Extracto
pancreático y duodenal homeobox-1 (PDX-1) es un factor de transcripción que regula la expresión de insulina y el mantenimiento de los islotes en el páncreas adulto. Nuestros estudios recientes demuestran que PDX-1 es un oncogén de cáncer de páncreas y se sobreexpresa en el cáncer de páncreas. El propósito de este estudio fue demostrar que PDX-1 es una diana terapéutica para ambos síntomas hormonales y el volumen del tumor en modelos de ratón de cáncer de páncreas, insulinoma y neoplasia de los islotes. La inmunohistoquímica de muestras pancreáticas y la neoplasia de los islotes humanos reveló una marcada PDX-1 sobreexpresión, lo que sugiere PDX-1 como un objetivo "drugable" dentro de estas enfermedades. Para ello, una novela plataforma efector interferencia de ARN, bifuncional shRNA
PDX-1, fue desarrollado y estudiado en líneas celulares de ratón y humanos, así como en modelos de ratón de cáncer de páncreas, insulinoma y neoplasia de los islotes. El suministro sistémico de bi-shRNA
humanPDX-1 lipoplexes resultó en una reducción marcada del volumen tumoral y la mejora de la supervivencia en un modelo de ratón con xenoinjerto de cáncer pancreático humano. bi-shRNA
mousePDX-1 lipoplexos impidió la muerte de hiperinsulinemia e hipoglucemia en un modelo de ratón insulinoma. shRNA
mousePDX-1 lipoplexos invierte hiperinsulinemia e hipoglucemia en un modelo de ratón inmune competente de la neoplasia de los islotes. PDX-1 se sobreexpresa en los tumores neuroendocrinos pancreáticos y nesidioblastosis. Estos datos demuestran que la terapia de PDX-1 RNAi controla los síntomas hormonales y el volumen del tumor en modelos de ratón de cáncer de páncreas, insulinoma y neoplasia de los islotes, por lo tanto, PDX-1 es una posible diana terapéutica para estas enfermedades pancreáticas
Visto.: Liu SH, Rao DD, Nemunaitis J, Senzer N, Zhou G, Dawson D, et al. (2012) PDX-1 es una diana terapéutica para el cáncer pancreático, insulinoma y Islet Neoplasia utilizando una plataforma de ARN de interferencia Novel. PLoS ONE 7 (8): e40452. doi: 10.1371 /journal.pone.0040452
Editor: John J. Rossi, Instituto de Investigación Beckman de la Ciudad de la Esperanza, Estados Unidos de América
Recibido: 15 de mayo de 2012; Aceptado: 7 Junio 2012; Publicado: 8 Agosto 2012
Copyright: © Liu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio recibió el apoyo de subvención R01-DK46441 del Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y renales; subvención R01-CA095731 del Instituto Nacional del Cáncer; la Fundación Alkek; la Fundación Vivian L. Smith; la Fundación MD Anderson; y la generosidad de la familia de Bill y Olivia Heintz. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. D. Rao, N. Senzer, Z. Wang y N. Templeton se emplean por gradalis, Inc. Los siguientes autores son accionistas de gradalis, Inc .: N. Senzer, FC Brunicardi, D. Rao y J. Nemunaitis. No hay patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todos los PLoS ONE políticas sobre los datos y compartir materiales, como se detalla en línea en la guía para los autores.
Introducción
pancreático y duodenal homeobox-1 (PDX -1) es un factor de transcripción que juega un papel crítico en la regulación de desarrollo del páncreas embriológicas, así como en la expresión de insulina y el mantenimiento de los islotes en el páncreas adulto [1], [2], [3], [4]. PDX-1 knockout es letal en ratones y mutación de PDX-1 conduce a madurar aparición de la diabetes de los jóvenes (MODY subtipo IV) en ratones y pacientes humanos [5], [6]. sobreexpresión persistente de PDX-1 conduce a acinares a ductal metaplasia de células en ratones [7]. La sobreexpresión de PDX-1 en líneas celulares de los resultados en la transformación de las células no productoras de insulina en células productoras de insulina sobre GLP-1 estímulo [8], [9], [10], [11], [12], [13 ]. PDX-1 es bien conocido como un regulador de esencial de muchos genes endocrinas pancreáticas tales como la insulina [1], [2], [3], [4], la glucoquinasa [14], polipéptido amiloide de los islotes [15], [16], [17], transportador de glucosa tipo 2 [GLUT2] [18], [19], polipéptido pancreático [20] y la somatostatina [21], [22], y por lo tanto tiene un papel crítico en el mantenimiento de la homeostasis de la glucosa.
