 8 por grupo). Dos clones 1E8 con caída estable de P2X7, así como un clon de control negativo se usaron en los siguientes experimentos. Las células en la fase de crecimiento logarítmica se recogieron y se ajustan con PBS a la concentración de 5 x 10
6 células /ml, y 200 l de suspensión celular se inyectó por vía subcutánea en cada región del flanco anterior de ratones desnudos. Ocho semanas después de la inoculación, todos los ratones fueron sacrificados mediante dislocación cervical, y los tumores primarios junto con algunos órganos tales como el hígado, los pulmones, los riñones y ganglios linfáticos fueron extirpados. Tumores, hígados, pulmones y riñones de los ratones fueron fijadas en paraformaldehído al 4%, embebidos en parafina y luego se seccionaron en 4~5 micras rodajas. Para observar la micrometástasis distantes del tumor primario, hematoxilina y eosina (HE) tinción se realizó en las diapositivas de tejidos. Mientras tanto, algunos tejidos tumorales se lisaron con tampón de lisis RIPA para la detección de las expresiones de proteínas de los genes de EMT /relacionados con la invasión mediante el análisis de transferencia Western. Por otra parte, algunas muestras de tumor se sumergieron en medio de OTC, y las secciones congeladas de 5 m de espesor se prepararon para el ensayo de inmunofluorescencia.
inmunofluorescencia ensayo
Para la tinción de inmunofluorescencia, las muestras de tumor se sumergieron en medio de OTC , y se prepararon secciones congeladas de 5 micras de espesor. Las secciones fueron fijadas con acetona durante 10 minutos a -20 ° C, y luego la unión no específica se bloquearon en suero de cabra durante 1 h a temperatura ambiente. Las secciones se incubaron durante la noche a 4 ° C con anticuerpos primarios contra Snail (Cell Signaling Technology), E-cadherina (Santa Cruz), o claudina-1 (Invitrogen), respectivamente, y, a continuación, se incubaron con un anticuerpo secundario conjugado con FITC (Sigma) para 1 h a temperatura ambiente. DAPI tinción se utilizó para visualizar los núcleos. Las imágenes fueron tomadas con el microscopio confocal.
Fluo-4 am y ensayos de absorción de bromuro de etidio
Los cambios en la concentración de calcio libre interior se midieron con el indicador fluorescente Fluo-4am. Células cultivadas en placas de vidrio de 1 mm en el plato inferior se cargaron durante 30 minutos a 37 ° C con 1 mM de Fluo-04 a.m. en tampón HBSS. colorante en exceso se eliminó lavando las células dos veces con HBSS. Entonces, se incubaron las células durante 10 min adicionales en HBSS, y se trataron con o sin ATP y BzATP como se indica en la Figura leyendas. Las imágenes fueron adquiridas a intervalos de 5 s; se midieron numerosas células en un campo de visión de 350 s para obtener la señal media de fluorescencia Fluo-4. Para medir la absorción de etidio, bromuro de etidio (25 mM) se añadió a las soluciones de superfusión. Las imágenes fueron adquiridas a intervalos de 5 s durante 900 s. La absorción total de bromuro de etidio se estimó mediante la adición de digitonina (100 mM) en la cubeta. El efecto de permeabilización de ATP o BzATP se estimó por comparación con la permeabilización medida en presencia de digitonina.
La supervivencia celular ensayo
Para evaluar la supervivencia celular, 2 × 10
5 células se sembraron por pocillo en placas de seis pocillos en un medio de cultivo de control o en presencia de ATP 1 mM (o 100 mM BzATP), y se hicieron crecer durante 24 h. La supervivencia celular se estimó con el ensayo de MTT y los datos se expresaron como% de supervivencia celular en comparación con el control. Los resultados fueron validados mediante recuento celular manual. se realizaron al menos tres experimentos independientes.
