Extracto
Antecedentes
derivado de plaquetas factor de crecimiento aberrante (PDGF) de señalización se ha asociado con la progresión del cáncer de próstata (CaP). Sin embargo, su papel en la regulación del crecimiento celular y la supervivencia CaP no ha sido bien caracterizado.
Metodología /Principales conclusiones
El uso de modelos experimentales que son muy semejantes a la fisiopatología clínica de la progresión del CaP, hemos demostrado que PDGF es un factor de supervivencia en células de CaP a través de la regulación positiva de células de leucemia mieloide-1 (MCL-1). tratamiento PDGF induce la rápida translocación nuclear de β-catenina, presumiblemente mediada por c-Abl y la señalización de p68. Curiosamente, PDGF promueve la formación de un complejo transcripcional nuclear que consiste en factor de inducible por hipoxia (HIF) -1α β-catenina y, y su unión a MCL-1 promotor. Supresión de un elemento de respuesta a hipoxia putativo (HRE) en el promotor de Mcl-1 atenúa los efectos de PDGF en MCL-1 de expresión. El bloqueo del receptor de PDGF (PDGFR) de señalización con un inhibidor farmacológico AG-17 abrogó PDGF inducción de MCL-1, y la apoptosis inducida en células de CaP metastásico.
Conclusiones /Importancia
Nuestro estudio dilucidado una mecanismo de supervivencia crucial en células de CaP, indicando que la interrupción de la señal de supervivencia PDGF-MCL-1 puede proporcionar una nueva estrategia para el tratamiento de la metástasis CaP
Visto:. Iqbal S, Zhang S, Driss a, Liu ZR, Kim H-RC, Wang Y, et al. (2012) PDGF regula al alza MCL-1 mediante la activación de β-catenina y la señalización de HIF-1α-dependiente en células de cáncer de próstata humano. PLoS ONE 7 (1): e30764. doi: 10.1371 /journal.pone.0030764
Editor: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 21 de junio de 2011; Aceptado 20 de diciembre de 2011; Publicado: 20 de enero 2012
Derechos de Autor © 2012 Iqbal et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Defensa PC060566, American Cancer Society RSG-10-140-01, Premio de la Universidad de Emory Comité de Investigación, Kennedy Fondo Semilla (DW), Instituto Nacional del cáncer de subvención 1R43CA141870 (AW), el Instituto Nacional del cáncer otorga CA98912 P01, R01 CA122602 , Departamento de Defensa PC060866 (LWKC), Georgia Cancer Coalition Distinguido Académico Grant (OK). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Los factores de crecimiento derivados de las plaquetas (PDGF) se compone de cinco isoformas diméricas: PDGF-AA, -AB, -BB, -CC y -DD [1], los cuales ejercen sus efectos celulares a través de dos estructuralmente similar receptores tirosina quinasa (PDGFR-alfa y -β) expresadas por muchos diferentes tipos de células [2]. La unión del ligando a PDGFR resultados en la dimerización y la autofosforilación de los receptores quinasas, posteriormente el reclutamiento de cierta homología Src 2 (SH2) adaptador de proteínas que contienen el dominio (por ejemplo, Src, Grb2 y Shc) a residuos de tirosina fosforilados específicos. Varias cascadas de señalización, incluyendo Ras-mitogen-activated proteína quinasa (MAPK), la fosfolipasa-γ y phos-phatidyl-inositol-3'-quinasa (PI3K) /Akt, se han caracterizado como las principales vías aguas abajo que median las funciones de PDGF [3] . Otras moléculas adaptadoras (por ejemplo, el Fer y Fes tirosina quinasa de la familia) y los factores de transcripción (por ejemplo, β-catenina) también están involucrados en el PDGF señalización en ciertos tipos de células [4], [5], [6], [7], [8].
