Extracto
El papel de c-Crk (CRK) en la promoción de la metástasis está bien descrito embargo el papel de la fosforilación CRK y los eventos de señalización correspondientes no están bien explicado. Hemos observado CRK-II serina 41 fosforilación se correlaciona inversamente con la p120-catenina y E-cadherina expresión en células de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). Por lo tanto, hemos investigado el papel de CRK-II serina 41 fosforilación de la baja regulación de p120-catenina, la motilidad celular y la invasividad celular en células de NSCLC. Con este fin, hemos expresado phosphomimetic y phosphodeficient serina CRK-II 41 mutantes en células de NSCLC. células de NSCLC que expresan phosphomimetic CRK-II seine 41 mutante mostraron menor nivel de p120-catenina, mientras CRK-II seine 41 phosphodeficient expresión mutante produjo una mayor p120-catenina. Además, las células A549 que expresan CRK-II serina 41 mutante phosphomimetic demostraron un comportamiento más agresivo en los ensayos de curación y la invasión de la herida y, por el contrario, la expresión de phosphodeficient CRK-II serina 41 mutante en células A549 dio lugar a la reducción de la motilidad celular y la invasión. También proporcionamos evidencia de que PAK1 media CRK-II serina 41 fosforilación. RNAi mediada por silenciamiento de PAK1 aumentó el nivel de p120-catenina en las células A549 y H157. Además, el silenciamiento PAK1 disminución de la motilidad celular y la invasión en las células A549. Estos efectos fueron abrogadas en las células A549 expresan phosphomimetic serina CRK-II 41. En resumen, estos datos proporcionan evidencia del papel de PAK1 en la promoción de la motilidad celular, invasión celular y la regulación a la baja de p120-catenina a través CRK serina 41 en la fosforilación células de NSCLC
Visto: M. Rettig, Trinidad K, G Pezeshkpour, Frost P, S Sharma, Moatamed F, et al. (2012) PAK1 quinasa promueve la motilidad celular y la invasión a través CRK-II serina fosforilación en la celda células no pequeñas de cáncer de pulmón. PLoS ONE 7 (7): e42012. doi: 10.1371 /journal.pone.0042012
Editor: Frederic Andre, Universidad de Aix-Marsella, Francia |
Recibido: Marzo 7, 2012; Aceptado: June 29, 2012; Publicado: 27 Julio, 2012
Copyright: © Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuido, transmitido, modificado, construido sobre, o utilizado de otra manera por cualquier persona por cualquier propósito legal. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Desarrollo de las lesiones metastásicas en los tumores sólidos más como resultado una enfermedad incurable por modalidades de tratamiento actuales. Por lo tanto, la comprensión de los eventos que promueven la invasión tumoral y la metástasis nos ayudará a evitar la propagación de tumores malignos, especialmente en el caso de la enfermedad de etapa temprana y quizá oligometastásica. Como miembro de unión adherente, p120-catenina (p120ctn) juega un papel importante en las adhesiones célula-célula y la pérdida de los resultados de expresión de p120-catenina en la desestabilización del complejo de cadherina-catenina promoviendo así la invasión tumoral y la metástasis [1], [2 ], [3], [4],. Teniendo en cuenta la regulación por disminución de p120-catenina en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) está mediada transcripcionalmente [11], una investigación en los eventos de señalización corriente arriba que podría dar lugar a la represión transcripcional de
p120-catenina (CTNND1), Francia nos llevan al adaptador CRK proteínas y su papel en la represión de p120-catenina [12].
c-Crk (CRK) pertenece a una familia de proteínas adaptadoras ampliamente expresado que están implicadas en la transducción de señales de una variedad de receptores y oncoproteínas (por ejemplo, Bcr-Abl; Tel-Abl, receptor de eritropoyetina, EGFR, GM-CSF, el sustrato receptor de insulina, PDGF y VEGFR [13], [14]). CRK, interactúa con varios efectores incluyendo SOS1, DOCK1 JNK1 y SP1. Nuestros datos muestran que CRK regula negativamente
p120-catenina (CTNND1)
la transcripción en células de NSCLC mediante la interacción con el factor de transcripción SP1 [12]. La posición central de la CRK en las cascadas de señalización hace que sea probable que CRK afecta a varios objetivos de abajo, que no sea el
p120-catenina (CTNND1)
promotor, promoviendo así la progresión tumoral, invasión y metástasis.