Nuestros estudios recientes demuestran que PDX-1 es un oncogén [23], [24]. Se sobreexpresa notablemente en el cáncer de páncreas [23], [25], [26], [27] y regula la proliferación e invasión de células de cáncer de páncreas humanos
in vitro
y
in vivo en
ratones [23]. PDX-1 sobreexpresión en células benignas y malignas produjo un aumento de la formación de tumores cuando estas células se implantan en ratones [24]. El suministro sistémico del shRNA
humanPDX-1 lipoplexos dio lugar a una marcada reducción del volumen tumoral y prolonga la supervivencia en un modelo de xenoinjerto de cáncer pancreático humano de ratón [23].
Nuestro equipo ha desarrollado una nueva plataforma de interferencia de ARN bifuncional en el que la traducción del ARNm objetivo es reprimida a través de las dos vías de carga RISC de escisión independiente y la escisión dependiente, lo que resulta en Argonaut diferencial de incorporación y separada, pero coordinado, el objetivo de los mecanismos de inactivación [28].
en este estudio, una novela RNAi plataforma efector orientación PDX-1 se desarrolló y se estudió en las líneas celulares humanas y de ratón, así como en modelos de ratón de cáncer de páncreas, insulinoma y neoplasia de los islotes para determinar si PDX-1 es una diana terapéutica potencial para el control de ambos hormonal síntomas y el volumen del tumor en estas enfermedades pancreáticas.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
ratones SCID fueron alojados en una instalación BL-4 y atendidos en el cumplimiento de las directrices en
el Cuidado y uso de Animales de laboratorio
preparado por el Instituto de Recursos Animales de laboratorio, la Comisión de Ciencias de la vida, el Consejo Superior de Investigaciones Científicas y el Comité de Investigación Animal de la Facultad de Medicina Baylor. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del Experimentación Animal de la Facultad de Medicina Baylor. (Número de Permiso: UN 2404)
muestras de seres humanos fueron recibidas con arreglo a un protocolo humano que fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional ( IRB) de la Facultad de Medicina Baylor (Número de Permiso: H 14054); muestras fueron procesadas estrictamente de acuerdo con los procedimientos dictados por dicho protocolo. Todas las muestras de tumores neuroendocrinos pancreáticos humanos y Nesidioblastosis fueron muestras obtenidas con el consentimiento del IRB (H 14054) sin identificación y el consentimiento informado por escrito.
Las líneas celulares, vectores y anticuerpos
Ratón βTC-6 y línea celular de cáncer de páncreas PANC-1 líneas celulares humanas se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Bethesda, MD) y se informó anteriormente [29]. las muestras de tumor neuroendocrino pancreático humano y muestras Nesidioblastosis humanos fueron amablemente proporcionados por el Dr. David Dawson del Departamento de Patología de la UCLA y el Dr. Milton Finegold del Departamento de Anatomía Patológica del Hospital de Niños de Texas, respectivamente. Ratón PDX-1 shRNA (shRNA
mousePDX-1) fue diseñado como se describe anteriormente [23]. Bi-funcional del ratón (bi-shRNA
mousePDX-1) y humano PDX-1 (BI-shRNA
humanPDX-1) se obtuvieron a partir gradalis Inc (Dallas, TX). Prip-mCherry_CMV-eGFP y Prip-mCherry _CMVeGFP_H1-shRNA
mousePDX-1 se subclonaron basado en el vector parental RIP-mCherry-NLS-mCherry que fue proporcionado por el Dr. Michael Mancini del Baylor College of Medicine. De cabra anti-conejo anti-suero y de oveja anti-ratón anti-suero conjugado con peroxidasa de rábano picante se compraron de Amersham (Amersham Life Science Inc., Arlington Heights, IL). IgG de conejo anti-cabra se obtuvo de Zymed (Zymed Laboratories, Inc. de South San Francisco, CA, EE.UU.).
La transfección y el reportero de ensayo
β TC-6 o PANC-1 células fueron chapada en placas de cultivo celular de 10 cm a 1 × 10
6 células por placa o placas de 24 pocillos a 1 x 10
5 células /pocillo y se incubaron a 37 ° C durante 24 h. Los ensayos de transfección se realizaron utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Se observaron y se contaron las señales de fluorescencia mediante microscopía de fluorescencia como se ha descrito anteriormente [23] para determinar las actividades reportero
Ensayo de proliferación celular.
in vitro
La proliferación celular se determinó por MTS ensayo (Promega, Madison, WI) y BrdU incorporan ensayo (colorimétrico) (Roche Diagnosistics GmbH, Mannherim, Alemania) a los 12, 24, 48 y 72 h después de la transfección. Se leyó la absorbancia en un lector de placas Multiskan EX (Thermo Electronic Corp., Franklin, MA) a 492 nm para MTS y 500 nm para el ensayo de BrdU y los niveles de proliferación se calcularon como se describe anteriormente.