Análisis de datos y estadísticas
Todos los experimentos se repitieron al menos tres veces. Los datos se presentan como medias ± SD. Los datos se analizaron con el programa SPSS 19.0. Estudiante de
t-test
se realizó para evaluar las diferencias entre los dos grupos, y se utilizó ANOVA no paramétrico cuando se compararon varios medios. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a p & lt;. 0.05
Resultados
células de cáncer de próstata expresado funcional P2X7
En primer lugar, se analizó la expresión del ARNm de P2X7 en células de cáncer de próstata 1E8, 2B4 y 22Rv1 así como en no maligna de las células epiteliales de próstata inmortalizada BPH1 usando PCR en tiempo real, y encontraron que P2X7 se expresó notablemente en 1E8 y 2B4 células de cáncer de próstata, mientras que su expresión era muy débil en las células 22Rv1 y BPH1 (Fig. 1A). Además, la proteína P2X7 fue altamente expresado en 1E8 y 2B4 células de cáncer de próstata (Fig. 1B). A continuación, se analizó la concentración de calcio libre intracelular ([Ca
2 +] i) para determinar si P2X7 en las células de cáncer de próstata era funcional. ATP extracelular (1 mM) o BzATP (100 mM) de tratamiento provocó una notable aumento de [Ca
2 +] i en células de cáncer de próstata, supervisados por Fluo-4 fluorescencia. Sin embargo, KN62 (1 M), un antagonista de P2X7, inhibió significativamente ATP o BzATP inducida [Ca
2 +] i aumento (Fig. 1C). captación de etidio también se registró en células de cáncer de próstata después estimuladas con ATP o BzATP, que fue significativamente inhibido cuando se añadió KN62 a la solución externa (Fig. 1D-E). Todos estos resultados sugieren que P2X7 se expresa en células de cáncer de próstata era funcional.
(A) la expresión de ARNm relativa de P2X7 se normalizó por transcripción β-actina en células 1E8, 2B4, 22Rv1 y BPH1. niveles (B) de proteína de P2X7 en células de cáncer de próstata se detectaron por análisis de transferencia Western y los datos se normalizaron a beta-actina. Expresión de proteínas de P2X7 en células BPH1 se definió como 1. Los valores se presentan como media ± s.d. (barras verticales). (C) los cambios de calcio intracelular representativos en respuesta a ATP (1 mM) o BzATP (100 mM) en presencia o ausencia de KN62 (1 M). (D) la captación de etidio Representante de células de cáncer de próstata en la condición basal o a la estimulación con ATP (1 mM) o BzATP (100 mM) en presencia o ausencia de KN62. Se añadió ATP /BzATP, como se indica por la flecha, a la HBSS que contiene bromuro de etidio 25 mM. (E) de etidio intensidad de fluorescencia en estado basal o a la estimulación con ATP (1 mM) o BzATP (100 mM) en presencia o ausencia de KN62, se presentó como un porcentaje en relación con el valor de la permeabilización inducida por digitonina. se realizaron al menos tres experimentos independientes. * P & lt;. 0,05
P2X7 estuvo implicado en la migración impulsada por BzATP ATP /e invasión de células de cáncer de próstata in vitro
P2X7 se ha demostrado que es sobreexpresado en varios tumores [15], [16], [17], [18], [19], sin embargo, su papel en la progresión del cáncer sigue siendo poco clara. Nuestros estudios previos demostraron que la ATP extracelular podría mejorar la migración y la invasión de células de cáncer de próstata [29], [30]. Nos preguntamos si P2X7 desempeñó un papel en el comportamiento biológico mediado por ATP de las células del cáncer de próstata. En primer lugar, hemos analizado el efecto de P2X7 en la supervivencia de las células del cáncer de próstata, y se encontró que la activación de P2X7 con ATP o BzATP no tuvo ningún efecto sobre la viabilidad celular (Fig. 2A). En contraste, se encontró que la activación de P2X7 por ATP causó una mejora significativa de la migración celular y la invasión en las células de cáncer de próstata (Fig. 2C-D). A continuación, se utilizaron dos siRNAs distintos (siRNA1 y siRNA2) para silenciar la expresión P2X7, y cada siRNA consigue un efecto destacado en desmontables de P2X7 en células de cáncer de próstata (Fig. 2B). Baja regulación de P2X7 de siRNA inhibe notablemente la migración impulsada por el ATP y la invasión de 1E8 y 2B4 células de cáncer de próstata (Fig. 2C-D). Del mismo modo, desmontables de P2X7 también bloqueó significativamente la migración y la invasión de células de cáncer de próstata BzATP mediada en 1E8 y 2B4 células de cáncer de próstata (S1 figura). Por otra parte, la sobre expresión de P2X7 prominente mejorado la migración inducida por ATP y la invasión en 22Rv1 células de cáncer de próstata (S2A-B Figura). Estos resultados sugieren que P2X7 estuvo implicado en la migración mediada por la ATP y la invasión de las células del cáncer de próstata.