Además de CRK sobreexpresión como un proto-oncogén y su papel en la transformación celular, CRK fosforilación también es apto para contribuir a su actividad bioquímica. Como una proteína adaptadora, CRK no contiene un dominio catalítico sin embargo ambas actividades de tirosina y serina quinasa se han asociado con CRK [15]. Las proteínas con tirosina fosforilada, serina o treonina fueron detectables en el inmunoprecipitado de CRK en las células infectadas por el virus del sarcoma aviar (CT10) [15]. En este estudio, el producto del virus CT10 (p47
gag-CRK
) en sí era también altamente fosforilada principalmente en serina y un cinco por ciento de los residuos de tirosina. Varias vías de señalización intracelular contribuyen a la fosforilación CRK. Por ejemplo, c-Abl fosforila Crk en la tirosina 221 provocando la disociación de Crk del sustrato asociado-Crk (CAS) inhibiendo de este modo la migración celular y la promoción de la apoptosis en células normales y malignas [16], [17]. Abl tiene una función crítica en la formación y mantenimiento de las uniones adherentes como se demostró en fibroblastos de embriones de ratón [18], [19]. Este efecto de la Abl en las uniones adherentes parece estar mediado a través de la vía Crk y Rac1 que regulan complejo de adhesión cadherina-catenina. Estos resultados apuntan al hecho de que CRK fosforilación desempeña un papel importante en la promoción de la motilidad celular y la metástasis
En cuanto a la fosforilación de la serina CRK, dos serina /treonina quinasas, [es decir, células progenitoras hematopoyéticas quinasa 1 (HPK1.; MAP4K1) y quinasa homóloga a SPS1 /STE20 (KHS; MAP4K5)], los miembros de PAK serina /treonina quinasa súper familia, son conocidos para mediar la fosforilación de miembros de la familia CRK y posiblemente participar en CRK mediada por la activación de JNK [20], [21] . quinasas activadas por P21 (Paks) son reguladores conocidos de la remodelación del citoesqueleto y la motilidad celular y parece que quinasas PAK juegan un papel en la promoción de metástasis en tumores malignos [22]. Por ejemplo, PAK endógeno se activa constitutivamente en ciertas líneas celulares de cáncer de mama [23] y la expresión ectópica de PAK1 activada constitutivamente en células MCF-7 de carcinoma de mama no metastásico aumento de la motilidad celular [24]. Además, se informó recientemente de la sobreexpresión de PAK1 en el CPNM, sobre todo en la histología de células escamosas [25]. El anteriormente mencionado fuertemente sugieren un papel para la fosforilación de la serina CRK en la promoción de metástasis de tumores malignos. vías bioquímicas que regulan CRK fosforilación de la serina y el papel de la fosforilación de serina CRK en la promoción de la metástasis no están bien estudiados hasta la fecha. Aquí nos proporcionan evidencia de que PAK1 cinasa media la CRK-II serina 41 fosforilación promoviendo así la motilidad celular y la invasión de células de NSCLC.
Resultados
CRK-II serina 41 La fosforilación se correlaciona inversamente con
p120-catenina
Expresión
Nos informó recientemente de que CRK media la represión transcripcional de
p120-catenina (CTNND1) Hoteles en células de NSCLC. CRK puede ser fosforilada en ambas tirosina y serina residuos, que a su vez influye en su interacción con los objetivos de abajo [15], [16], [26], [27]. Por lo tanto, tratamos de investigar más a fondo si el estado de fosforilación CRK, como sustituto de señales ascendentes activados, es la posibilidad de jugar un papel en la CRK mediada por
p120-catenina (CTNND1)
transcripcional represión. Una estrecha correlación de cualquiera de serina o la fosforilación de la tirosina CRK con la expresión de p120-catenina indicaría la presencia de una serina aguas arriba /treonina o una tirosina quinasa que mediar CRK fosforilación de ese modo downregulation p120-catenina. Con este fin, hemos examinado el nivel fosforilada CRK-II tanto en la tirosina 221 y serina 41 y correlacionado con la que los niveles de p120-catenina en un panel de células de NSCLC y BEAS-2B (Figura 1). En el caso de la tirosina 221, se informa de la fosforilación de este residuo por c-Abl para dar lugar a la inhibición de la migración celular. Se observó una correlación inversa entre fosfo-serina 41 CRK-II con la de p120-catenina y E-cadherina niveles de proteína por Western Blot. Curiosamente, la fosforilación de CRK-II en Y221 no se correlacionó con la expresión de p120-catenina. Estos hallazgos sugieren que la señalización de eventos que involucran a serina /treonina quinasas están implicadas en
p120-catenina (CTNND1): perfil transcripcional regulación a la baja a través de la fosforilación de la serina de la proteína adaptadora CRK.