análisis de transferencia Western
Cuarenta y ocho horas después de la transfección, tal como se describe anteriormente [23], se recogieron βTC-6 células y se lisaron en tampón RIPA. Veinte (20) g de lisados celulares se aplicaron a gel de SDS-PAGE para electroforesis. A continuación, la proteína se transfirió a membranas que se sondaron con varios anticuerpos contra PDX-1, ciclina D1, ciclina E, CDK2, Cdk4, y p27. Los inmunocomplejos se visualizaron por quimioluminiscencia (ECL) peroxidasa de rábano picante conjugada detección utilizando anticuerpos secundarios.
Animales y shRNA entrega
ratones SCID fueron alojados en un centro de BL-4 y se cuidan de cumplimiento de la directrices en
el Cuidado y uso de Animales de laboratorio
preparado por el Instituto de Recursos Animales de laboratorio, la Comisión de Ciencias de la vida, el Consejo Superior de Investigaciones Científicas y el Comité de Investigación Animal de la Facultad de Medicina Baylor. dosis de ADN se determinaron mediante el cumplimiento de los criterios de menos de 10% de muerte del ratón después de la inyección de liposomal complejo shRNA en ratones SCID regulares. Los ratones machos, de entre 8 a 10 semanas de edad, fueron inoculados con 1 x 10
6 beta células TC-6 o PANC-1 por ratón a través de inyección intraperitoneal (ip). Dos semanas más tarde, ya sea ratones TC-6 o PANC-1 beta se agruparon al azar (30 ratones por grupo) y el primer ciclo de shRNA
mousePDX-1 o bi-shRNA
mousePDX-1 o bi-shRNA
humanPDX-1, respectivamente, se les dio a través de inyección en vena de cola. Los ciclos se repitieron en los días 14 y 28 para un total de tres inyecciones. El mismo protocolo se aplicó a SSTR
1/5
- /- ratones utilizando 3 ciclos de 35 g de shRNA
mousePDX-1. Los lipoplejos shRNA se prepararon como se describe anteriormente [23].
mediciones de glucosa e insulina
En los días 7, 21, 35, 120 y siguientes de cada entrega de genes, 50 l se recogieron muestras de sangre entera y se centrifugó para separar el suero. Los niveles de glucosa se midieron usando un Beckman-Coulter analizador de glucosa 2 (Coulter-Beckman, Fullerton, CA), y se presentan como media ± S.E.M. en mg /dl. Los niveles de insulina se determinaron utilizando un kit de ELISA de insulina de ratón de Mercodia (Linco Research, St. Charles, MO) y presentados como media ± S.E.M. . En mg /l
La glucosa intraperitoneal Prueba de Tolerancia (IPGTT)
SSTR
1/5
- /- ratones en los días 7 y 150 después de la entrega inicial de shRNA
mousePDX-1 se mantuvieron en ayunas durante la noche antes de la recogida de muestras de sangre como T
0. a continuación, los ratones se les dio agrupados peso corporal 1,2 g de glucosa /kg mediante inyección ip seguido por la recolección de muestras de sangre a los 15, 30, 60, y 120 min después de la inyección de glucosa. Los niveles de glucosa y de insulina se midieron como se describe anteriormente.
muestras de tumor neuroendocrino y nesidioblastosis de páncreas humano necropsia, la recogida de tejidos, inmunohistoquímica y ensayo de TUNEL
identificados-De se obtuvieron del Dr. David Dawson y desde El Dr. William Fisher para IHC. páncreas de ratón, islotes y muestras de tejido tumoral se obtuvieron en los días 0, 7, 21, 35, y el tiempo final después de la entrega de genes inicial. tumores peritoneales se macroscópicamente y microscópicamente evaluados y la más grande (A) y diámetros más pequeños (B) medidos y registrados. El volumen del tumor (V; un elipsoide de rotación) se calculó según la fórmula: V (mm
3) = A (mm) × B
2 (mm)
2/2. El volumen total del tumor se calculó poniendo todos los tumores juntos. Los ratones se obtuvieron de acuerdo con la presencia o ausencia de tumor. IHC se realizó como se ha descrito anteriormente. Anti- PDX-1, insulina, PP, ciclina E, p27, anticuerpos Cdk4 o PCNA se aplicaron a portaobjetos con dilución 1:100 seguido de incubación durante la noche a 4 ° C. Los portaobjetos se incubaron con anti-conejo Cy3 o FITC-conjugado, cabra, o anticuerpo secundario de ratón en función de derivación de anticuerpos primarios durante una hora, y se monta con las diapositivas de la cubierta. TUNEL ensayo (Kit DNA FragEL ™ fragmentación Detección, colorimétrico-TdT enzima, Calbiochem, La Jolla, CA) se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante. La tasa de apoptosis se expresó como la proporción de las células cancerosas apoptóticas y el número total de células endoteliales en 10 campos en × 100 aumentos.