expresión aberrante PDGF ha sido frecuentemente asociado con el componente neoplásica de tumores humanos, mientras que PDGFR se encuentran principalmente en la fibroblástica y tumor vascular estroma [9], [10], [11], [ ,,,0],12], [13]. Estas observaciones sugirieron que PDGF derivado del tumor puede actuar principalmente como una molécula de señalización paracrina en tumores sólidos. Apoyando este concepto, estudios recientes han demostrado que el PDGF es un factor pro-angiogénico potente, promoviendo el reclutamiento y crecimiento de los fibroblastos del estroma, células perivasculares y células endoteliales, afectando de manera indirecta el crecimiento tumoral, diseminación metastásica y la resistencia a los medicamentos [2], [3 ], [14], [15], [16]. Curiosamente, la evidencia emergente indica que la señalización autocrina de PDGF también puede desempeñar un papel importante durante la progresión del tumor. activación mutacional o co-expresión de ligandos de PDGF y los receptores son capaces de estimular el crecimiento de células tumorales y la proliferación en varios tumores malignos no epiteliales, incluyendo glioblastomas y osteosarcoma [17]. Más recientemente, la señalización de PDGF autocrina se ha asociado con epitelio-mesenquimal transición (EMT) en células de carcinoma de mama, colon, próstata y el hígado, lo que sugiere un papel causal de autocrina de PDGF señalización en la metástasis [7], [8], [18], [19]. No obstante, a pesar de la correlación bien establecida entre desregulado señalización paracrina PDGF y la progresión tumoral, las funciones y mecanismos de autocrina de PDGF de señalización en las células cancerosas epiteliales siendo difícil de alcanzar [3], [17].
Adquisición de resistencia a la apoptosis es característica de las células tumorales metastásicas, que pueden conferir ventajas de supervivencia durante la invasión, metástasis y la colonización [20]. Recientemente hemos correlacionado la sobreexpresión de las células de la leucemia mieloide-1 (MCL-1), un miembro de la familia Bcl-2, con la progresión del cáncer de próstata (CaP) hacia la metástasis ósea [21]. En este estudio, nos proporcionan pruebas de que el PDGF-BB es un factor de supervivencia en células de CaP metastásico upregulating MCL-1 de expresión a través de un mecanismo de señalización mediada por los factores de transcripción beta-catenina y el factor (HIF) -1α inducible por hipoxia.
Materiales y Métodos
Cell Cultura y
líneas celulares de CaP humano ARCAP
e, ARCAP
M [22], LNCaP (American Type Culture Collection, ATCC, Manassas , VA), C4-2 [23] y PC3 (ATCC) se mantuvieron rutinariamente en T-medio (Invitrogen, Carlsbad, CA) con suero bovino fetal 5% (FBS). Para los tratamientos con isoformas de PDGF, células de CaP sembraron en placas de 96 pocillos (3000 células /pocillo) fueron suero de hambre durante toda la noche, sustituido con fresco T-medio libre de suero, y se incubaron en presencia de concentraciones variables de PDGF humano recombinante AA, -AB, -BB (R & amp; D Systems, Minneapolis, MN) solución salina tamponada con fosfato, o (PBS) durante los tiempos indicados. interleuquina-6 humana recombinante (IL-6) se adquirió de R & amp; D Systems. Para el tratamiento de quimioterapia de drogas, docetaxel (Sanofi Aventis, Bridgewater, NJ) o dimetilsulfóxido (DMSO; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) se añadió a las células y se incubaron durante 72 h. La proliferación celular se midió usando el ensayo de proliferación de CellTiter 96 AQ de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega, Madison, WI). Las células viables se contaron por triplicado utilizando un hemocitómetro y tinción con azul de tripano.
Los plásmidos y pequeños RNAs de interferencia (siRNAs) guía
El MCL-1 humana región del promotor de longitud completa clonado en un indicador de luciferasa de luciérnaga vector pGL3-Basic (Promega, Madison, WI) fue proporcionado amablemente por el Dr. Steven W. Edwards (Universidad de Liverpool, Liverpool, Reino Unido) [24]. El elemento sensible a la hipoxia (HRE) (fragmento -900 a -884) constructo -truncated se obtuvo por digestión del promotor de longitud completa usando KpnI (desde la posición -3914 a -855) y después se ligó con ADN ligasa T4 (New England Biolabs, Ipswich, MA). Ambas construcciones de plásmido fueron confirmadas por análisis de secuencia. El reportero pHIF1-luc se adquirió de Panomics (Fremont, CA). reporteros factor de células T (TCF) FOPFLASH TOPFLASH y se obtuvieron de Upstate (Billerica, MA). plásmido pTK-RL se adquirió de Promega. Human MCL-1 vector de expresión (pCMV-MCL-1) se obtuvo de Origene, Inc. humano plásmido de expresión de β-catenina fue proporcionado por Dr. Zhi-Ren Liu. En-blanco
más
SmartPool siRNAs contra la β-catenina, p68, PDGFR-alfa y PDGFR-beta, y control de siRNA se obtuvieron de Dharmacon, Inc. (Chicago, IL). HIF-1a y de control de siRNA se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). La transfección transitoria de los constructos de ADN y siRNAs se realizó utilizando Lipofectamine 2000 o reactivos oligofectamine (Invitrogen), de acuerdo con los protocolos del fabricante y nuestros procedimientos publicados [21], [25].