B- La cuantificación de CRK- II, fosfo-tirosina 221 CRK-II y fosfo-serina intensidad de la señal CRK 41-II entre las líneas celulares de cáncer y células BEAS-2B.
CRK-II serina 41 fosforilación Regula
p120- catenina
Expresión
con el fin de evaluar más a fondo el papel de CRK serina 41 fosforilación en la regulación transcripcional de
p120-catenina (CTNND1)
, decidimos examinar si serina CRK-II 41 manipulaciones podrían tener algún efecto sobre el nivel de expresión de p120-catenina. Por lo tanto, se procedió a preparar CRK-II serina 41 phosphodeficient y mutantes phosphomimetic. Una reacción de mutagénesis dirigida a sitio se utilizó para reemplazar CRK-II serina 41 con glicina [Ser41Gly (phosphodeficient)] o ácido aspártico [Ser41Asp (phosphomimetic)]. Una construcción CRK-II fusionado con una etiqueta Myc fue utilizado como la columna vertebral de las dirigidas al sitio reacciones de mutagénesis por lo tanto, todos los mutantes resultantes contenían una etiqueta Myc también. Todas las construcciones se verificaron por secuenciación. Posteriormente, A549, células Rh2 y H157 se transfectaron transitoriamente con los mutantes resultantes CRK-II y que mide la
p120-catenina (CTNND1)
promotor de la actividad, así como el nivel de proteína p120-catenina por el Western Blot en el transfectadas Células. Los niveles de expresión de mutantes CRK-II y la endógeno CRK-II se presentan en la (Figura S1). En comparación con las células que expresan de tipo salvaje CRK-II, un aumento significativo en
p120-catenina (CTNND1)
promotor de la actividad se observó en las células que expresan phosphodeficient CRK-II. Por otra parte, se observó una disminución en
p120-catenina (CTNND1)
la actividad del promotor en las células que expresan phosphomimetic serina CRK-II 41 mutante (Figura 2). nivel de proteína p120-catenina también cambió siguiente expresión de mutantes CRK-II concordantes con los cambios observados en las alteraciones de la actividad promotora
p120-catenina
en todas las líneas celulares. Estos resultados enfatizan más en el papel de CRK serina 41 fosforilación en la regulación transcripcional de
p120-catenina (CTNND1) guía empresas
(prueba t de Student de 2 colas:. * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01; barras de error representan ± desviación estándar). B- transferencias Western muestran los cambios en el nivel de proteína p120-catenina en las líneas celulares antes mencionados después de la transfección transitoria de mutantes CRK-II y CRK-II.