Análisis estadístico
de Student no apareado
t
-test fue utilizado para los análisis estadísticos de los niveles de glucosa, los niveles de insulina, y la proliferación celular con
P Hotel & lt; 0,05 indica significación. Se utilizó la χ
2 test para la comparación de tarifas. Rango-registro se utilizó para la comparación ratones supervivencia. De Kaplan-Meier en SPSS 15.0 para MS Windows se utiliza para trazar las curvas de supervivencia.
Resultados
PDX-1 se sobreexpresa en muestras humanas de tumores neuroendocrinos pancreáticos y nesidioblastosis, así como células de insulinoma de ratón y un modelo transgénico hiperplasia de los islotes de ratón
PDX-1 se sobreexpresa en 36 muestras pancreáticas de los islotes humanos y la neoplasia incluyendo 26 tumores pancreáticos neuroendocrinos (Fig. 1a) y 10 especímenes nesidioblastosis (Fig. 1b). PDX-1 también se sobreexpresa en insulinoma ratón células (TC-6 beta) (Fig. 1c) y en los dos células de los islotes y acinares del páncreas de los subtipos de receptores de la somatostatina 1 y 5 ratones knock-out (SSTR
1/5
- /-.) (Fig 1e, f, respectivamente) en comparación con la de los ratones de tipo salvaje (figura 1D).. Estos datos demuestran que la PDX-1 se sobreexpresa significativamente tanto en los tumores neuroendocrinos de páncreas, nesiodioblastosis y los islotes de ratón neoplasia humana, lo que sugiere que es un objetivo potencial para estas enfermedades.
La inmunotinción con anti-PDX-1 anticuerpo demuestra la sobreexpresión de PDX-1 en las muestras de los islotes de neoplasia humanos (26 tumores neuroendocrinos pancreáticos (a), 10 muestras nesidioblastosis (b), βTC-6 tumores (c) y 6 muestras de páncreas de SSTR1 /5
- /- ratones (e, f .) PDX-1 se sobreexpresa en los dos islotes (e) y las células acinares (f) de SSTR1 /5
- /- ratones, en comparación con la de los ratones de tipo salvaje en la que sólo células de los islotes expresan PDX-1 (d). PDX-1 positiva se indica por la flecha (× 200).
Orientación PDX-1 con bi-shRNA
humanPDX-1 controla el volumen del tumor en un ser humano de xenoinjerto de cáncer de páncreas modelo de ratón
in vitro
estudios.
Dado que las células PANC-1 son las células cancerosas pancreáticas humanas que sobreexpresan marcadamente PDX-1, se utilizaron estas células para ambos
in vitro
y
in vivo
estudios. bi-shRNA
humanPDX-1 transfección de células PANC-1 dio lugar a tumbar de PDX-1. Esto se asoció con una reducción de la proliferación celular en un 58%, 40% y 38% en comparación con los controles de vector vacío a las 24, 48 y 72 h después de la transfección, respectivamente. Hubo una mayor inhibición de la proliferación de células que la observada con shRNA
humanPDX-1 en el 0,6 ug y 1,2 ug /ml de medio de dosis (Fig. 2a, 2b), frente a la ventaja potencial de bi- shRNA
humanPDX- 1 en la terapia RNAi para los cánceres pancreáticos.
ensayo MTS mostraron el curso temporal de la proliferación celular para PANC-1 (a) las células transfectadas con bi-shRNA
mousePDX-1 y bi-shRNA
humanPDX-1, respectivamente. Una comparación de los porcentajes de inhibición de la proliferación celular entre bi-ARNhc shRNA transfección y en diferentes dosis se muestra en las células PANC-1 (b).
En vivo
estudios.
