Extracto
en tres dimensiones (3D)
Los ensayos basados en células in vitro
en para el cáncer de próstata investigación (CP) se están convirtiendo rápidamente en la alternativa preferida a la de cultivos en monocapa 2D convencionales. Los ensayos 3D imitan con mayor precisión el microambiente encontrados
in vivo
, y por lo tanto son ideales para evaluar compuestos y su idoneidad para la progresión en el descubrimiento de nuevas medicinas. Para lograr el alto rendimiento deseado es necesario para la mayoría de los programas de cribado, se requiere la cuantificación automatizada de las culturas 3D. Con este fin, este documento informa sobre el desarrollo de un módulo de análisis de prototipo para un sistema (HCA), que posibilite la investigación precisa y rápida de
modelos de cultivo celular in vitro
3D para CaP de alto contenido-análisis automatizado . El programa basado en Java, que hemos denominado PCaAnalyser, utiliza nuevos algoritmos que permiten la cuantificación precisa y rápida de la expresión de proteínas en cultivo de células 3D. En su configuración actual, el PCaAnalyser puede cuantificar una serie de parámetros biológicos, incluyendo: núcleos de recuento, predicción de miembros núcleos-esferoide, varios de clasificación basados en función de las zonas periféricas y no periféricos para medir la expresión de biomarcadores y proteínas constituyentes conocidos por estar asociados con CaP progresión, así como la definición de segregar celulares-objetos con eficacia para una gama de relaciones de señal a ruido. Además, la arquitectura PCaAnalyser es altamente flexible, que opera como un solo análisis independiente, así como en el modo por lotes; esencial para el Alto Rendimiento-Screening (HTS). Utilizando el PCaAnalyser, un análisis preciso y rápido de una manera de alto rendimiento automatizado se proporciona, y el análisis reproducible de la distribución y la intensidad de los marcadores bien establecidos asociados con la progresión de CaP en una gama de metastásicas de líneas de células de CaP (DU145 y PC3) en una modelo 3D demostró
Visto:. Hoque MT, Windus LCE, Lovitt CJ, Avery VM (2013) PCaAnalyser: Una imagen 2D-módulo basado en el análisis para la determinación efectiva de cáncer de próstata en progresión Cultura 3D. PLoS ONE 8 (11): e79865. doi: 10.1371 /journal.pone.0079865
Editor: Gajendra P. S. Raghava, CSIR-Instituto de Tecnología Microbiana, India
Recibido: 24 Marzo, 2013; Aceptado: September 26, 2013; Publicado: noviembre 20, 2013
Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitir, modificar, construir, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la advocación de dominio público Creative Commons CC0
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una beca de la Fundación de Cáncer de Próstata de Australia concedida a VMA. TH reconoce la Junta de Regentes de Louisiana a través del Fondo de Apoyo a la Junta de Regentes, LEQSF (período 2013-16) -RD-A-19 parcialmente para la preparación del manuscrito final. CJL fue apoyado por un Premio de Australia de Postgrado. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (CaP) tiene la mayor prevalencia de cáncer en Australia, con cerca de 20.000 casos nuevos diagnosticados cada año [1]. En el inicio del CP, el tratamiento consiste en la ablación de andrógenos, lo que ralentiza la progresión temporal, sin embargo recurrencia del cáncer en una forma independiente de los andrógenos es común [2]. En esta etapa, el CaP ya no puede ser controlado por las terapias estándar, se produce la metástasis, que es la principal causa de mortalidad. Por lo tanto, se requieren nuevas terapias para combatir la enfermedad antes de la progresión metastásica.
La importancia de utilizar modelos 3D en la evaluación del desarrollo de tumores ha sido descrito previamente [3], [4]. Nosotros, y otros, hemos demostrado que las culturas 3D ofrecen una mejor plataforma para el estudio de las masas tumorales sólidas como las células tumorales en este microambiente perciben aquellos perfiles antigénicos y comportamiento fenotípico que imitan con mayor precisión las células tumorales que se encuentran
in vivo
[ ,,,0],3], [4]. cultivo de células 3D permite la interacción sutil de las células de los mismos o diferentes orígenes dentro de una matriz, imitando célula-célula y las interacciones célula-matriz similares a los encontrados
in vivo
. Por otra parte, la alineación correcta y la organización espacial en 3D es esencial para la progresión del tumor [5]. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que las culturas 3D pueden servir como un modelo más biológicamente relevantes en el descubrimiento de nuevas medicinas.