CRK-II serina 41 fosforilación está involucrado en el CPNM La motilidad celular y la invasión celular
a pesar de que se observó CRK-II serina 41 fosforilación se dedica a
p120-catenina (CTNND1)
regulación transcripcional, no está claro si la fosforilación de CRK-II en serina 41 tiene cualquier otra relevancia biológica significativa. Dado que la expresión de CRK se ha asociado con tumores de NSCLC más agresivos [28], decidimos examinar las propiedades móviles e invasivos de células A549 después de la manipulación de CRK-II serina 41 fosforilación. Por lo tanto, se procedió a células A549 preparadas que expresan de forma estable nuestra serina CRK-II 41 mutantes. Las células A549 fueron escogidos para este experimento ya que expresan nivel relativamente bajo de endógena CRK-II. Como se describe en la sección Métodos Material y, las células A549 se transfectaron con CRK-II serina 41 phosphodeficient y mutantes phosphomimetic y se seleccionaron en presencia de G418. Se utilizaron las células seleccionadas agrupados para los ensayos de curación de heridas y la invasión de células posteriores. El nivel de expresión de las proteínas mutantes se verificaron en un ensayo de western blot (Figura S2). A continuación, se utilizaron las células A549 resultantes que expresan de forma estable CRK-II serina 41 y phosphodeficient phosphomimetic mutantes en la cicatrización de heridas y ensayos de invasión de células Matrigel como se explica en la sección Métodos (Figura 3) Material y. Como era de esperar, en comparación con las células A549 que expresan el vector vacío, las células de tipo salvaje que expresa CRK-II mostraron un comportamiento más agresivo. Curiosamente, las células A549 expresan CRK-II phosphodeficient (Ser41Gly) mutante tenían una propiedad menos móviles y cercano al grupo de vector vacío y células que expresan mutante phosphomimetic (Ser41Asp) tuvieron el comportamiento más agresivo en los ensayos de cicatrización de la herida. Hemos hecho callar a los CRK endógena de siRNA en todas las condiciones con el fin de reducir la interferencia de la CRK endógeno con proteínas mutantes CRK-II (Figura S2). El siRNA que se utilizó para silenciar la endógeno CRK fue dirigido contra una secuencia fuera de marco de lectura abierto de CRK por lo tanto este siRNA no tuvo ningún efecto sobre la expresión de mutantes CRK por construcciones de plásmidos. Una visión más amplia de esta herida y la curación de ensayo de las membranas de Matrigel se presentan en las Figuras (S3, S4). Al igual que en los ensayos de curación de la herida, las células A549 que expresan CRK-II serina 41 mutante phosphodeficient tenido menos invasivo en comparación con las células que expresan el vector vacío y células que expresan CRK-II serina 41 mutante phosphomimetic tenía la propiedad más invasiva a las 24 horas. A pesar de que la endógena CRK-II fue silenciado de forma incompleta entre los grupos, la proporción de mutantes CRK-II al endógena CRK-II se incrementó después de silenciar la endógeno CRK. Vale la pena mencionar los siguientes efectos biológicos no se observaron si el CRK endógena no fue silenciado.
Endógeno CRK es silenciada en todas las condiciones de siRNA. B- Medición de la herida área de superficie de 24 horas después del establecimiento de la herida entre los grupos anteriormente mencionados. El promedio se calcula después de la medición de tres experimentos separados. (T-test de Student 2 de cola: ** P & lt; 0,01; *** P & lt; 0,001; barras de error representan ± desviación estándar) Invasión ensayos .C- después de la incubación de las células A549 transfectadas de forma estable que expresan bien pCMV vector; tipo salvaje CRK-II (WT); CRK-II (Ser41Gly) o CRK-II (Ser41Asp) mutantes. 1 × 10
5 células se incubaron durante la noche como se describe en la sección Métodos y se tiñeron a las 24 horas después de la incubación. La medición cuantitativa D de las células invadidas. Se contaron cinco secciones separadas de las células invadidas. (Prueba t de Student de 2 colas: ** P & lt; 0,01; *** p & lt; 0,001; barras de error representan ± desviación estándar) guía empresas
Con el fin de examinar si los cambios en la proliferación celular están contribuyendo a. el comportamiento biológico observado de las líneas celulares con mutantes CRK-II, la tasa de proliferación de las células de las líneas celulares resultantes se midieron (Figura S5). Siguiendo el mismo número de chapado de las células A549 transfectadas con mutantes CRK-II CRK-II y, se contaron las células a intervalos de 24 horas. No hay diferencia significativa en el número de células se observaron entre los grupos. Estas observaciones corroboran la participación de CRK-II serina 41 fosforilación de la motilidad y la invasión de células de NSCLC.