Un modelo de ratón SCID PANC-1 xenotrasplante se ha desarrollado y se ha estudiado bien en nuestro laboratorio; cuando se coloca por vía intraperitoneal en ratones SCID, las células PANC-1 se convirtieron en tumores grandes dentro de los dos meses. Dos semanas después de la implantación de las células, tres ciclos de bi-shRNA
humanPDX-1 lipoplexos (35 mg /ratón, administrado por vía intravenosa en los días cero, 14 y 28) redujo significativamente PANC-1 volumen del tumor con sólo unos pocos ratones que tienen tumores residuales con un promedio de 51 mm
3 en comparación con el 100% de los ratones de control con tumores con un promedio de 1.199 mm
3 a 90 días después del tratamiento (P & lt; 0.05; Fig. 3A). La supervivencia en el grupo de tratamiento fue significativamente mayor que los controles (115 ± 9.5D vs 85 ± 1.4d, respectivamente, (p = 0,001; Fig. 3B), sin diferencia significativa en la supervivencia entre los ratones tratados con el vector vacío y los ratones no tratados (85 ± 9d vs 76 ± 8d, p = 0.981). en los ratones con tumores residuales, tumor expresión PDX-1 se redujo significativamente de 95 ± 11,1% a 12 ± 1,3% en los días 0 y 90 post-tratamiento, respectivamente (Fig. 3c panel superior). IHC análisis de los tumores residuales reveladas disminución de la expresión de marcadores de proliferación celular, el antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA) y ciclina e, (desde 84 ± 9,6% a 15 ± 0,8% y de 66 ± 10,2% a 9 ± 2,3% , respectivamente;... la figura 3c 2
ª y 3
paneles DR) y un aumento de la expresión de p53 (figura 3c 4
ª panel) Marcado apoptosis se observó en los tumores residuales en el día 90 post tratamiento, lo que sugiere que los tumores residuales se compone de células apoptóticas que carecen de PDX-1 de expresión. (Fig. Panel 3c parte inferior). Sorprendentemente, tres ciclos de bi-shRNA
humanPDX-1 lipoplexos no tuvieron ningún efecto sobre los niveles de glucosa e insulina sistémicos , lo que subraya la importancia del diseño específico de la especie de PDX-1 RNAi (Fig. S1).
El volumen del tumor fue evaluado y comparado a los 90 y 120 días después del tratamiento inicial entre los grupos de tratamiento y de control (a). Las tasas de supervivencia de los ratones que recibieron tratamiento y de los que recibieron el control de vector vacío se analizaron mediante Kaplan-Meier en SPSS (b). La inmunotinción para diapositivas tumorales con PDX-1, PCNA, ciclina E, y P53, así como el ensayo TUNEL se realizaron y se analizaron (c). Lo positivo para cada marcador se indica por la flecha (x200).
Estos datos demuestran que múltiples ciclos de sistémica bi-shRNA
humanPDX-1 lipoplexos fueron bien tolerados y reducen eficazmente el cáncer de páncreas humano el volumen del tumor y la supervivencia prolongada en ratones SCID. Estos datos demuestran que la PDX-1 es un objetivo potencial uso de esta plataforma terapéutica para la forma más agresiva de la neoplasia de páncreas.
Orientación PDX-1 con bi-shRNA
mousePDX-1 controla la excesiva secreción de insulina a partir de células de insulinoma de ratón y en un modelo de ratón de insulinoma
in vitro
estudios.
bi-shRNA
mousePDX-1 dieron como resultado significativamente mayor caída de PDX- 1 expresión en células beta TC-6 a dosis de 0,6 mg y 1,2 mg de medio /ml de shRNA
mousePDX-1 y los controles de vector vacío, tanto en transferencia de western (Fig 4a;. p & lt; 0,05) e inmunohistoquímica (IHC) analiza (Fig. 4b panel superior).
Comparación de la eficacia de la bi-shRNA
mousePDX-1, shRNA
mousePDX-1 o el vector vacío en la inhibición de la PDX-1 β expresión en TC-6 las células se muestra mediante Western blot (a) y la inmunotinción de células (panel superior, b como se indica por la flecha). la expresión de insulina y glucosa estimulada la secreción en respuesta a desmontables de PDX-1 se muestra mediante inmunotinción de células (panel inferior, b como se indica por la flecha) (× 200) y ELISA de ensayo (d), respectivamente. Cada experimento se repitió cinco veces. expresión PDX-1 y la insulina en las células beta inmunote~nido TC-6 se cuantifican (c). PDX-1 de expresión afectó a la expresión del indicador RIP-dirigida (RIP-mCherry) en βTC-6 celdas (E y F). Las células que expresan mCherry (rojo) y GFP (verde) se visualizaron y se fotografiaron usando microscopía de fluorescencia (e y f). (× 200).
bi-shRNA
mousePDX-1 resultó en significativamente mayor inhibición de la expresión de insulina y PDX-1 de expresión que la observada con shRNA
mousePDX-1 y el vector vacío las células de control, respectivamente (Fig 4c, P & lt;.; 0,05; y la figura 4b.). La transfección con bi-shRNA
mousePDX-1 como resultado significativamente mayor inhibición de la secreción de insulina estimulada por glucosa a partir de β-TC 6 células
in vitro
en comparación con la observada con shRNA
mousePDX-1 y vacío controles de vectores en las concentraciones de glucosa de 5 y 11 mM (P & lt; 0,05), respectivamente (Fig 4d.). Estos hallazgos indican que la bi-shRNA
mousePDX-1 inhibe la expresión y secreción de insulina a través de PDX-1 desmontables, y lo hacen en un grado mayor que shRNA convencional
mousePDX-1 en células de insulinoma de ratón.