Alteraciones
perfiles antigénicos de los tumores extirpados de pacientes con CaP avanzadas se han identificado en la expresión de numerosas proteínas. De éstos, el receptor de andrógenos (AR) [6], α6 [7], [8] y beta 1 integrina subunidades [9], y, más recientemente, los receptores de quimiocinas CXCR4 [10] expresión se han relacionado con mayor grado de Gleason y la diseminación metastásica en CaP. tumores de pacientes muestran consistentemente una regulación de la subunidad β1 integrina [11] y el receptor de quimiocinas CXCR4 [12], acompañada de una redistribución y regulación a la baja de α6 integrina [7], [8].
Fuertemente implicada en el hueso CaP metástasis desarrollo y la progresión es la integrina β1 subunidad [13] - [15]. Expresión de α5β1 y α2β1 en células de CaP se ha informado para facilitar la interacción con las células estromales de la médula [15] y para promover activamente la invasión y la adherencia de células de CaP al estroma de la médula
in vitro
[14] y metástasis óseas experimentales en
in vivo
[13]. Del mismo modo la α6β1 integrina de unión a laminina-se ha demostrado para permitir la extravasación de células de CaP humanos de la circulación a la estroma de la médula
in vivo
[16] - [18].
Del mismo modo, los estudios han indicado que la quimiocina, CXCL12, desempeña un papel en el tráfico de células de CaP en el hueso. CXCL12 se expresa por las células del estroma en los órganos diana de CaP metástasis (hueso, cerebro, linfa), pero no en otros tejidos [19] y su receptor, CXCR4, es altamente expresado por células de CaP metastásicas óseas [20], [21]. Era el objetivo de este estudio para evaluar y analizar los patrones de expresión y la distribución de estos marcadores bien establecidos asociados con la progresión de CaP, utilizando un modelo 3D junto con el análisis de imágenes de alto rendimiento.
Otra proteína de gran influencia que contribuye al desarrollo del CaP es la AR [6]. El AR pertenece a una superfamilia de receptores nucleares y media la acción de los andrógenos, tales como 5-α-dihidrotestosterona (DHT). La AR y sus ligandos activadores juegan un papel importante en la progresión del CaP por la mediación de las respuestas de los andrógenos y la activación de la transcripción de genes. Aunque muchos de los efectos bien caracterizados de AR en células de CaP son dependientes de los efectos genómicos que implican la transcripción de genes diana, los efectos no genómicos de los andrógenos también influyen en el comportamiento celular. Estos incluyen la activación de cascadas de quinasas y reorganización del citoesqueleto que pueden estimular la motilidad celular [22] - [24]
Anteriormente, hemos informado de que las células metastásicas CaP PC3 re-expresan AR no transcripcionalmente activa incluida en el. parte mediada por la vía de Src [4]. Utilizando un modelo 3D en conjunto con el análisis de imágenes de alto rendimiento, que era un objetivo adicional del presente escrito para evaluar el potencial relevancia funcional de AR endógenos sobre regulación en esta línea celular y cómo puede afectar a otros componentes importantes de proteínas conocidas para mediar CaP incluyendo la progresión de la integrina β1
.
La capacidad de analizar con precisión varios parámetros de imagen obtenidos del cultivo de células en 3D hasta la fecha es dependiente de programas altamente especializados que son de ninguna manera automatizada. El software de imágenes existente sufre en gran parte de los problemas inherentes a la incapacidad de adaptarse y adaptarse a las cambiantes necesidades de manera efectiva con rapidez [25]. Aquí, hemos desarrollado un software basado en análisis de imagen automatizado llamado "PCaAnalyser" que es capaz de analizar una serie de parámetros medidos en el cultivo de células en 3D a partir de imágenes 2D.