PAK1 cinasa media la CRK-II serina 41 fosforilación
Teniendo en cuenta el papel de la CRK-II serina fosforilación en el
p120-catenina (CTNND1)
transcripcional represión y también la promoción de la motilidad y capacidad de invasión en las células NSCLC, hemos tratado de identificar la quinasa aguas arriba (s) que pueden mediar CRK-II serina 41 fosforilación. fosforilación de la serina CRK ha sido reportado por varios miembros de la familia PAK serina /treonina quinasas [20], [21]. Por ejemplo, progenitoras hematopoyéticas quinasa 1 (HPK1; MAP4K1) y la quinasa homóloga a SPS1 /STE20 (KHS; MAP4K5) son reportados para fosforilar miembros de la familia CRK en residuos de serina. Por lo tanto, decidimos examinar si CRK-II serina 41 fosforilación podría ser mediada por la familia de quinasas PAK. Con este fin, se optó por silenciar PAK1 de siRNA en H157 y células de NSCLC A549 y examinar CRK-II serina 41 fosforilación por el Western Blot. En comparación con las células tratadas con no silenciar siRNA, PAK1 silenciamiento conducir a la reducción drásticamente fosfo-serina 41 CRK-II tanto en H157 y células A549 (Figura 4C). Además, la secuencia de aminoácidos de CRK-II dentro de la vecindad de la serina 41 partidos con las secuencias de consenso de fosforilación PAK1 conocidos [29] (Figura 4D). En particular, la secuencia de aminoácidos SRDS en CRK-II es idéntica a la secuencia de la fosforilación Pak1 en Raf. Estos hallazgos establecer el papel de PAK1 quinasa como una de las quinasas que median CRK-II serina 41 fosforilación.
B- cuantitativa en tiempo real PCR medición de PAK1 y mRNA PAK2 con el fin de determinar la eficiencia de silenciamiento de siRNA. borrones C-Western que muestra la expresión de fosfo-serina 41 CRK-II y p120-catenina siguientes silenciamiento PAK1 mediada por siRNA en células A549 y H157. secuencia consenso de fosforilación Pak1 D- en varios sustratos Pak1. Los residuos que son fosforilados por Pak1 se resaltan en gris. Círculos son los residuos de arginina aguas arriba que son importantes para la fosforilación de destino Pak1.
Suprime
PAK1 quinasa
p120-catenina (CTNND1)
la actividad del promotor y de Expresión Nivel
Teniendo en cuenta la participación de PAK1 quinasa en la mediación de fosforilación CRK-II en la serina 41 y también el papel de CRK-II serina 41 fosforilación en
p120-catenina (CTNND1)
transcripcional represión, nos preguntamos si quinasas PAK están de hecho implicadas en
p120-catenina (CTNND1)
represión. Con el fin de verificar esta noción, silenciamos PAK1 y PAK2 de siRNA y medimos el
p120-catenina (CTNND1)
actividad promotora en un ensayo de luciferasa dual y también medimos el nivel de proteína p120-catenina por el Western Blot (Figura 4 ). Después de siRNA mediada por silenciamiento de PAK1 en las células A549, se observó aumento de más del 100% en la actividad de luciferasa de
p120-catenina (CTNND1)
reportero promotor en comparación con las células transfectadas con no silenciar siRNA (Figura 4A). Por otra parte, se detectó un aumento en el nivel de proteína p120-catenina en H157 y células A549 mediada por siRNA siguiente silenciamiento PAK1 (Figura 4C). No notamos ningún cambio significativo en el
p120-catenina (CTNND1)
actividad promotora siguiente silenciamiento PAK2 mediada por siRNA. Estos datos instituir además una función de PAK1 en la regulación transcripcional de la
p120-catenina (CTNND1)
.