(A) y 2B4 1E8 células de cáncer de próstata fueron tratados con 1 mM ATP durante 12 hy 24 h. La supervivencia celular se estimó por el ensayo MTT y los datos se normalizaron a los menores de condición de control. (B) 1E8 y 2B4 células fueron transfectadas con siRNAs dos diferentes P2X7 (siRNA1 y siRNA2) o un control de siRNA (NC). Se llevaron a cabo experimentos de Western blot para detectar la eficiencia desmontables. (C-D) en ensayos in vitro de migración y la invasión se llevaron a cabo como se describe en la sección de métodos en ausencia (control) o presencia de ATP 1 mM (ATP 12 h). Los datos de la migración de células o invasión se calcularon como un porcentaje de las células control. Los resultados fueron demostrados por los histogramas y valores se presentan como media ± S. D. (barras verticales). se realizaron al menos tres experimentos independientes. * P & lt;. 0,05
P2X7 participó en la regulación de la expresión génica de EMT /relacionados con la invasión de las células del cáncer de próstata
Mediante el uso de análisis de microarrays de ADNc, nuestro estudio anterior reveló que el ATP extracelular podría regular la expresión de mRNA de Snail, e-cadherina, claudina-1 y IL-8, que desempeñan papeles importantes en la EMT y la progresión del tumor [10]. Además, nuestro estudio anterior en el cáncer de próstata demostró que el tratamiento ATP podría aumentar la expresión de MMP-3, que está ampliamente implicado en la invasión y metástasis del cáncer [30]. De acuerdo con ello, nos preguntamos si P2X7 participó en estas expresiones de genes ATP mediada. Como se muestra en la Fig. 3, en presencia de ATP, las expresiones de caracol, IL-8 y MMP-3 fueron significativamente superiores en las células de cáncer de próstata 1E8 y 2B4, mientras que las expresiones de E-cadherina y claudina-1 se redujo prominente. BzATP mostró un efecto similar sobre las expresiones de genes /EMT-relacionados invasión de células de cáncer de próstata (S3 Figura). Sin embargo, después de desmontables de P2X7 de siRNA, los cambios en las expresiones de caracol, IL-8, MMP-3, E-cadherina y Claudín-1, mediada por ATP o BzATP, fueron atenuados (Fig. 3 y S3 Figura). Por otra parte, bloqueando específicamente la activación de P2X7 por su antagonista KN62, ATP y BzATP no podría afectar la expresión de Snail, E-cadherina y claudina-1 más (S4 y S5 figuras). Del mismo modo, ATP condujo a una mayor expresión de Snail y disminución de la expresión de E-cadherina en 22Rv1 células que expresaban de forma exógena P2X7 (S2C figura). Todos estos datos sugieren que se requiere para los P2X7 mediados por ATP cambios de expresión de genes de EMT /relacionados con la invasión de células de cáncer de próstata.