Análisis Western Blot
lisados de células totales se prepararon usando tampón (RIPA) de radioinmunoprecipitación (Santa Cruz Biotechnology, Inc.). proteínas nucleares se extrajeron usando un kit de Novagen (EMD Biosciences, San Diego, CA). análisis de inmunotransferencia siguió los procedimientos estándar [25]. software ImageJ (Institutos Nacionales de Salud) se utilizó para cuantificar la expresión de la proteína relativa como normalizado a los controles de carga. Información para los anticuerpos utilizados en este estudio se describió en el Adicional cuadro S1.
inmunoprecipitación
El paquete de inicio inmunoprecipitación (GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ) fue utilizado de acuerdo con la Instrucciones del fabricante. lisados nucleares totales (1 mg) se inmunoprecipitaron con 5 conejo g anti-HIF-1α anticuerpo, anticuerpo de ratón anti-β-catenina, ratón anti-c-Abl y anticuerpo de conejo anti-p68 (Información Suplementaria, Tabla S1), o normal IgG (R & amp; D Systems). La proteína A /G Sepharose se añadieron 4 cuentas de flujo rápido para precipitar las proteínas, ya continuación se lavó y se eluyó. Las muestras se procesaron para el análisis de Western blot.
inmunofluorescencia y confocal de imágenes
inmunofluorescencia se realizó como se describe anteriormente [21] utilizando el ratón anti-β-catenina, conejo anti-p68 y anti anticuerpos HIF-1a (Supplemental Cuadro S1). Cualquiera de Alexa 488 o 555 anticuerpos secundarios (Invitrogen) se utilizaron a una dilución de 1:500 y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. tinción nuclear se llevó a cabo por las células de incubación con 0,4 mol /L de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) a portaobjetos de montaje. Las células fueron imágenes en un Zeiss LSM 510 META. En todos los casos, ya sea un objetivo de aceite 100x 63x o Zeiss Plan-Apo se utilizó (apertura numérica de 1,3 y 1,4, respectivamente). Todas las imágenes tenían la expansión de contraste realizado en Adobe Photoshop.
RT-PCR cuantitativa (QRT-PCR) y RT-PCR
El ARN total se prepara con Qiagen RNeasy Kit (Valencia, CA). La primera línea de cDNA fue sintetizado utilizando superíndices ®III primer capítulo de síntesis del sistema (Invitrogen). PCR cuantitativa se llevó a cabo por el sistema LightCycler 480 (Roche Applied Science) utilizando un verde QPCR Master Mix Brilliant® SYBR® (Stratagene) según las instrucciones del fabricante. Para el punto final de RT-PCR, se utilizó el One-Step RT-PCR kit Superscript® III (Invitrogen) siguiendo el protocolo del fabricante. Los pares de cebadores específicos se describen en el cuadro Adicional S2. Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) mRNA se amplificó con un par de cebadores descritos anteriormente [25] y se utilizan para normalizar las entradas de ARN.
Ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina (CHIP)
El chip secuencial (chip-re-cHIP) experimento se realizó utilizando el kit de Active Motif re-chip-IT ® (Active Motif, Carlsbad, CA). Brevemente, las células de CaP se privaron de suero durante la noche y se reemplaza con medio libre de suero fresco, se incubaron con PDGF-BB o PBS durante los tiempos indicados. Las células se fijaron 10 min a temperatura ambiente por una solución de formaldehído 1% a reticular las interacciones ADN-proteína. La cromatina se esquilada durante 8 minutos utilizando un kit de chip-It Express enzimática Shearing (Active Motif) [25]. Una parte de la cromatina se invirtió y se utiliza como ADN de entrada. Para la inmunoprecipitación, se añadieron 2 g de anticuerpo anti-β-catenina y se incubaron durante la noche, con IgG normal como el control (Supplemental Tabla S1). cromatina eluido se desaló, y una alícuota se utilizó como control para la primera reacción de chips. Después, la reacción re-ChIP se realizó con 2 g de anticuerpo anti-HIF-1α o con el control de IgG. cebadores de PCR para la región de la EDH en MCL-1 promotor humanos se describen en la Tabla S2 Suplementario. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo durante 40 ciclos, con la concentración de cebador como 10 pmol /20 l, utilizando el kit de Mix Master AmpliTaq Gold 360 (Invitrogen).
