Extracto
PFTK1, también conocido como PFTAIRE1, CDK14, es un nuevo miembro de las proteínas quinasas serina /treonina relacionadas con Cdc2. Estudios recientes muestran que PFTK1 es altamente expresado en varios tumores malignos tales como carcinoma hepatocelular, cáncer de esófago, cáncer de mama, y participa en la regulación de ciclo celular, los tumores de la proliferación, la migración y la invasión que influyen aún más el pronóstico de los tumores. Sin embargo, la expresión y fisiológica significado de PFTK1 en el cáncer gástrico siguen sin estar claros. En este estudio, hemos analizado la expresión y la importancia clínica de PFTK1 por Western blot en tejidos frescos 8 emparejado con cáncer gástrico, los tejidos de la mucosa gástrica nontumorous e inmunohistoquímica en 161 rodajas y embebidas en parafina. La expresión de alto PFTK1 se correlacionó con el grado tumoral, la invasión de los ganglios linfáticos, así como Ki-67. A través de Kit Recuento celular (CCK) -8 ensayo, citometría de flujo, ensayos de formación de colonia, cicatrización de heridas y transwell, los estudios in vitro demostraron que la sobreexpresión PFTK1 promovió la proliferación, la migración y la invasión de células de cáncer gástrico, mientras que PFTK1 caída condujo a los resultados opuestos. Nuestros resultados, por primera vez el apoyo que PFTK1 podría desempeñar un papel importante en la regulación de la proliferación del cáncer gástrico, la migración y proporcionaría una nueva estrategia terapéutica prometedora contra el cáncer gástrico humano
Visto:. L Yang, Zhu J, Huang H, Yang Q, Cai J, Wang Q, et al. (2015) PFTK1 promueve la progresión del cáncer gástrico por la regulación de la proliferación, migración e invasión. PLoS ONE 10 (10): e0140451. doi: 10.1371 /journal.pone.0140451
Editor: Keping Xie, la Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center, Estados Unidos |
Recibido: May 7, 2015; Aceptado: September 25, 2015; Publicado: 21 Octubre 2015
Derechos de Autor © 2015 Yang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación de Ciencias Naturales de China (Nº 81302285, Nº 81402015)
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que existen conflictos de intereses.
Introducción
el cáncer gástrico es el cuarto tumor maligno más común y la segunda causa principal de muerte por cáncer en todo tipo de cánceres en todo el mundo [1]. Es difícil de curar a menos que se encuentra en una etapa temprana [2]. Debido a la falta de especificidad, la tasa de diagnóstico precoz es baja y la mayoría de los pacientes con cáncer gástrico son en la etapa de mediana tarde cuando diagnóstico. 40% -60% de los pacientes con cáncer gástrico recibida operación radical cáncer gástrico tendrá a menudo la recurrencia postoperatoria y la metástasis, estas características afectan seriamente la supervivencia a largo plazo en pacientes con cáncer gástrico [3,4]. A pesar del gran avance de las nuevas estrategias de diagnóstico y tratamiento del cáncer gástrico, los mecanismos moleculares exactos de cáncer gástrico sigue siendo poco entienden. Por lo tanto, la identificación del mecanismo molecular durante la progresión del cáncer gástrico y metástasis puede proporcionar a los pacientes con las estrategias de diagnóstico y terapéuticos.
PFTK1 (también conocido como PFTAIRE1, CDK14) es un nuevo miembro de la serina /treonina relacionadas con Cdc2 proteínas quinasas que se identificaron por primera vez en el sistema nervioso de ratón y es un regulador esencial de las ciclinas y del ciclo celular [5,6]. Pocos estudios se han realizado para caracterizar su función fisiológica o importancia biológica. Se ha informado de que PFTK1 es altamente expresado en el cerebro, páncreas, riñón y ovario. CDK se unen a la caja de ciclina específica para formar complejos de proteína quinasa funcionales y regulada en parte por su localización subcelular [7]. Por ejemplo, la ciclina Y, una novela ciclina asociada a la membrana, interactúa con PFTK1 mejora la actividad de la quinasa PFTK1 y recluta PFTK1 a la membrana plasmática [8]. PFTK1 interactúa con ciclina B2 co-localización en el núcleo en el carcinoma hepatocelular [9]. La función fundamental de PFTK1 se informa como una quinasa dependiente de ciclina (CDK) regulación de la progresión del ciclo celular y la proliferación celular al interactuar específicamente con los miembros de las proteínas de ciclina tales como la ciclina D3 (CCND3), ciclina Y (CCNY) y forma un complejo ternario con el inhibidor de la p21 del ciclo celular, por lo que fosforila la Rb supresora de tumores de transición G1 /S [10]. Knockout ciclina Y en líneas celulares de glioma hace que el ciclo celular bloqueado en fase S [11]. Ciclina Y interactúa con PFTK1 ajustar la fase M de la mitosis [12]. Estos hallazgos juntos implican que PFTK1 puede funcionar como un promotor de tumores a través de la regulación del ciclo celular. Mientras tanto, varios estudios demuestran que PFTK1 también tiene otras funciones importantes. PFTK1 modula la diferenciación de oligodendrocitos a través de la vía PI3K /AKT [13]. Recientemente PFTK1 confiere la motilidad celular HCC a través de la inactivación de la función de supresión de móviles de unión a actina de TAGLN2 través de la fosforilación [14]. PFTK1 mediada por fosforilación permite asociación de CAD para filamentos de F-actina, lo que resulta en la mejora de la polimerización de las fibras de estrés de actina, promoviendo así la migración celular y la invasión en las células de HCC [15,16]. La sobreexpresión de PFTK1 puede conferir un fenotipo móviles en hepatocitos malignos [9]. De acuerdo con los hallazgos moleculares, CCNY y /o PFTK1 el único que puede activar la señalización de Wnt no canónica para mejorar la movilidad celular en células de HCC [17]. Todos estos estudios implican que PFTK1 puede estar implicada en la proliferación celular y la motilidad, sin embargo, la expresión y la importancia de PFTK1 en células de cáncer gástrico son todavía oscuros.