células P2X7 silenciado (siRNA1 y siRNA2) y las células de control siRNA (NC) fueron tratados con o sin ATP 1 mM durante 12 horas. Los niveles de proteína de caracol (A), E-cadherina (B) y Claudín-1 (C) fueron examinados por Western blot. Los niveles de proteína de IL-8 (D) y MMP-3 (E) se evaluaron mediante el ensayo de ELISA. Expresiones de estas proteínas se normalizaron a sus respectivas expresión en células de control (sin ATP). Los datos se presentan como media ± s.d. (barras verticales). se realizaron al menos tres experimentos independientes. * P & lt;. 0,05
La activación de PI3K /Akt y ERK1 /2 vías de señalización eran críticos en impulsadas BzATP ATP /migración, invasión y los cambios de expresión de genes /EMT relacionadas con la invasión-
en nuestro estudio anterior, se ha demostrado que la ATP activa PI3K /Akt y ERK1 /2 vías de señalización en un tiempo-y de manera dependiente de la dosis en 1E8 y 2B4 células de cáncer de próstata [29], [30]. Aquí, encontramos que el tratamiento BzATP también causó una notable activación de PI3K /Akt y ERK1 /2 vías de señalización en células de cáncer de próstata (S6A-B Figura). Para comprender el impacto funcional de PI3K /Akt y ERK1 /2 vías de señalización en las células del cáncer de próstata, dos inhibidores farmacológicos, LY294002 y U0126 se utilizaron para bloquear PI3K /AKT y la vía de señalización ERK1 /2, respectivamente (Fig. 4A-B y S6A- Figura B). Los resultados mostraron que la migración y la invasión de células de cáncer de próstata ATP y BzATP impulsada se suprimió de forma significativa cuando PI3K /AKT o vía ERK1 /2 señalización se inhibió (Fig. 4C-D y S6C-D Figura). Además, la inhibición de cualquiera de PI3K /AKT o vía de señalización ERK1 /2 atenuó significativamente los cambios de expresión de genes /EMT relacionadas con la invasión-inducidas por ATP o BzATP en células de cáncer de próstata (Fig. 5 y S7 Figura).
IE8 y 2B4 células se trataron con LY294002 (carriles indicados como LY294002) o U0126 (carriles indicados como U0126) o sin tratamiento (servido como control negativo, carriles indicados como NC). (A-B) LY294002 y U0126 inhibió ATP mediada por PI3K /AKT y la activación de ERK1 /2, respectivamente. (C-D) Efecto de LY294002 y U0126 sobre la migración y la invasión de 1E8 y 2B4 las células del cáncer de próstata. Los datos de la migración de células o invasión se calcularon como un porcentaje de las células control. Los resultados se demostraron por histogramas, y los valores se presentan como media ± s.d. (barras verticales). se realizaron al menos tres experimentos independientes. * P & lt;. 0.05
IE8 y 2B4 células se trataron con LY294002 (carriles denotan como LY294002) o U0126 (carriles indicados como U0126) o sin tratamiento (servido como control negativo, carriles indican como NC ). Expresiones de caracol (A), E-cadherina (B) y Claudín-1 (C) se detectaron mediante transferencias Western. Expresiones de IL-8 (D) y MMP-3 (E) se detectaron mediante ELISA. Expresiones de estas proteínas se normalizaron a sus respectivas expresión en células de control (sin ATP). Los datos se presentan como media ± s.d. (barras verticales). se realizaron al menos tres experimentos independientes. * P & lt;. 0.05
se requiere P2X7 para la activación inducida por BzATP ATP /de PI3K /Akt y ERK1 /2 vías de señalización
Desde que se observó que P2X7, así como PI3K /Akt y ERK1 /2 vías de señalización mostraron efectos importantes en la ATP y conducidos-BzATP migración, invasión y los cambios de expresión de genes /EMT relacionadas con invasión de las células del cáncer de próstata, nos preguntamos si P2X7 participó en la ATP y la activación de BzATP inducida PI3K /Akt y ERK1 /2 vías de señalización. Como se muestra en la Fig. 6 y S8 Figura, desmontables de P2X7 como resultado una inhibición importante de la ATP y la fosforilación de PI3K /Akt y ERK1 /2 vías de señalización BzATP inducida. En conjunto, estos resultados sugieren un papel importante de P2X7 en la activación mediada por ATP de PI3K /Akt y ERK1 /2 vías de señalización.