Análisis estadístico
Todos los datos representan tres o más experimentos . Los errores son S.E. valores de resultados promediados. Para
t-test fue utilizado
de cada estudiante de ensayo para la comparación estadística con los grupos de control. Los valores de
p
≤0.05 se tomaron como una diferencia significativa entre las medias. El análisis estadístico se realizó utilizando el software Sigmaplot 11.0 (Systat Software, Inc., Chicago, IL).
Resultados
MCL-1 es un factor de supervivencia en células de CaP
anteriormente hemos demostrado que MCL-1 sobreexpresión se asocia con
in vivo
hueso propensión metastásica de las células de CaP humanos, y esto es importante, correlacionado con metástasis ósea CaP clínico [21]. En consonancia, el uso de un modelo celular CaP ARCAP humana que podría imitar estrechamente la fisiopatología de la metástasis ósea en ratones inmunodeficientes [26], se encontró que MCL-1 de expresión se incrementó significativamente en altamente
células óseas metastásicas ARCAP M cuando se compara a la de la contraparte de baja invasiva ARCAP
células E (Figura 1A). La hipótesis de que la regulación al alza de MCL-1 puede conferir ventajas CaP metastásico de células de supervivencia, lo que les permite escapar al destino de apoptosis durante la invasión y la difusión y el éxito establecen metástasis a distancia [20]. En apoyo de esta idea, la expresión ectópica de MCL-1 mejora la resistencia de células CaP con docetaxel (Figura 1B), un fármaco quimioterapéutico usado comúnmente en refractario a las hormonas y el CaP metastásico [27]. Estos resultados indican que la regulación al alza de MCL-1 puede dar cuenta de, al menos en parte, la resistencia a la apoptosis en células de CaP metastásico.
(A) MCL-1 expresión de la proteína en el ARCAP relacionados linaje-
E y las células ARCAP
M. (B) La expresión ectópica de MCL-1 en ARCAP
células M y los efectos sobre la citotoxicidad de docetaxel en ARCAP
células M. pCMV: control de vectores. (C) Panel izquierdo: Las dosis y tiempo dependiente efectos de PDGF-BB en MCL-1 mRNA expresión en ARCAP
células M; El panel medio: QRT-PCR análisis de MCL-1 mRNA expresión en respuesta al tratamiento de PDGF-BB en ARCAP
células M (24 h); panel de la derecha: Los efectos del tratamiento con PDGF-BB (20 ng /ml, 72 h) en MCL-1 de expresión de proteínas en ARCAP
células M. ImageJ se utilizó para cuantificar la expresión relativa de proteína MCL-1. (D) Los efectos de la exógena de PDGF-BB en la citotoxicidad de docetaxel en ARCAP
células M, según se determina mediante el ensayo de MTS.
PDGF-BB induce MCL-1 expresión y antagoniza la apoptosis en el CaP células
Curiosamente, PDGF-BB se encontró para inducir significativamente MCL-1 de expresión en células de CaP (Figura 1C, Adicional Figura S1). El tratamiento con recombinante humana PDGF-BB aumentó MCL-1 mRNA en la dosis y de manera dependiente del tiempo, a pesar de las condiciones óptimas para la máxima acumulación de MCL-1 mRNA variado en diferentes líneas celulares de CaP. Western blot confirmó los efectos inductivos de PDGF-BB en MCL-1 de expresión a nivel de proteínas. Estos datos identifican PDGF-BB como un nuevo regulador de MCL-1 de expresión, lo que podría proporcionar un mecanismo de supervivencia para proteger las células de PCA de la apoptosis. De hecho, la adición de PDGF-BB en cultivos de células de CaP antagoniza eficazmente la citotoxicidad de docetaxel en una amplia gama de dosis (Figura 1D).
perfil de expresión de PDGF componentes en células de CaP señalización autocrina
Se examinó el patrón de expresión de PDGF y sus receptores en células de CaP (Figura 2A). Los análisis de RT-PCR mostró que las isoformas de PDGF se expresaron diferencialmente a nivel de mRNA, y entre ellos, el aumento de PDGF-B y PDGF-D se observaron en
células C4-2 y ARCAP M cuando se compara con la de los padres y LNCaP ARCAP
células E, respectivamente. De acuerdo con estudios anteriores [19], se encontró que las células PC3 para expresar altos niveles de PDGF-D, PDGFR-α y -β. Curiosamente, PDGFR-alfa mRNAs parecía estar expresada sustancialmente en células de CaP, que fue confirmada a nivel de proteína mediante análisis de transferencia Western. Por el contrario, aunque mRNAs PDGFR-beta fueron detectados por RT-PCR en la mayoría de líneas celulares de CaP, análisis de inmunotransferencia sólo pudo confirmar la expresión de proteínas en ARCAP
E y ARCAP
células M (Figura 2A, panel derecho). En conjunto, estos datos sugieren un funcional PDGF señalización en ciertas células de CaP autocrina.