Efectos de PAK1 quinasa en
p120-catenina (CTNND1)
Promotor la actividad está mediada por CRK-II serina 41 fosforilación
para establecer además una relación causal entre PAK1 y la fosforilación CRK-II en la expresión de p120-catenina, decidimos examinar el efecto de PAK1 simultánea y CRK-II serina 41 manipulaciones en el
p120-catenina (CTNND1)
regulación transcripcional. En consecuencia, silenciados PAK1 en células A549 que expresan de forma estable CRK-II serina 41 phosphomimetic y mutantes phosphodeficient (Figura 5). También hemos hecho callar a los CRK endógena de siRNA para reducir las interacciones no deseadas de la CRK endógeno. Como era de esperar, las células A549 que expresan tipo salvaje CRK-II mostraron un incremento en el nivel de
p120-catenina (CTNND1): perfil de la actividad transcripcional silenciamiento siguiente PAK1. Este efecto de PAK1 en
p120-catenina (CTNND1)
actividad transcripcional fue abrogada en las células que expresan cualquiera o phosphomimetic phosphodeficient CRK-II serina 41 mutantes que sugieren que la incapacidad de CRK-II para alterar su estado de fosforilación de la serina 41 (como resultado de mutaciones insertadas) elimina el efecto de PAK1 en
p120-catenina (CTNND1)
transcripción. Estos hallazgos también apoya el papel de CRK-II serina 41 en la fosforilación mediada PAK1
p120-catenina (CTNND1)
regulación transcripcional. Los cambios menores en el
p120-catenina (CTNND1)
la actividad del promotor que se observan en CRK-II serina 41 células mutantes que expresan phosphomimetic (estadísticamente no significativo) podría ser como resultado de la fosforilación CRK-II endógeno alteración siguiente silenciamiento PAK1. Vale la pena mencionar que el silenciamiento mediado por RNAi de la endógena CRK no da como resultado un golpe completo abajo de la endógena CRK-II (Figura S2).
Endógeno CRK es silenciada en todas las condiciones de siRNA. (Prueba t de Student de 2 colas: * P & lt; 0,05; barras de error representan ± desviación estándar) guía empresas
PAK1 quinasa afecta a la motilidad celular y la invasión de células a través CRK-II serina 41 fosforilación
Teniendo en cuenta (i) CRK-II serina 41 fosforilación promueve la motilidad celular y la invasividad y (ii) PAK1 media CRK-II serina 41 fosforilación, nos enfrentamos a él pregunta si PAK1 es, en efecto promueve la motilidad celular y la invasión a través de la fosforilación seine CRK-II. Para responder a esta pregunta hemos examinado la motilidad e invasividad de las células A549 tras manipulaciones simultáneas de PAK1 y CRK-II serina 41 fosforilación (Figura 6). Como era de esperar, se observó una motilidad superior y la invasividad de las células A549 que expresan CRK-II serina 41 mutante phosphomimetic comparación con las células que expresan de tipo salvaje CRK-II. Después de siRNA mediada por silenciamiento de PAK1, las células que expresan de tipo salvaje CRK-II mostraron una disminución de la motilidad e invasividad. Curiosamente, el silenciamiento PAK1 no tenía ningún efecto en la motilidad e invasividad de las células que expresan CRK-II serina 41 mutante phosphomimetic. Al igual que en otros experimentos, la CRK endógena fue silenciada por siRNA en todas las condiciones a fin de reducir la interacción de endógeno CRK con CRK-II mutante phosphomimetic. Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que el efecto PAK1 en la promoción de la motilidad celular y la invasión está mediada a través CRK-II serina 41 fosforilación.
Endógeno CRK es silenciada en todas las condiciones de siRNA. B- Medición de la superficie de la herida 24 horas después de la creación de la herida entre los grupos anteriormente mencionados. El promedio se calcula después de la medición de tres experimentos separados. (T-test de Student 2 de cola: ** P & lt; 0,01; *** P & lt; 0,001; barras de error representan ± desviación estándar). Invasión ensayos C- después de la incubación de las células A549 transfectadas de forma estable que expresan tipo salvaje CRK-II (WT) o mutante CRK-II (Ser41Asp). Cada línea celular fue tratado con PAK1 siRNA o secuencia revueltos siRNA. 1 × 10
5 células se incubaron durante la noche como se describe en la sección Métodos y se tiñeron a las 36 horas después de la incubación. La medición cuantitativa D de las células invadidas. Se contaron cinco secciones separadas de las células invadidas en cada membrana de Matrigel. . (Prueba t de Student de 2 colas: ** P & lt; 0,01; *** p & lt; 0,001; barras de error representan ± desviación estándar) guía empresas
Discusión