PCaAnalyser se ha desarrollado como un ImageJ [26 ] - [28] plugin, por lo tanto, tiene la capacidad de compartir y mejorar varias funciones básicas proporcionadas en ImageJ. El análisis realizado por PCaAnalyser es una composición de dos grandes interfaces algorítmicos. En el primer paso, se detecta el límite del esferoide 3D celular y se generan las máscaras requeridas. En el segundo paso, los núcleos son detectados y esferoidal de miembro son entonces predijo a partir de las máscaras y los límites. Enfoques similares se siguen para detectar y estudiar las zonas citoplasmáticos por clases de ruido crítico.
El paradigma de PCaAnalyser, incluyendo el componente de informes, ha sido diseñado para ser flexible para permitir al usuario manipular fácilmente los análisis correspondientes en una variedad de formas, además de las opciones por defecto.
con respecto a la eficiencia de PCaAnalyser, hemos incorporado un algoritmo basado candidato-miembros para acelerar el proceso de detección de núcleo-esferoide, haciendo que el tiempo de procesamiento global considerablemente más rápido. Tiempo de análisis de complejidad se ha proporcionado en este artículo, para ayudar en la estimación del tiempo de procesamiento, que se basa en la ficha parámetros disponibles, como el número de esferoides por imagen, el número de núcleos por esferoide y el perímetro del núcleo. Esta característica también proporciona una base para la comparación de la PCaAnalyser con otros algoritmos publicados.
En el presente estudio, se utilizó un Perkin Elmer Opera ™ [29], un sistema de imagen confocal de alto rendimiento, para generar la salida de un modelo de cultivo celular CaP 3D en formato de placa de microtitulación adecuado para HTS. La reconstrucción completa de los esferoides en 3D era la memoria y requiere mucho tiempo, por lo que la adquisición de imágenes 2D de los objetos en 3D, a lo largo del
xy
un plano, se aplicó como una alternativa. En esta población de esferoides, la 2D-imagen de la objetos 3D variada en la resolución y nitidez de imagen debido a los diferentes planos focales, por lo tanto profundidades físicos, así como la composición de los diferentes componentes celulares de los objetos en 3D, que en conjunto hicieron segmentación y detección desafiante. Detección de varios objetos co-localizados y de múltiples contextuales dentro del mismo canal-imagen también plantea desafíos significativos. PCaAnalyser ha sido diseñado para hacer frente con éxito a estos desafíos. Por lo tanto, la PCaAnalyser presentado aquí proporciona un recurso valioso para las investigaciones utilizando modelos 3D basados en células, en particular para su uso en sistemas automatizados de alto rendimiento.
Gracias a la utilización PCaAnalyser, informamos aquí el análisis con éxito de la distribución e intensidad de bienestar marcadores establecidos asociados con la progresión de CaP en una gama de líneas de células de CaP metastásico (DU145 y PC3) en un modelo 3D. Específicamente, hemos demostrado que, en respuesta al ligando, SDF-1α, distribución y expresión CXCR4 cambió, indicativo de un receptor funcional. Por otra parte, presentamos aquí nuevos datos relativos a la baja regulación de la integrina β1 después del tratamiento con DHT. Estos resultados sugieren que en células PC3, AR no transcripcionalmente activa puede mediar otras proteínas importantes asociados con la progresión de CaP. Estos resultados han implicaciones de largo alcance con respecto a la terapéutica dirigida AR en la fase final del tratamiento CaP.
Materiales y Métodos
1. Líneas celulares de cáncer
El DU145, PC3 y líneas de células MDA-MB-231 fueron adquiridos de
American Tissue Culture Centre gratis (ATCC). Las líneas celulares de CaP Du145 y PC3, se mantuvieron en RPMI-1640 (Invitrogen), complementado con 10% de suero fetal bovino (FBS, Gibco). El cáncer de mama (BCA) de la línea celular MDA-MB-231 se mantuvo en DMEM-F12 (Invitrogen), complementado con 10% de FBS. Todas las células se propagan a 37 ° C en condiciones estándar de cultivo celular (5% CO
2, 37 ° C) en frascos T75. El medio se repone cada 3 días. Una vez que las células habían alcanzado una confluencia del 80-90% que se volvieron a sembrar (1/10) en matraces T75. Después de 10-12 pasajes, se interrumpieron las células.