(A) perfil de expresión de PDGFR componentes de señalización en células de CaP, tal como se analizó por RT-PCR y Western Blot. (B) Los efectos de PDGF-BB (20 ng /ml) sobre la fosforilación de PDGFR-α y -β en ARCAP
células M. (C) Los efectos del ozono PDGFR-α y /o -β sobre MCL-1 de expresión de proteínas en ARCAP
células M. Las células fueron transfectadas con cualquiera de siRNAs específicos de isotipo de orientación PDGFR-α (panel izquierdo, 30 nM) o β PDGFR (panel central, 100 nM), o una mezcla de PDGFR-α y -β siRNAs (panel derecho) para 48 h, privaron de suero durante la noche, y se incubaron en presencia o ausencia de PDGF-BB (20 ng /ml) durante 72 h. (D) Panel superior: Los efectos dependientes del tiempo de AG-17 (100 nM) en MCL-1 mRNA expresión en ARCAP
células M; panel inferior: Los efectos de la AG-17 de tratamiento sobre la expresión de MCL-1 y PARP escindida en presencia (20 ng /ml) o ausencia de PDGF-BB (20 ng /ml) en ARCAP
células M. (E) Los efectos de la AG-17 de tratamiento (100 nm, 72 h) en la viabilidad de ARCAP
E y ARCAP
células M.
autocrina media la señalización PDGFR PDGF BB regulación de MCL-1 en células de CaP
Tanto PDGFR-α y -β fueron altamente expresado en el hueso metastásico ARCAP
células M, y rápidamente fosforilada de una manera dependiente del tiempo en respuesta a la estimulación de exógena de PDGF-BB (Figura 2B). Interesante, el agotamiento de cualquiera de PDGFR-α o -β por siRNA isoforma específica no bloqueó el efecto inductivo de PDGF-BB en MCL-1 de expresión (Figura 2C, a la izquierda y paneles centrales), lo que sugiere que la activación de cualquiera de los receptores puede ser suficiente para la regulación al alza de MCL-1. En apoyo de esta hipótesis, la transfección transitoria con una mezcla de siRNAs dirigidos tanto a PDGFR-α y -β inhibió la expresión basal de MCL-1, y abrogó PDGF-BB inducción de MCL-1 ARCAP
células M (Figura 2C, el panel de la derecha ). Alternativamente, el tratamiento con AG-17 (tirfostina), un inhibidor farmacológico selectivo de PDGFR [28], reducción de la expresión de Mcl-1, tanto en el ARNm y los niveles de proteína y markably aumento de la escisión de poli-ADP ribosa polimerasa (PARP), un indicador de apoptosis . Estos efectos fueron atenuadas por la presencia de PDGF-BB en cultivos (Figura 2D). Consistentemente, el tratamiento AG-17 a dosis bajas (por ejemplo, 100 nM) indujo eficazmente la apoptosis en ARCAP
E y ARCAP
células M (Figura 2E), lo que indica un papel fundamental de PDGFR señalización en la supervivencia de células de CaP.
β-catenina media la regulación PDGF de MCL-1 expresión en células de CaP
la activación de la vía de β-catenina es un evento aguas abajo de PDGF señalización en ciertas células cancerosas epiteliales [7], [ ,,,0],8], [29]. El análisis de transferencia Western reveló que β-catenina y TCF4, un importante β-catenina-interactuar factor de transcripción [30], son expresados diferencialmente en el CaP células (Figura 3A), lo que sugiere un funcional β-catenina-TCF4 de señalización en estas células. De hecho, un promotor TCF artificial fue activado tanto en el LNCaP-C4-2 y ARCAP
E-ARCAP
linajes de células M, y las actividades reportero parece estar asociado con un aumento de
in vivo
potencial metastásico en C4-2 y ARCAP
células M (Figura 3B). Vale la pena señalar que tanto la β-catenina y TCF4 se presentaron sustancialmente en el núcleo de ARCAP
E y ARCAP
células M (Figura 3A, panel inferior), que exhibió actividades marcadamente más altos TVC basales que cualquiera de LNCaP o C4 -2 células (por ~ 100 veces) (Figura 3B).