comprensión de los eventos de señalización que promover la metástasis en tumores sólidos nos ayudará a fijar el punto de dianas terapéuticas con el fin de intervenir en el proceso de metástasis. La pérdida de adherencias célula-célula en las células epiteliales es una de las primeras etapas de propagación del tumor. Por lo tanto, la pérdida de la integridad de unión adherente y sus miembros (es decir, cadherinas y cateninas) desempeña un papel central en la promoción de la metástasis. Uno de los eventos observados con frecuencia en los tumores de NSCLC es la regulación a la baja de p120-catenina. Desde la represión p120-catenina en el CPNM está mediada transcripcionalmente [11], decidimos investigar más a fondo los eventos de señalización corriente arriba que eventualmente llevarían a la represión transcripcional de
p120-catenina (CTNND1)
. A través del análisis detallado de la
p120-catenina (CTNND1)
promotor, el papel de los factores de transcripción FOXC2 y SP1 en el
p120-catenina (CTNND1)
regulación a la baja fueron reconocidos. Un análisis más detallado de las parejas de unión de SP1 conducirnos identificar el papel de CRK proteína adaptadora en esta vía [12] (Figura 7). Desde CRK recibe información de múltiples vías de señalización, es probable que los oncogenes de aguas arriba que transmiten su respectiva señal a través de CRK tienen un impacto significativo en la regulación por disminución de p120-catenina, la promoción de la motilidad celular /de invasión y la promoción de la metástasis tumoral. Por lo tanto, como un sustituto de señales ascendentes activados, se investigó el estado de fosforilación de CRK-II y notado CRK-II serina 41 fosforilación tiene una correlación inversa con el nivel de expresión p120-catenina en un panel de células de NSCLC. Es de destacar que esta correlación no se observó con la fosforilación de CRK-II en la tirosina 221. Como una proteína adaptadora, CRK no contiene un dominio catalítico sin embargo ambas actividades de tirosina y serina quinasa se han asociado con CRK [15]. Nuestra CRK-II serina 41 manipulación fosforilación datos muestran altera el
p120-catenina (CTNND1)
promotor de la actividad, el nivel de expresión y también la propiedad invasivo de las células de NSCLC.
En cuanto a CRK- I, parece que el aumento de expresión de la oncoproteína CRK-I por sí mismo se correlaciona con la tumorigénesis. Esta observación está en contraste con CRK-II donde fosfo-CRK-II establece una fuerte asociación con la tumorigénesis. Un aumento significativo de la CRK-I oncoproteína nivel y la isoforma fosforilada (CRK-II) se observaron en NSCLC [28]. Del mismo modo, aquí se observa una estrecha correlación inversa entre y CRK-I expresión, así como fosfo-serina 41 CRK-II con la de p120-catenina y E-cadherina en nuestro panel de células de NSCLC (Figura 1).
fosforilación serina CRK no se ha estudiado bien aunque hay informes anecdóticos sobre el papel de la familia PAK de serina /treonina quinasas en CRK serina fosforilación [20], [21]. Aquí mostramos el papel de la cinasa activada por p21 1 (PAK1) en CRK-II serina 41 fosforilación de ese modo regulación a la baja de p120-catenina y también la promoción de la motilidad celular y la invasión de células de NSCLC. PAK familia de quinasas son objetivos de las proteínas de unión a GTP Cdc42 y Rac1 [30] y también están involucrados en la reorganización del citoesqueleto. Participación de quinasas PAK en la promoción de la motilidad celular y la forma de la célula también son bien conocidos [31], [32]. quinasas PAK se clasifican en dos grandes grupos, el grupo I (PAK1-3) y el grupo II (PAK4-6). Esta clasificación se basa principalmente en la presencia de una región autoinhibitory en el grupo I Pak miembros [33]. El papel de PAK del grupo I se demuestra más claramente en la progresión del cáncer como la sobreexpresión PAK1 se ve es de varios tipos de tumores. PAK1 se sobreexpresa en cáncer de mama, de ovario, de pulmón y cáncer de cabeza y cuello [25], [34]. Además, la expresión de PAK1 se informa elevada en la progresión maligna de carcinoma colorrectal humano [35]. Curiosamente, PAK1 también participa en la cicatrización de heridas y la regulación de la inhibición por contacto en las células epiteliales. Después de la expresión de PAK1 activado en las células epiteliales MDCK, se observó una falta de la detención del crecimiento en el cierre de heridas [36]. Aquí, hemos examinado el papel de PAK1 y PAK2 en CRK mediada regulación transcripcional de
p120-catenina (CTNND1)
y sólo se podía identificar PAK1 como regulador de
p120-catenina (CTNND1)
. silenciamiento PAK1 reduce CRK-II serina 41 fosforilación en las células A549 y H157 y mejorado
p120-catenina (CTNND1)
nivel de actividad del promotor y de la proteína en las células NSCLC. Además, el silenciamiento PAK1 reducción de la motilidad celular y la invasión a través de CRK-II serina 41 fosforilación.