2. Cultivos Celulares miniaturizado 3D
En las líneas celulares de CaP, las células se sembraron en la parte superior de un lecho de gel de matriz 3D (Matrigel: BD Bioscience) en placas de 96 pocillos con fondo de cristal (matricial: PerkinElmer). Para los cultivos 3D miniaturizados, los pocillos se llenaron con 60 l medio Matrigel ™ /cultivo (70%) y polimerizar a 37 ° C con 5% de CO
2 durante 1 hora. Las células fueron sembradas a ~5000 células por pocillo y se mantuvieron como se describe anteriormente arriba. Medios fue cuidadosamente eliminado y se repone cada tres días. Los cultivos se mantuvieron durante un máximo de 12 días. Para la línea celular BCa MDA-MB-231, 1.000 células por pocillo se sembraron en la parte superior de 15 l de factor de crecimiento reducido Matrigel (TFG Matrigel) en una placa de 384 pocillos CellCarrier (PerkinElmer).
3. Ligando y tratamiento de drogas Ensayos
El uso de un 96 pocillos células PC3 formato de placa se hicieron crecer en cultivos 3D de Matrigel como se describe anteriormente. Después de 9 días en cultivo, las células 3D fueron tratados con un andrógeno natural de dihidrotestosterona (DHT, Sigma-Aldrich) durante 30 horas en medio libre de suero a las 0, 1, 5 y 10 concentraciones nM. Alternativamente, los cultivos fueron 3D privaron de suero durante 16 horas y después se trató con un ligando de CXCR4: SDF-1α: (30 ng /ml, R & amp; D Systems) para 0, 20 y 40 minutos. Las células fueron fijadas y procesadas para inmunocitoquímica.
En el caso de MDA-MB-231, las células se incubaron durante 3 días antes de la aplicación de 720 nM de doxorubicina (Sigma-Aldrich) durante 72 hrs. Para ver el núcleo de estas células se aplicó Hoechst (1:500, Invitrogen) durante 2 horas antes de emprender imágenes de células vivas. Doxorrubicina emite fluorescencia endógena (excitación de longitud de onda de 480 nm, longitud de onda de emisión de 530 nm).
4. La inmunohistoquímica
El ensayo basado en la imagen se llevó a cabo como se describe anteriormente [4], con modificaciones menores. En pocas palabras, después de 10 días en cultivo, los cultivos 3D de células de CaP DU145 se lavaron con PBS y se fijaron con PFA (4%, 10 minutos para 2D, 20 minutos para el 3D), se lavaron dos veces con PBS y se bloquearon durante 2 horas con 2% de BSA , 0,1% de Triton-X, 0,05% de TWEEN. Los anticuerpos primarios de ratón anti-a6 y anti-beta 1 integrina subunidades (5 mg /ml, R & amp; D Systems) o el ratón anti-CXCR4 (5 mg /ml, R & amp; D Systems) se añadió entonces durante 24 horas a 4 ° C en tampón de bloqueo. Las células se lavaron con PBS (3 x 5 minutos) y se incubaron a temperatura ambiente (RT) durante 4 horas con anticuerpos secundarios (5 mg /ml 488 de cabra anti-ratón) y Hoechst nuclear (1/1000, Invitrogen).
5. Adquisición de Imagen
Todas las células fijadas fueron imágenes utilizando el procesador de imágenes de la célula PerkinElmer Opera ™ Cuádruple excitación de alta sensibilidad confocal con PerkinElmer 20 /.75 iris del agua. Las imágenes fueron adquiridas mediante el espectro de emisión de 488 y 405. imágenes de células vivas se completó utilizando la PerkinElmer Opera utilizando el objetivo 10x aire con la excitación por los 405 y 561 nm láseres. Las imágenes obtenidas se utilizaron como entrada para el software PCaAnalyser para el estudio de análisis descrito en el presente documento.
Resultados
1. Información de canal y Desafíos
En este ejemplo, se investigaron imágenes a través de dos canales fluorescentes: (1) Ch-1, para detectar el núcleo (Hoerchst: emisión 405) y (2) Ch-2, para detectar la la expresión de la proteína de interés, (CXCR4, αb o subunidades beta 1 integrina) y la distribución
.