Se trataron células P2X7 silenciado (siRNA1 y siRNA2) y las células de control siRNA (NC) con o sin ATP 1 mM durante 15 min. Se llevaron a cabo experimentos de Western blot para analizar el nivel de fosforilación de AKT (A) y ERK1 /2 (B). Expresiones de p-AKT y p-ERK1 /2 se normalizaron a sus respectivos expresión en células de control (sin ATP). Los datos se presentan como media ± s.d. (barras verticales). se realizaron al menos tres experimentos independientes. * P & lt;. 0,05
P2X7 se requería para la invasión y la metástasis in vivo, así como la regulación de la expresión de genes /EMT relacionadas con la invasión-
Por último, se analizó la in vivo efecto de P2X7 en la invasión y metástasis en ratones desnudos. Los tumores en los ratones, desarrollado con inyectan por vía subcutánea células de control, muestran invasión significativa a los tejidos cercanos, como la grasa y el músculo. Además, en los ratones inyectados con células de control, 37,5% de ellos presentó metástasis a distancia a los riñones y 87,5% metástasis en los ganglios linfáticos presentado. Sin embargo, en los dos grupos inyectados con células P2X7-silenciados, sólo un ratón tenía metástasis en los ganglios linfáticos (Fig. 7).
células 1E8 (A) fueron transfectadas establemente con P2X7 shRNA o una lucha shRNA (Carolina del Norte ). Dos clones estables P2X7 shRNA (shRNA1 y shRNA2), se mostró a expresar niveles bajos de P2X7 utilizando análisis de Western blot. (B) Fotografía de Representante de secciones de tumor y los tejidos adyacentes (teñidas con hematoxilina y eosina (H & amp; E)). Barras de escala = 100 m. (C) las fotografías representativas de la sección del riñón y en la sección de ganglio linfático (teñidas con H & amp; E) de los ratones portadores de tumores. Barras de escala = 50 m. (D) El número de micrometástasis en ganglios linfáticos riñón y por sección de los ratones portadores de tumores. * P & lt;.
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También se analizó la expresión de Snail, E-cadherina, claudina-1 e IL-8, así como los niveles de fosforilación de Akt y ERK1 /2 en los tejidos tumorales primarios de ratones de control formado por 1E8 células shRNA y células P2X7 shRNA. Después desmontables de P2X7, expresiones de caracol y la IL-8 fueron inhibidas, obviamente, mientras que las expresiones de E-cadherina y Claudín-1 aumentaron significativamente (Fig. 8A-C). Además, P2X7 caída de activación significativamente inhibido de Akt y ERK1 /2 en los tejidos tumorales (Fig. 8D). Estos resultados fueron consistentes con los resultados observados in vitro.
(A) La tinción de inmunofluorescencia para el caracol, E-cadherina, claudina-1 (verde) y DAPI (azul) se realizaron en los tejidos tumorales de ratones. Las imágenes fueron tomadas por microscopía confocal. Las barras de escala representan 75 micras o 25 micras como se muestra en la figura. (B) transferencia de Western se realizó para detectar los niveles de proteína de caracol, E-cadherina y claudina-1 en los tejidos tumorales. (C) ELISA se utilizó para examinar la expresión de IL-8. (D) la transferencia Western se realizó para analizar el nivel de fosforilación de AKT y ERK1 /2 en los tejidos tumorales. Para cada grupo, al menos tres tumores diferentes de tres ratones diferentes se usaron en los experimentos. * P & lt;. 0.05
Discusión
Muchos estudios demostraron que el microambiente extracelular de tumores contenía concentraciones mucho más elevadas de ATP que los tejidos sanos, y ATP podría representar un estímulo estresante en la progresión del cáncer [7]. ATP podría ser secretada por las células tumorales que viven en su microambiente en concentraciones relativamente altas, así como ser liberado de las células necróticas en las regiones perilesional de cánceres [6], [7], [24]. Como un mensajero extracelular ubicua, funciones de ATP a través de su interacción con los receptores P2X y P2Y.