En nuestro estudio, que tuvo como objetivo realizar un análisis exhaustivo de PFTK1 expresión y su papel pronóstico de células de cáncer gástrico. Se examinó la expresión de PFTK1 y su asociación con características clínicas y Ki-67 por Western blot e inmunohistoquímica (IHC). Nuestro estudio demostró que PFTK1 mejora la proliferación, la migración y la invasión de células de cáncer gástrico por CCK-8, el flujo de análisis de citometría, análisis de la formación de colonias, transwell ensayo, afectó a la expresión de proteínas relacionadas. Estos hallazgos fueron reportados en primer lugar en las células de cáncer gástrico y pueden proporcionar una nueva visión en el desarrollo de terapias experimentales en el cáncer gástrico.
Materiales y Métodos
Las muestras de tejido
Ciento sesenta -uno muestras de tejido de cáncer gástrico y los tejidos adyacentes no cancerosos emparejados fueron seleccionados de pacientes que se sometieron a cirugía entre 2007 y 2013 en el Departamento de Patología, hospital de Tumores de Nantong. Estos tejidos fueron almacenadas a -80 ° C inmediatamente después de la extirpación quirúrgica. Para el examen histológico, todas las muestras de tejido gástrico fueron fijadas en 10% formalina tamponada y embebidos en parafina para seccionar. especímenes resecados fueron clasificados de acuerdo a la séptima edición de la Clasificación TNM para el cáncer gástrico [1] .Todas la información clínico-patológica incluyó la edad, el género, la profundidad de infiltración, estado de diferenciación, invasión ganglionar, la invasión del nervio y el estadio TNM. La aprobación de los tejidos extraídos con fines de investigación se obtuvo a partir del Hospital de Tumores Comité de Ética de Nantong. consentimiento informado firmado también se obtuvo de cada paciente. Las principales variables clínicas y patológicas se resumen en la Tabla 1.
Western blot
prueba de Western blot se utilizó para detectar algunas proteínas [18-20]. En primer lugar, los tejidos Caner gástricas y las células fueron rotas en tampón de lisis (1 M Tris-HCl pH 7,5, 1% de Triton X-100, 10% de sulfato de sodio (SDS), 1% NP-40, 0,5 M EDTA, 0,5% de sodio desoxicolato, 10 mg /ml de aprotinina, PMSF 1 mM, 10 mg /ml de leupeptina) y después se centrifugó a 10.000 × g durante 30 min para recoger el sobrenadante. El sobrenadante se diluyó en 2 x tampón de carga de SDS y se hirvió. Una cantidad equivalente de proteínas de cada muestra se sometieron a electroforesis en un 10% de sodio dodecil electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) y después se transfirió a un fluoruro de polivinilideno (PVDF) membrana (Millipore, Bedford, MA). Después de eso, las membranas fueron bloqueadas durante aproximadamente 2 h a temperatura ambiente y después se incubaron durante la noche a 4 ° C con los anticuerpos primarios. Después de lavar con solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene 0,1% de Tween 20 tres veces, cada una durante 5 minutos, las membranas fueron incubadas con IgG unido a la peroxidasa de rábano picante como anticuerpo secundario durante otras 2 h a temperatura ambiente. Las membranas fueron desarrollados usando los sistemas de detección ECL (Imaging Technology, Ontario, Canadá). Los anticuerpos utilizados en este estudio fueron: anti-PFTK1 (1: 500, Santa Cruz Biotechnology), anti-ciclina E (1: 500, Santa Cruz Biotechnology), anti-PCNA (1: 1.000, Santa Cruz Biotechnology), anti- GAPDH (1: 1000, Sigma), anti-β-catenina (1: 1.000, Santa Cruz Biotechnology), anti-DVL1 (1: 600, Santa Cruz Biotechnology), anti-Dvl2 (1: 600, Santa Cruz Biotechnology), anti-Naked1 (1: 500, Señalización celular), anti-MMP-2 (1: 500, Santa Cruz Biotechnology).