Ch-1 se utiliza para identificar (a) el núcleo, y (b) la superficie del esferoide. Para la extracción de la información relativa a cualquiera de los dos el núcleo y /o el área del esferoide las imágenes de este canal se trataron como imágenes de campo brillante, que permiten dos contextos diferentes de la imagen que se extraen de la misma señal.
el contenido de la imagen tiene su propia complejidad, así: a pesar de que un sistema de imagen confocal se emplea, los esferoides tienen una estructura 3D que incorpora profundidad y variación, resultando en una iluminación irregular del plano focal. esferoides 3D se cultivan en un gel semi-sólido, y como tal se sientan en una multitud de diferentes z planos. Por lo tanto, hay un número relativamente pequeño de células que son imágenes en el foco dentro de ese plano focal. Estas imágenes se componen de una combinación de ambas estructuras bien definidas y mal definidos y componentes borrosas mal definidos, proporcionando así un reto considerable para detectar con precisión el núcleo de cada célula. Esto se hace aún más problemático cuando se utiliza el análisis automatizado, ya que estas señales se integran con frecuencia en la salida final o intensidad. Por lo tanto, se requería un mayor control sobre los niveles de umbral y la capacidad para filtrar parámetros dentro del software para obtener datos representativos precisos.
Ch-2 proporciona las imágenes que definen la membrana celular y el citoplasma de las células individuales de la masa esferoidal. Las imágenes obtenidas a través de este canal tienen una baja relación señal-ruido (SNR). Los desafíos con estas imágenes específicas son: (a) al segmento, identificar y leer la zona de intensidad baja o nula junto con el área de mayor intensidad del citoplasma, (b) desarrollar y definir las funciones adecuadas para clasificar las diversas regiones del citoplasma, y ( c) para evitar el ruido. La tinción de inmunofluorescencia cualquier etiqueta dada tiene con ella una gama de valores de SNR. manchas nucleares (Ch-1 imágenes) se miden generalmente en el intervalo del espectro de la longitud de onda 405 nm, que en comparación con el 488 nm (verde) o espectros de 594 nm (rojo), son manchas altamente permeables. Por lo tanto, Ch-1 imágenes tienen menos ruido en comparación con los obtenidos con Ch-2. Además, el sistema Opera ™ es un reproductor de imágenes confocal automatizado de alto rendimiento, por lo que los parámetros variables no podrían establecerse para imágenes individuales, por lo tanto un ajuste en particular a veces funciona mejor de 6 a 10 imágenes, pero no para el resto. Por lo tanto, nuestro software ha sido adaptado para responder a estos problemas, así como para reducir el ruido no deseado.
2. Análisis de la Imagen
Nuestra PCaAnalyser fue desarrollado como un plug-in de ImageJ [26] - [28], que proporciona un entorno excelente para la personalización, así como un fácil acceso a muchos diferentes imagen a formatos de archivos debido al plug-in del lugar y de la biblioteca Bio-formatos de Java [30], [31]. Una versión comprimida de los archivos asociados FLEX se ha generado, que es el formato de archivos de imagen primaria se obtienen. FLEX archivo es el archivo de formato predeterminado generado por el sistema de PerkinElmer Opera ™ que hemos utilizado para capturar las imágenes en bruto. Estos son compatibles con MBF_ImageJ [32] (versión de ImageJ) a través de soportes extendidos de loci Bio-formatos (http://loci.wisc.edu/bio-formats/imagej).
Además, una organización independiente FLEX convertidor de TIFF fue desarrollado para proporcionar imágenes en un formato más genérico. Muchos parámetros en el
GenericDialog Red de ImageJ tenían que ser acomodados para lograrlo. Por desgracia,
GenericDialog
estaba limitado en el manejo de más de unos pocos parámetros, por lo que era necesario combinar más ImageJ y NetBean (versión 6.8) [33] para desarrollar una personalizada con pestañas acristalamiento de diálogo (Figura 1) para PCaAnalyser . Este acristalamiento con pestañas de diálogo está acomodando fácil y eficientemente casi 30 parámetros de diferente tipo. El corazón del software es
ParticleAnalyzer En venta ImageJ [26] - [28]; Sin embargo hemos ampliado aún más para ser utilizado en
lotes en modo
para complementar el
monomodo
opción. ImageJ se ha actualizado en consecuencia y por lo tanto utilizar nuestro PCaAnalyser como mínimo, la versión 1.44d ImageJ se requiere.