Para definir con mayor precisión el mecanismo por el cual desmontables de PDX-1 inhibe la expresión y secreción de insulina a través de la activación reducida de insulina de rata promotor-1 (RIP), el reportero construye (RIP-mCherry) con o sin shRNA
mousePDX-1 se transfectaron en células beta TC-6. RIP-mCherry-H1-shRNA
mousePDX-1 resultan en una disminución significativa en la expresión mCherry en comparación con la de RIP-mCherry sin shRNA
mousePDX-1 (10 ± 1,6% frente a 35 ± 8,1% y 12 ± 2,1 % vs 66 ± 13,2% a las 24 h y 48 h, respectivamente, P & lt; 0,05; Fig. 4E). La transfección de RIP-mCherry-CMV-eGFP-H1 reveló que 90% de las células fueron transfectadas con éxito, como se evidencia por la expresión de eGFP. Además, el 69% de las células que expresan eGFP-expresó mCherry, y en RIP-mCherry-CMV-eGFP-H1-shRNA
mousePDX-1 células transfectadas, el 88% de las células expresó eGFP; Sin embargo, sólo 12% de las células expresó mCherry (p & lt; 0.05; Fig. 4f). Disminución de la expresión PDX-1 se confirmó mediante Western blot. Estos datos sugieren que la activación del promotor de insulina se inhibe significativamente por shRNA
mousePDX-1 a través de desmontables de PDX-1 de expresión.
transfección con bi-shRNA
mousePDX-1 en β TC-6 células dado lugar a una supresión significativa de la proliferación celular utilizando ensayo de dos diferentes: el ensayo MTS revelaron reducciones de 52%, 38% y 31% frente a los controles de vectores vacíos a las 24, 48, y 72 h después de la transfección, respectivamente (figura 5a). , y el ensayo de incorporación de BrdU reveló reducciones de 42%, 35%, y 42% a los 12, 24, y 48 h después de la transfección, respectivamente, (Fig 5b.) (p & lt; 0,05 en todos los puntos de tiempo). bi-shRNA
mousePDX-1 dio como resultado una mayor inhibición de la proliferación celular de shRNA
mousePDX-1 a dosis bajas (6 ug /10 cm de placa) después de 48 h de transfección (Fig. 5c). el análisis de proteínas del ciclo celular demostró una mayor regulación a la baja de los reguladores positivos, ciclina E, Cdk2 y Cdk4, y sobre regulación de los reguladores negativos, p53 y p27, en bi-shRNA
mousePDX-1 tratados con células en comparación con la de controles de vector vacío (P & lt; 0.05; Fig. 5d). Estos datos demuestran que PDX-1 desmontables inhibe la proliferación celular insulinoma ratón a través de alteraciones en proteínas del ciclo celular.
ensayo MTS mostró el curso temporal de la proliferación celular para TC-6 β (a) las células transfectadas con bi-shRNA
mousePDX-1 y bi-shRNA
humanPDX-1, respectivamente. Una comparación de los porcentajes de inhibición de la proliferación celular entre bi-shRNA y transfección shRNA a diferentes dosis se muestra en las células beta TC-6 (b). La proliferación celular determinada por BrdU también se muestra (c). El análisis de transferencia Western de lisado de 20 ug de ß TC-6 células que fueron transfectadas con shRNAi
mousePDX-1 después de 48 h se realizó con anti-PDX-1, ciclina E, CDK2, Cdk4, p53 y p27 (d).
En vivo
estudios.
Antes, nuestro laboratorio ha desarrollado un modelo de ratón insulinoma letal, que ha sido bien estudiado. ratones SCID son implantados con células de insulinoma de ratón y sucumben a la hiperinsulinemia e hipoglucemia en aproximadamente 60 días. En este modelo de ratón, tres ciclos de cualquiera intravenosa bi-shRNA
mousePDX-1 lipoplexos (25 ug /ratón cada dos semanas) o shRNA
mousePDX-1 lipoplexos (35 ug /ratón cada dos semanas) impidió la muerte de hiperinsulinemia e hipoglucemia ( Fig. 6a y b, y c y d, respectivamente). Se observaron hiperglucemia transitoria y la hiperinsulinemia, pero los niveles volvieron a los valores basales en el día 150 después del tratamiento inicial en ambos grupos de tratamiento. En el grupo control, lipoplexes vector vacío no tuvieron efecto sobre la hiperinsulinemia e hipoglucemia letal, como se muestra en la Fig. 6a y b.