(A) Expresión perfil de componentes de señalización β-catenina-TCF en células de CaP. la actividad del indicador (B) TCF en el LNCaP-C4-2 y ARCAP
E-ARCAP
células M. (C) Panel superior: Los efectos de PDGF-BB (20 ng /ml) sobre la translocación nuclear de β-catenina en ARCAP
células M; Panel inferior: Los efectos de PDGF-BB (20 ng /ml) sobre la actividad de reportero TCF en presencia (100 nM) o ausencia de AG-17. (D) Los efectos de la expresión ectópica de β-catenina (72 h) en MCL-1 de expresión, tanto en los niveles de proteína y ARNm. (E) Los efectos del agotamiento de β-catenina en la regulación de PDGF-BB de MCL-1 de expresión en ARCAP
células M. Las células se transfectaron con β-catenina siRNA o ARNsi de control (30 nM) durante 48 h, privaron de suero durante la noche, y se incubaron en presencia o ausencia de PDGF-BB (20 ng /ml) durante 72 h. (F) Los efectos del agotamiento de β-catenina en MCL-1 reportero de la actividad en ARCAP
células M. Las células se transfectaron con β-catenina o ARNsi de control (30 nM) durante 48 h, y se transfectaron adicionalmente con un MCL-1 reportero humano de 24 h. Después de la privación de suero durante la noche, las células se incubaron en presencia o ausencia de PDGF-BB (20 ng /ml) durante 48 h.
Tras el tratamiento PDGF-BB, la presencia nuclear de β-catenina se incrementó rápidamente en ARCAP
células M (Figura 3C, panel superior). Consistentemente, la actividad de reportero TCF también fue significativamente mayor después de la estimulación de PDGF-BB, que fue atenuada por el pre-tratamiento con AG-17 (Figura 3C, panel inferior). Estos datos indicaron que el PDGF-BB activa la señalización de β-catenina de manera PDGFR-dependiente.
Para investigar el papel de β-catenina en la regulación de MCL-1 de expresión, ARCAP
M células fueron transitoriamente transfectadas con un constructo de expresión de tipo salvaje β-catenina. RT-PCR y análisis de Western blot mostraron que epression ectópica de β-catenina increseased MCL-1 tanto en los niveles de proteína (Figura 3D) mRNA y. Por el contrario, el agotamiento de β-catenina usando una piscina siRNA inhibe eficazmente tanto la expresión basal de MCL-1 y su inducción por PDGF-BB (Figura 3E). Consistentemente, ya que PDGF-BB indujo significativamente la actividad de la luciferasa de un MCL-1 promotor humano de longitud completa en ARCAP
M células transfectadas con no dirigidos control de siRNAs, este efecto fue abrogada por la depleción transitoria de endógeno β-catenina (Figura 3F). Estos resultados sugieren que la activación de la señalización de β-catenina puede ser suficiente y necesaria para la MCL-1 de expresión en células de CaP.
PDGF activa la señalización de p68-β-catenina en las células de CaP
Hemos investigado si una vía de c-Abl-p68-dependiente está implicado en la activación de la señalización de PDGF β-catenina en células de CaP [7]. Los análisis de transferencia de Western se encontró que el c-Abl y p68 se expresaron diferencialmente en células de CaP (Figura 4A). Tras el tratamiento de PDGF-BB, fosforilación de la tirosina de c-Abl y p68 se activaron rápidamente, como lo demuestran los ensayos de inmunoprecipitación-inmunotransferencia (Figura 4B, los paneles izquierdo y central). Es importante destacar que la presencia de β-catenina en inmunoprecipitados de p68 también se incrementó de una manera dependiente del tiempo, lo que sugiere una asociación física mejorada entre β-catenina y las proteínas p68 (Figura 4B, panel central), el cual fue confirmado por un experimento de inmunoprecipitación recíproca (Figura 4B, panel derecho). De hecho, PDGF-BB indujo rápida translocación nuclear de p68 dentro de 30 min (Figura 4C), que se asoció con un aumento de co-localización de p68 y β-catenina en el núcleo (Figura 4D). Estos datos indicaron que PDGF-BB podría activar la cascada c-Abl-p68 y la posterior señalización β-catenina en células de CaP.