Una de las cinco secciones con pestañas relacionadas con la 'máscara generación' es visible.
en general, los algoritmos de PCaAnalyser se pueden dividir en las siguientes secuencias:
i
) de detección de esferoide y la máscara de la generación global,
ii
) núcleo y de miembros de detección,
iii
) la detección y el citoplasma leer y
iv
) la presentación de informes.
2.1 detección del esferoide y Máscara Generación
CH-1 tiene la imagen de los núcleos, agrupados por esferoide . Ch-1 a segmento se procesa para detectar la zona esferoide completa y los límites, lo que permite la formación de la frontera-máscara utilizando el algoritmo 1 (Figura 2) y los correspondientes pasos principales se muestran en la Figura 3. El límite-máscara se utiliza para el procesamiento imágenes de Ch-2 para: (a) la eliminación de ruido y (b) para leer intensidades de las zonas de citoplasma y la membrana, que van de cero a valores altos. Ch-2 tiene intensidades muy irregulares, incluyendo valores tan bajos como cero para la membrana y el área citoplasma del esferoide, y también incluye muchos de mayor intensidad y menores niveles de SNR. Por lo tanto, Ch-2 no se puede utilizar para la detección de límites del esferoide de forma fiable.
pasos principales del algoritmo de detección de esferoide. Las variables con valores de muestra se colocan dentro de los paréntesis angulares (es decir, & lt; ... & gt;).
Los pasos principales para la detección de esferoides se ilustran
Durante el procesamiento de Ch. -1, dificultades asociadas con las señales resultantes de iluminación desigual son experimentados. Uso de la sustracción de fondo con un radio apropiado de la implantación de bola algoritmo, hemos sido capaces de eliminar esta imagen artefacto relacionado. Suponiendo, la altura como una tercera dimensión en una superficie 2D una imagen de fondo de, proporciona el pixel intensidad proporcional de esa imagen. Con el propósito de tener un fondo liso, el algoritmo de rodadura de bola puede asumir una bola de radio elegido se enrolla sobre la superficie 2D y el casco del volumen alcanzado por la bola es el fondo smoothened esperado. Con el fin de lograr esto, primero el esferoide-límite se detectó mediante la mejora el contraste considerablemente (6 veces) para separar las señales de baja del fondo. En el siguiente paso, se proporcionaron dos maneras posibles para que el usuario proceda: (a) automático o (b) manual para identificar el contorno adecuado en función de la profundidad de la señal original gradiente de objetos 3D y otros parámetros morfológicos, tales como la circularidad y el tamaño (área). Opciones para convertir las imágenes en niveles de bits más bajas también fueron proporcionados, lo que ayuda a separar el fragmento no deseado en la imagen resultante de iluminación desigual causada por la configuración experimental.
Con los parámetros pre-procesados y proporcionados, el ParticleAnalyzer fue desplegada para detectar los esferoides - el algoritmo se aplicó a aproximadamente 1000 imágenes y la detección resultante se lleva a cabo con más de un 90% de precisión, en comparación con el análisis de microscopía manual y programas de reconocimiento de objetos simples. Por imagen, había generalmente 10 esferoides en promedio
2.2 Núcleo y detección de miembro
La señal de Ch-1 se utilizó para la detección de núcleo.; sin embargo, la imagen que corresponde tenía una iluminación irregular que impactó en la eficiencia del programa de análisis (ver "imagen original" en la Figura 3). Por lo tanto, era necesario para construir e incorporar al menos 10 parámetros adicionales para permitir núcleo-detección precisa y fiable. El algoritmo de detección de núcleo final (algoritmo 2) se ha desarrollado se indica en detalle en la figura 4.
Los principales pasos que se requieren para el algoritmo de detección de núcleo. Las variables con valores de muestra se colocan dentro de los paréntesis angulares (es decir, & lt; ... & gt;).