PAK1 tiene una serie de objetivos de abajo que regulan la organización de la actina y la polimerización, la proliferación celular y la apoptosis. Por ejemplo, Pak1 interactúa con filamin A y LIM quinasa [24], [37] que inactivan la cofilina proteína desestabilizadora F-actina, lo que lleva a la agregación de las fibras de actina F [38]. Además de regular el citoesqueleto, PAK1 tiene un papel importante en la regulación de la activación de vías de señalización de MAPK. Pak1 activa directamente Raf-1, mediante la fosforilación de la serina 338 [39] Además Pak1 activa directamente MEK1, la fosforilación de la serina 298 [40]. Aparte de la activación de la MAPK ERK, PAK1 sobreexpresa ha informado para activar MAPKs p38 [41], [42] aunque los detalles de esta interacción no se conocen bien. PAK1 también parece estar asociado con la actividad de JNK. La sobreexpresión de Pak1 por diferentes investigadores ha producido diferentes informes que indican tanto una mayor [44], [45] la actividad de JNK [30], [41], [43] y deficientes. Además, PAK1 se ha informado de que un miembro de una red de señalización anti-apoptóticas a través de sus interacciones con mal [46], [47], [48], [49]. Los datos proporcionados aquí introducen CRK-II como otro blanco de abajo PAK1. Teniendo en cuenta CRK-II serina 41 es parte de una secuencia de fosforilación PAK1 consenso (Figura 4D), es probable que PAK1 fosforila directamente CRK-II en la serina 41.
En resumen, estos datos describen uno de los metastásico promover vías en las células NSCLC que implican la quinasa PAK1, CRK-II, SP1 y p120-catenina. En otras palabras, CRK-II fosforilación parece desempeñar un papel en la transmisión de señales corriente abajo de PAK1. En conjunción con otro informe que pone de relieve la sobreexpresión PAK1 de células escamosas de NSCLC [25], [46], parece que la inhibición PAK1 podría proporcionar una estrategia viable con el fin de interrumpir el comportamiento pro-metastásico de determinados subtipos de NSCLC.
Materiales y Métodos
cultivos celulares
A549, H157, Rh2 y células H358 fueron rutinariamente cultivadas en RPMI suplementado con antibióticos y inactivado por calor 10% de FBS (Omega Scientific, Tarzana, CA). Inmortalizadas células epiteliales humanas normales (BEAS-2B) se cultivaron en medio suplementado con BEBM todos los aditivos (Lonza /Clonetics Corporation, Suiza; Nº de catálogo CC-3170).
Medición de la Actividad p120ctn Promotor de luciferasa Dual ensayo
p120ctn
construcción de promotor se transfectó en líneas celulares de cáncer de Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Veinticuatro horas después de la transfección las células se lavaron con PBS y se lisaron usando un Branson Sonifier en tampón 1x pasiva de lisis (Promega) a temperatura ambiente (RT). expresión del gen indicador se evaluó utilizando el kit Dual-Luciferase Reporter sistema de ensayo (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante en un 20 TD-/20 luminómetro (Turner Biosystems, Sunnyvale, CA). Hemos normalizado para la eficiencia de transfección transitoria (es decir la actividad de luciferasa de luciérnaga) por co-transfección de un
Renilla luciferasa
expresando vector control (pRL-SV40). Todos los experimentos se realizaron por triplicado y se presentaron como media ± desviación estándar (SD), y cada experimento se llevó a cabo al menos dos veces.
siRNA mediada por silenciamiento génico
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CRK:. CUGCUUACCCUGAUUUAUUdtdt 5'-3 '5'
AAUAAAUCAGGGUAAGCAUdtdt-3 '
PAK1 : 5'-GAAAGAGCGGCCAGAGAUUdtdt-3 '5'
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PAK2:.. 5' GGAUUUCUUAAAUCGAUGUdtdt-3 '5'
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