Los niveles de glucosa A y C correspondientes a los niveles de insulina B y D fueron adquiridas de la β-TC 6 ratones tratados con bi-shRNAi
mousePDX-1 o shRNAi
mousePDX-1 , respectivamente. En cada figura A-d, la línea de trazos representa los datos de grupo de control y la línea de puntos y trazos representa los datos del grupo de tratamiento. células de los islotes que expresan PDX-1, insulina, PP, PCNA, p27, ciclina E y CDK4 se muestra mediante IHC y apoptosis de las células de los islotes se demostró mediante el ensayo TUNEL, como se indica por las flechas (× 200) (e). supervivencia de los ratones después de tres ciclos de tratamiento de uno u otro vector vacío o bi-shRNAi
mousePDX-1 y el vector vacío o shRNAi
mousePDX-1 se evaluaron y se compararon mediante Kaplan-Meier en SPSS (f).
la supervivencia global en el bi-shRNA
mousePDX-1 y shRNA
mousePDX-1 grupos de tratamiento fue significativamente mayor que la de los controles (106 ± 7.8d vs 53 ± 1.4d y 146 ± 9.5D vs 53 ± 1.4d, respectivamente, p & lt; 0,05 vs controles, la figura 6f, Fig S2)... Es de señalar que la diferencia insignificante en la supervivencia entre los dos grupos de tratamiento fue debido a sacrificio intencional de la bi-shRNA
mousePDX-1 grupo de ratones en un punto de tiempo anterior (Fig. S2f). Estos datos demuestran que PDX-1 desmontables utilizando sistémicos bi-shRNA
mousePDX 1-lipoplexes impide eficazmente la muerte hiperinsulinemia, hipoglucémico en un modelo de ratón SCID insulinoma; Por lo tanto, los tratamientos de control de la secreción hormonal excesiva asociada con este tipo de neoplasia de los islotes.
Sorprendentemente, sistémica bi-shRNA
mousePDX-1 y shRNA
mousePDX-1 lipoplexos dan lugar a la hiperglucemia temporal, lo que representa una predecible efecto fuera del objetivo en islotes de ratón, desde PDX-1 es el regulador predominante de la expresión de insulina. Después del tratamiento con bi-shRNA
mousePDX-1,
In situ
islotes PDX-1 de expresión se redujo de manera dependiente de tratamiento, de 88 ± 10,1% en el día 0 al de 71 ± 8,6%, 49 ± 9,7% y 23 ± 6,6% en los días 7, 21, 35 después de los tratamientos, respectivamente, y vuelto a 83 ± 12,4% en el día 120 después de los tratamientos, como se muestra en la Fig. 6e, panel superior. la expresión de insulina también se redujo significativamente de 92 ± 8.3% en el día 0 a 61 ± 9,8%, 32 ± 5,3%, y 12 ± 1,9% en los días 7, 21, 35 después de los tratamientos, respectivamente, y volvió a 89 ± 15,3% en día 120 después de los tratamientos, como se muestra en la Fig. 6e, 2
nd panel. Los niveles de expresión de PP también se redujo significativamente en los mismos puntos de tiempo después del tratamiento (Fig. 6e, 3
Panel rd). Los marcadores de la proliferación de las células de los islotes, las proteínas del ciclo celular y la apoptosis también se estudiaron-tratamiento previo y posterior. expresión Islet PCNA se redujo significativamente de 16 ± 1,4% a 10 ± 0,8%, 7 ± 0,6%, 5 ± 0,2% y 14 ± 2,0% en los días 0, 7, 21, 35 y 120 después de los tratamientos, respectivamente (Fig. 6e, 4
ª panel). Tanto IHC y Western Blot análisis de secciones de páncreas demostró aumento de la expresión de p27 y la disminución de la expresión de los niveles de proteína en la ciclina E y Cdk4 tras tres ciclos de tratamiento (Fig. 6E, 5
th, 6
º y 7
th paneles, y la Fig. S3, respectivamente). bi-shRNA
mousePDX-1 resultó en un aumento significativo en la apoptosis de los islotes de ratones de 1 ± 0,2% en el día 0, a 14 ± 2,4%, 24 ± 3,6%, 42 ± 5,5%, y 10 ± 1,1% en los días 7, 21, 35 y 120 después de los tratamientos, respectivamente (Fig. 6e panel inferior). terapia de control de vector vacío no tuvo efecto sobre los islotes PDX-1, insulina, expresión PP, las proteínas del ciclo celular y la apoptosis. Estos datos son consistentes con los hallazgos observados después PDX-1 desmontables en las células de insulinoma ratón
in vitro
. También sugieren que sistémica bi-shRNA
PDX-1 lipoplexes resultan en temporal, la hiperglucemia leve que emana de supresión de PDX-1 dentro de los islotes de Langerhans con supresión posterior de la insulina y la expresión de PP, que se correlaciona con alteraciones en las proteínas del ciclo de células de islotes y el aumento de la apoptosis de los islotes.