El núcleo-imagen, disponible en Ch-1 también se ha utilizado para la detección de esferoides. Como se muestra en el algoritmo 2, en el primer caso, se utilizó la sustracción del fondo para disminuir iluminación desigual, y después la resolución de imagen se afilada (paso 3). Dentro de una imagen dada, no se encontró que todos los núcleos para tener la misma altura a lo largo del eje z, dando como resultado en algunos de ellos quede fuera de foco, ya que residían en un plano focal alternativa dentro del esferoide 3D. Aplicando el módulo de "mejora de la nitidez" (función ImageJ), hemos sido capaces de reducir el número de píxeles y por lo tanto mejorar la detección de la señal dada. También se aplica el módulo 'operación suave' (función ImageJ) para evitar el tipo de límite de detección no lisa o en zigzag del núcleo. a continuación, se aplicó un umbral algoritmo adecuado (paso 5) para la segmentación y la detección del núcleo. Además, se aplicó el filtro morfológico para filtrar el ruido no deseado. Los pasos de este análisis se muestran en la Figura 5.
Los pasos críticos implicados en el núcleo de detección, además de llevar a cabo la tarea de la superposición de los límites correspondientes esferoide generados anteriormente.
Además de los pasos más importantes en la detección de esferoide pertenencia a un núcleo cualitativamente (Figura 5), a la vez que hemos detectado cuantitativamente el número de miembros. Para ello, hemos desarrollado y desplegado Algoritmo 3 (Figura 6). Para llevar a cabo el candidato-cheque en el Algoritmo 3, se empleó el método bounder-cuadro para detectar si el objeto Y es posiblemente el interior de objeto X o no (Figura 7).
Los pasos principales en la detección de esferoide-pertenencia a una se muestran núcleo.
para realizar el candidato de la verificación en el Algoritmo 3 para detectar principalmente si el objeto y es posiblemente el interior de objeto X o no, utilizando el enfoque bounder-caja. En el caso de (A), objeto Y está dentro de objeto X, por lo tanto, al menos una esquina de la bounder-box de Y debe estar dentro de la bounder-box de X. Sin embargo, incluso si cualquiera de las esquinas de la bounder -box de y es dentro de X, y en realidad no puede estar dentro de X, como por ejemplo, el caso (B).
2.3 Detección y medición de intensidades de membrana y citoplasma Áreas
la información disponible a través de Ch-2 se espera que tenga diferentes niveles de intensidad (señales) alrededor de la membrana y el área citoplasmática de la esferoide. áreas relevantes fueron segmentados mediante la generación de la frontera-máscara del esferoide en los pasos anteriores (sección 2.1). Esto nos ha permitido leer de forma fiable la intensidad más baja de la zona de no-fondo y evitar las zonas ruidosas.
Un objetivo fue analizar las células basado no sólo en las intensidades medias, sino también en la distribución de las proteínas dadas. Determinar si la expresión de proteínas residen principalmente en las uniones célula-célula, o en el citoplasma, ayudará a confirmar tanto los niveles de expresión basales en células cancerosas y no cancerosas, y hasta qué punto los tratamientos a cierta tener en la expresión de la proteína. El algoritmo que participan en la medición de intensidades y clasificación de distribución de la intensidad ofrece 4 combinaciones posibles principales (Figura 8) que permiten un grado de libertad para estudiar varios patrones de distribución de intensidad, especialmente importantes para la clasificación de zona periférica y no periférica. Definimos la segregación de las áreas de forma automatizada y reproducible de cuatro maneras posibles. Se les describe como:.
La medición de intensidades y clasificación de la distribución de intensidad
i) Definir ancho fijo de límites y un área definida por el límite-máscara. Esta combinación leerá toda el área dentro de la máscara y clasificará el área medida en dos áreas distintas: 'periférica de la zona' de anchura
x
(variables) píxeles dentro de los límites y la zona periférica no queda (Figura 9).
los principales pasos involucrados en la generación del mapa-leer clasificado.
ii) Definir ancho fijo de frontera y la zona común de la máscara y el umbral por encima. Estas combinaciones son similares a la opción mencionada, que es
Número de CD - (
i
), pero en lugar de leer toda la zona dentro de la máscara, se tendrá en cuenta esas intensidades que están por encima el umbral del valor asignado. Los principales pasos se muestran en la Figura 10. El umbral se puede asignar automáticamente así como manualmente el cuadro de diálogo mostrado en la figura 11. También es posible comprobar el efecto visual. Un diálogo similar está disponible en ImageJ, sin embargo la versión ImageJ del cuadro de diálogo se limita al pasar los valores de umbral seleccionado para los plug-ins personalizados de PCaAnalyser. Por lo tanto, hemos desarrollado un diálogo similar pero extendida (Figura 11) para PCaAnalyser.