Entre los receptores P2 contratados por ATP extracelular, P2X7 es la expresada más consistente o incluso sobre-expresado por las células tumorales. P2X7 es un canal iónico ATP-cerrada y durante mucho tiempo ha sido conocido por su actividad citotóxica, sin embargo, cada vez más pruebas sugiere un papel para P2X7 en la proliferación celular. P2X7 se ha demostrado para estimular la proliferación de células linfoides y promover suero independiente de crecimiento [22], [23]. Amplios estudios en células inmunes mostraron el importante papel de P2X7 como un receptor inmunomodulador implicado en la interleucina (IL) maduración -1β y liberación, la presentación de antígenos y la reacción de injerto contra huésped [31], [32], [33]. Durante la última década, de alta expresión de P2X7 se ha encontrado en diversos tipos de tumores y se ha acumulado evidencia que muestra los efectos pro-cancerosas de P2X7 [15], [16], [17]. Las células de melanoma con P2X7 altamente expresado, muestran efecto anti-apoptótico [16]. Después de la transfección con P2X7, fibroblastos HEK293 y células de carcinoma de colon CT26 demostrado con mejoras en la tumorigénesis, el crecimiento in vivo y la angiogénesis, y la reducción en la apoptosis [34]. Además, la activación de P2X7 promovió la migración y la invasión de células de cáncer de mama [24] y neoplasias linfoides células [35]. En el presente estudio, hemos demostrado que P2X7 fue altamente expresado en algunas células de cáncer de próstata. Desmontables de P2X7 de siRNA abrogada significativamente la migración mejorada-ATP y la invasión in vitro. Además, la baja regulación de P2X7 llevó a notable inhibición de la invasión tumoral y las metástasis en ratones desnudos. Por otra parte, la sobre-expresión de P2X7 un marcado aumento de ATP mediada por la migración y la invasión de células de cáncer de próstata 22Rv1, proporcionando evidencia adicional de que P2X7 fue uno de los principales reguladores de la invasión del cáncer de próstata y metástasis.
La transición epitelio-mesenquimal (EMT) es un paso importante en la progresión del cáncer y muy relacionado con alta característica móviles e invasivo de las células cancerosas. Ahora es ampliamente aceptado que la expresión alterada o función de E-cadherina es uno de los primeros pasos en la EMT [3]. Además de las moléculas de adhesión, durante la progresión de la EMT, las proteínas de unión estrecha, como Claudins, son por lo general las reguladas [36]. Claudins desempeñar un papel crucial en el mantenimiento de la polaridad celular y tienen una influencia significativa en la progresión tumoral en varios tipos de cáncer [37], [38], [39]. Además, se han reportado varios factores de transcripción tales como caracol, barra y gire para conducir EMT en diversas células cancerosas, y el caracol, un factor de transcripción importante, es generalmente hasta reguladas durante el proceso de EMT [3]. En el presente estudio, hemos demostrado que el tratamiento con ATP y BzATP tanto dio lugar a una regulación significativa de caracol, así como una dramática baja regulación de la E-cadherina y Claudín-1 en células de cáncer de próstata in vitro, y P2X7 caída notablemente inhibido la expresión de Snail y expresiones promovidos de e-cadherina y Claudín-1 in vitro e in vivo. Estos resultados sugieren que P2X7 mediada la EMT impulsado por ATP en células de cáncer de próstata.
La progresión tumoral y la metástasis no solamente dependen del potencial maligno de las células cancerosas mismas, sino también la influencia de diversos factores de regulación en el ambiente de tumor . (barras verticales). se realizaron al menos tres experimentos independientes. Los datos se presentan como media ± s.d. (barras verticales). se realizaron al menos tres experimentos independientes. Los niveles de proteína de caracol (A), E-cadherina (B) y Claudín-1 (C) fueron examinados por Western blot. Los niveles de proteína de IL-8 (D) y MMP-3 (E) se evaluaron mediante el ensayo de ELISA. Los datos se presentan como media ± s.d. (barras verticales). se realizaron al menos tres experimentos independientes. Los datos se presentan como media ± s.d. (barras verticales). se realizaron al menos tres experimentos independientes. Los datos se presentan como media ± s.d. (barras verticales). se realizaron al menos tres experimentos independientes. (barras verticales). se realizaron al menos tres experimentos independientes. Los datos se presentan como media ± s.d. (barras verticales). se realizaron al menos tres experimentos independientes. Los datos se presentan como media ± s.d. (barras verticales). se realizaron al menos tres experimentos independientes.