(A) Expresión de c-Abl y p68 en células de CaP. (B) Panel izquierdo: Los efectos de PDGF-BB (20 ng /ml) en la fosforilación de c-Abl; el panel medio: Los efectos de PDGF-BB (20 ng /ml) sobre la fosforilación de p68 y la expresión de β-catenina en los inmunoprecipitados de p68 en ARCAP
células M. se detectó la fosforilación de p68 en los sitios de tirosina usando un anticuerpo-pan fosforilados-Tyr; panel de la derecha: Los efectos de PDGF-BB (20 ng /ml) sobre la expresión de p68 en los inmunoprecipitados de β-catenina en ARCAP
células M. (C) Los efectos de PDGF-BB (20 ng /ml) en la translocación nuclear de p68 en ARCAP
células M. (D) La microscopía confocal análisis de los efectos de PDGF-BB en la co-localización de β-catenina y p68 en el núcleo en un experimento de curso de tiempo en ARCAP
células M. (E) Los efectos del agotamiento de p68 en la regulación de PDGF de MCL-1 en ARCAP
células M. Las células fueron transfectadas con p68 o ARNsi de control (30 nM) durante 48 h, privaron de suero durante la noche, y se incubaron en presencia o ausencia de PDGF-BB (20 ng /ml) durante 24 h (panel superior) o 72 h ( panel inferior). Panel superior: análisis de RT-PCR de la expresión de ARNm de p68 y MCL-1; panel inferior: Western blot de la expresión de proteína de p68, β-catenina y MCL-1. (F) Los efectos del agotamiento de p68 en MCL-1 reportero de la actividad en ARCAP
células M. Las células fueron transfectadas con p68 o ARNsi de control (30 nM) durante 48 h, y se transfectaron adicionalmente con MCL-1 reportero humano de 24 h. A raíz de la privación de suero durante la noche, las células se incubaron en presencia o ausencia de PDGF-BB (20 ng /ml) durante 48 h.
Para examinar si se requiere p68 para la regulación de MCL-1 expresión, ARCAP
células M fueron transfectadas con siRNA p68 o ARNsi de control, y se analizaron para la expresión de MCL-1 en el ARNm y los niveles de proteína. Como se muestra en la Figura 4E, el agotamiento de p68 inhibe endógeno β-catenina y atenúa eficazmente PDGF-BB inducción de MCL-1 de expresión. Consistentemente, MCL-1 promotor de la actividad se inhibió significativamente por el tratamiento con p68 siRNA en ARCAP
células M, ya sea con o sin la presencia de PDGF-BB en los cultivos (Figura 4F). Estos datos indican una función indispensable de p68 en la regulación de MCL-1 en células de CaP.
PDGF-BB promueve la interacción entre la proteína β-catenina y HIF-1α en el CaP células
Nuestra anterior Los estudios demostraron un importante papel de HIF-1α en células de CaP metastásico de hueso [25]. Curiosamente, la transfección de un siRNA HIF-1α-específica redujo significativamente MCL-1 expresión de proteínas en ARCAP
células M (Figura 5A), sugiriendo que HIF-1α puede ser necesaria para la regulación de Mcl-1 en células de CaP. Para examinar si PDGF-BB podría inducir la interacción física entre HIF-1α y β-catenina, proteínas nucleares se prepararon a partir
células ARCAP M tratadas con PDGF-BB durante tiempos variables. El análisis de transferencia Western se encontró que tanto HIF-1α y β-catenina se aumentaron rápidamente en el núcleo (Figura 5B). Un ensayo de co-inmunoprecipitación mostraron que, en respuesta a la estimulación de PDGF-BB, la presencia nuclear de β-catenina aumentó rápidamente en los inmunoprecipitados HIF-1a (Figura 5C, panel superior). Reciprocal co-inmunoprecipitación con un anticuerpo anti-β-catenina confirmó un aumento de la asociación de HIF-1α nuclear con β-catenina después del tratamiento PDGF-BB (Figura 5C, panel inferior). La co-localización mejorada de β-catenina y proteínas HIF-1α se demostró adicionalmente por microscopía confocal, que parecía acheive la intensidad máxima a los 30 minutos tras la estimulación de PDGF-BB (Figura 5D). Estos resultados indican que en repsonse a la estimulación PDGF-BB, β-catenina interacciona físicamente con HIF-1α en el núcleo, lo que puede conducir a la activación de MCL-1 de transcripción en células de CaP
.