Los principales pasos involucrados en la generación del mapa-leer clasificada a través de límites-máscara y el umbral de máscara. Imágenes muestran un esferoide DU145 cultivadas en una matriz 3D de seguimiento de inmuno-etiquetado para la subunidad α6 integrina. Los paneles de esta figura se refieren a la intensidad del anticuerpo y la distribución de la subunidad α6 integrina. Etiquetado estaba presente principalmente en la región periférica de la estructura de esferoide.
iii) la anchura proporcional del centro del esferoide (objeto) por un factor y (donde,) y el área definida por la frontera-máscara. A diferencia de la anchura fija, esta opción determina primero el centro del objeto y luego se aplica anchura proporcional a clasificar un píxel en función de si pertenece a periférica o a la zona de no periférica. El proceso se muestra en la Figura 12A.
A) Pasos implicados en procesamiento de mapa de leer las clasificaciones con las opciones establecidas para la anchura proporcional y el límite-máscara. Imágenes muestran un esferoide DU145 en una matriz 3D de seguimiento de inmuno-etiquetado para la subunidad β1 integrina. Los paneles de esta figura se refieren a la intensidad del anticuerpo y la distribución de la subunidad de integrina β1. La distribución de β1 se mantuvo principalmente en torno a la región de la membrana externa /periférica del esferoide. B) La imagen original de la Solicitud de PCaAnalyser la utilización de las funciones de grupo-DU145 romper esferoide B '), después de aumento de la señal del software encontró señales que no son cero en esferoides entre las dos masas y como lo detectó como una sola esferoide.
el periférico contra la función no periférica (Figura. 12A) fue particularmente útil para investigar el receptor de quimioquinas, CXCR4, la expresión y distribución en respuesta a ligando tratamiento. Nuestro objetivo fue evaluar si había diferencias en la expresión tanto en la ausencia y presencia de su ligando, SDF-1α. En ausencia de SDF1α, la proteína CXCR4 solamente se expresó en las regiones periféricas de los esferoides. Después del tratamiento, sin embargo, los cambios de expresión de CXCR4 y migra más lejos en el centro del esferoide y se encontró dentro de las regiones no periféricos. Por lo tanto, este análisis permite la validación en cuanto a si o no una proteína es funcional en el sistema modelo de cultivo celular en 3D, o no.
iv) anchura proporcional del centro del esferoide (objeto) por un factor y (donde ,) y el área definida por el límite-máscara y el umbral de máscara. Esto es lo mismo que la combinación previa inmediata (
Número de CD - (
iii
)), con la excepción de que la lectura de mapa excluye aquellos píxeles que están por debajo del valor (superior) de la asignado umbral de máscara.
visualmente, la imagen representada en la figura 12A, posiblemente, podría ser visto como dos esferoides separadas en las proximidades de uno al otro. Sin embargo, se sabe que el paso del tiempo en la cultura, los esferoides pueden combinar y fusionar entre sí para formar grandes masas [3]. Por consiguiente, era imperativo para formular un proceso que podría verificar una sola vs objeto fusionado. Esto lo logramos a través de una característica llamada candidato "falsa grupo-ruptura". Esta característica ayuda a que el software de PCaAnalyser para determinar si esferoides están realmente conectados o no. El falso de grupo-rotura es difícil de detectar visualmente, sin embargo, el PCaAnalyser resuelve este problema mediante la amplificación de la señal de definir más claramente la situación en la que existe una señal baja (es decir, falsa grupo innovador candidato) frente existe ninguna señal (es decir, la verdadera clump- candidato de última hora). El principio es que la amplificación de "No hay señal" seguirá siendo cero.