la expresión de todos los marcadores de los islotes volvió a los valores basales en el sacrificio, lo que sugiere una capacidad de regeneración de islotes murinos, lo que resulta en la normalización de los niveles de insulina y glucosa basales. Esto está en contraste con los PANC-1 de células tumores residuales que tenían bajos niveles de PDX-1 y marcadamente elevada apoptosis, lo que sugiere una falta de regeneración. Patrones similares de expresión de PDX-1, insulina, PP, y las proteínas del ciclo celular y la apoptosis en células de los islotes también se observaron después de tres ciclos de shRNA
mousePDX-1 lipoplexes (Fig. S4). Estos datos demuestran que sistémicas bi-shRNA
mousePDX-1 lipoplexos prevenir efectivamente la muerte de hipoglucemia en un modelo de ratón SCID insulinoma y el resultado en
In situ
desmontables de PDX-1 dentro de los islotes, lo que lleva a la supresión de la insulina expresión y secreción y posterior hiperglucemia. Sorprendentemente, los efectos de los islotes fuera de objetivo fueron leves y temporales, lo que sugiere una capacidad de regeneración del páncreas endocrino murino. Puesto que no hay células de insulinoma residuales que se encuentran en este modelo después de la terapia, los datos demuestran la capacidad de los islotes del tratamiento administrado sistémicamente a desmontables PDX-1 en este modelo.
sistémica shRNA
mousePDX 1-lipoplexes revertir la hiperinsulinemia e hipoglucemia y alterar tolerancia a la glucosa en los subtipos de receptores de somatostatina 1 y 5 (SSTR
1/5
- /-) ratones knockout
El SSTR1 /5
- /- modelo de ratón se usó como los ratones representan un modelo de ratón insulinoma-como-inmune competente con sobreexpresión de PDX-1 en las células acinares y células de los islotes, ofrecido con hiperinsulinemia e hipoglucemia. Queríamos determinar si múltiples tratamientos intravenosos podrían revertir la hiperinsulinemia basal y la hipoglucemia y ser tolerado en estos ratones inmunocompetentes. Tres ciclos de shRNA
mousePDX-1 lipoplexos (35 ug /ratón) fueron bien toleradas y revirtió la hiperinsulinemia basal y la hipoglucemia en SSTR significativamente
1/5
- /- ratones (3 ± 0,2 ug /l y 83 ± 19,5 mg /dl en el día 0 y 0,5 ± 0,1 ug /l y 205 ± 25,9 mg /dl en el día 35 después de tres tratamientos, respectivamente, como se ve en la figura 5a y b.); lipoplexes vector vacío no tuvieron efecto sobre la hiperinsulinemia e hipoglucemia (Fig. 7a y b). Sorprendentemente, los niveles de glucosa e insulina sistémicos volvieron a la línea de base en el día 150 después del tratamiento inicial, lo que sugiere una capacidad de regeneración de estos islotes murinos.
Los niveles de glucosa (a) y los correspondientes niveles de insulina (b) se midieron como se describe en la sección de métodos. La inmunotinción para diapositivas pancreáticas con PDX-1, se realizaron PCNA y ensayo de TUNEL. tinción con rojo en el panel superior de (c) indica PDX-1 de expresión (flecha); tinción verde en el panel medio (c) indica la expresión de PCNA (flecha). células tumorales apoptóticas de SSTR1 /5
- /- ratones se tiñen de color marrón y se muestran en el panel inferior de (c) (flecha) (× 200). ensayo IPGTT mostró niveles y los niveles de insulina (d) de la glucosa en el día 7 y los niveles de glucosa y los niveles de insulina (e) en el día 150 después de shRNA
mousePDX-1 terapia. Los datos se presentan como medias ± S.E.M. y P & lt; 0,05 indican significancia
pruebas de tolerancia a la glucosa intraperitoneal (IPGTT) se realizaron en SSTR
1/5
- /- ratones en los días 7 y 150 después de la.