(A) La efectos del agotamiento de HIF-1α en MCL-1 de expresión en ARCAP
células M. Las células fueron transfectadas con HIF-1α o ARNsi de control (30 nM) durante 72 h, y se analizaron para MCL-1 de expresión por inmunotransferencia. (B) Análisis de transferencia Western de los efectos de PDGF-BB (20 ng /ml) sobre la translocación nuclear de β-catenina y HIF-1α en ARCAP
células M. (C) los ensayos de co-inmunoprecipitación de los efectos de PDGF-BB (20 ng /ml) sobre la interacción entre β-catenina y HIF-1α en el núcleo en ARCAP
células M. (D) La microscopía confocal de los efectos de PDGF-BB (20 ng /ml) sobre las co-localización de β-catenina y HIF-1α en el núcleo en ARCAP
células M.
se necesita un motivo putativo HRE para la activación de PDGF-BB de MCL-1 promotor
HIF-1α se une a la EDH
cis
-elementos dentro de los promotores de los genes de respuesta a la hipoxia y regula su expresión [31]. Hemos examinado si la acumulación nuclear inducida por PDGF-BB de HIF-1α se asoció con la activación de la transcripción dependiente de HRE. En ARCAP
células M, el tratamiento PDGF-BB aumentó significativamente la expresión de luciferasa dirigido por un promotor HRE artificial (pHIF-luc) (Figura 6A). Curiosamente, un motivo putativo HRE se identificó dentro de humano MCL-1 región promotora, que se localiza entre -900 y -884 nucleótidos en el extremo 5 'aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción [24]. Para investigar el papel potencial de este
cis
-elemento PDGF en la regulación de MCL-1 de transcripción, que caracteriza un mutante de deleción del motivo HRE putativo utilizando MCL-1 humana región promotora como la plantilla (Figura 6B). La construcción resultante reportero (p-MCL-1-Luc: ΔHRE), o el indicador de luciferasa conducido por el de larga duración MCL-1 promotor (p-MCL-1-Luc), se expresó transitoriamente en ARCAP
células M respectivamente, y se trataron con PDGF-BB o PBS. IL-6, que se ha demostrado para activar MCL-1 de transcripción en células de CaP y colangiocarcinoma a través de un transductor de señales y activador de la transcripción 3 (STAT3) mecanismo dependiente de [32], [33], se incluyó como control positivo. ensayo de actividad luciferasa mostraron que PDGF-BB indujo la activación del promotor de p-MCL-1-Luc en un grado mayor que la IL-6 en ARCAP
células M. De manera significativa, la deleción del motivo HRE no sólo redujo la actividad basal de MCL-1 promotor, sino también abrogó los efectos inductivos de PDGF-BB en la actividad del indicador. Por el contrario, p-MCL-1-Luc: ΔHRE, que contiene una secuencia de unión Stat3-en la posición entre -92 y -83 [32], se mantuvo activa al IL-6 tratamiento (Figura 6C). Un efecto similar de la EDH supresión de la respuesta diferencial de MCL-1 promotor de PDGF-BB y la IL-6 también se observó en las células (C4-2 Adicional Figura S2). Estos datos indican que la supuesta HRE
cis
-elemento que se requiere para la activación de PDGF-BB de MCL-1 de expresión en células de CaP.
(A) Los efectos de PDGF-BB en la HIF -1 actividad del indicador en ARCAP
células M. Las células fueron transfectadas transitoriamente con HIF-1 reportero pGL3 o durante 24 h, privaron de suero y se incubaron en presencia o ausencia de PDGF-BB (20 ng /ml) durante 48 h. (B) Representación esquemática de MCL-1 promotor humano y su mutación por deleción en el sitio de HRE putativo. (C) Los efectos de la supresión del sitio HRE putativo sobre la regulación de PDGF de MCL-1 promotor de la actividad en ARCAP
células M. IL-6 (200 ng /ml) se incluyó como control positivo. (D) chip de ensayo-Re-chip de los efectos del tratamiento con PDGF-BB (20 ng /ml) en la unión de β-catenina y HIF-1α a humano MCL-1 promotor en la región ARCAP
células M.
PDGF-BB promueve la unión de ambas β-catenina y HIF-1α a MCL-1 promotor de la región
Hemos investigado si PDGF-BB promovió la unión de ambas β-catenina y específica HIF-1α a MCL-1 promotor por un chip de ensayo secuencial. cromatina fraccionado de controles y
células M ARCAP tratadas con PDGF-BB se inmunoprecipitó en primer lugar con un anticuerpo β-catenina, y los precipitados se sometieron a un ensayo de re-chip con un anticuerpo HIF-1α.