análisis inmunohistoquímico
en resumen, las secciones de tejido se dewaxed en xileno y rehidratada a través de etanoles graduales. A continuación, las secciones inactivaron en 3% de peróxido de metanólico durante aproximadamente 10 min para bloquear la actividad peroxidasa endógena. Por alta presión y temperatura en un autoclave, su inmunorreactividad se mejoró en tampón citrato 0,1 M durante 3 min. Las secciones de tejido se incubaron con el anticuerpo anti-PFTK1 (1: 100, Santa Cruz Biotechnology) y anti-Ki-67 (1: 400, Santa Cruz Biotechnology) durante 120 minutos a temperatura ambiente. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, después de lavar en solución salina tamponada con fosfato (PBS), los tejidos se incubaron con rábano picante polímero anti-Ig de ratón conjugado con peroxidasa como segundo anticuerpo (kit Envision, Dako) durante 20 min a temperatura ambiente. Por último, las diapositivas se counterstained con hematoxilina, se deshidrataron y se montaron en el monte de resina. Para cuantificar PFTK1 y Ki-67 expresión de la proteína, tanto la extensión de la inmunorreactividad y la intensidad fueron evaluados y anotó. Cinco campos de alta potencia fueron elegidos al azar para cada sección y al menos 300 células fueron contadas por campo. Para el análisis estadístico de PFTK1, cada diapositiva se evaluó usando un sistema de puntuación semicuantitativo tanto para la intensidad de la mancha y el porcentaje de células malignas positivas. Las células se puntuaron como sigue: 1 (células tumorales teñidas ≤25%), 2 (26% de células tumorales -50% teñido), 3 (51% de células tumorales -75% teñido), 4 (76% de células tumorales -100% manchado). Para la evaluación de densidad: 1 tinción débil; 2 tinción moderada; 3 tinción fuerte. Luego multiplicamos los dos puntajes y se clasificaron en dos grupos: expresión baja y alta expresión. En cuanto a análisis estadístico de Ki-67, & lt; 50% de células tumorales teñidas tan bajo expresión y ≥ 50% de células tumorales teñidas tan alta expresión. Con el fin de evitar errores técnicos, la tinción se repitió tres veces y se obtuvieron resultados similares.
cultivos de células y transfección transitoria
MGC803 y HGC27 eran líneas de células gástricas, que se adquirieron de la biblioteca de células de la Academia china de Ciencias. Ambos fueron cultivadas en medio RPMI-1640 (Gibco-BRL, Grand Island, NY, EE.UU.). SGC7901 y GES1 eran otro líneas de células gástricas, que fueron amablemente proporcionados por el Departamento de Patología de Investigación de la Universidad de Nantong. SGC7901 y GES1 se cultivaron en medio DMEM (Gibco-BRL, Grand Island, NY, EE.UU.). Todo el medio se hicieron con suero bovino fetal al 10% (Gibco-BRL, Grand Island, NY, EE.UU.) suplementado con 2 mM de L-glutamina, 100 U /mezcla de penicilina-estreptomicina ml (Gibco-BRL, Grand Island, Nueva York, EE.UU. ), a 37 ° C y 5% de CO
2. PFTK1 interferentes pequeños ARN (siRNA) se han diseñado y sintetizado por Shanghai Genechem (República Popular China). El siRNA dirigidos a secuencias PFTK1 fueron como sigue: 5'-GTTCATTCTTTACCACATT-3 ', 5'-AGGTTGCATCTTTGTTGAA-3', 5'-AAAGAGTCACCTAAAGTTA-3 ', 5'-ACCCATACAGGAAATCCAA-3'. El plásmido Bandera-PFTK1 fue adquirido de Shanghai Genechem (República Popular China). Se utilizó Lipofectamine 2000 reactivo de transfección (Life Technologies) para las células de la transfección, siguiendo las instrucciones del fabricante.
El análisis de citometría de flujo
En primer lugar, todas las líneas de células gástricas fueron fijadas en etanol al 70% durante la noche a -20 ° DO. segundo, después de lavado por tampón de citrato-fosfato y PBS, las células se incubaron con 1 mg /ml ARNasa A durante 30 minutos a 37 ° C. A continuación, las células se tiñeron con 50 mg /ml de yoduro de propidio en tampón fosfato salino (PBS) -Triton durante otros 20 min a 4 ° C. Finalmente, las células se analizaron mediante el uso de un flujo Becton Dickinson FACScan citómetro de BD (San Jose, CA) y los programas de análisis de adquisición CellQuest. El experimento se realizó tres veces.
ensayos de formación de colonias
MGC803 células se cultivaron en placas de cultivo de seis pocillos (Corning Inc, Corning NY) a una densidad de 200 células /pocillo después de la transfección de PFTK1 #siRNA y Flag-PFTK1 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de dos semanas, las colonias de células (≥ 50 células /colonia) se contaron por tinción con 0,5% de cristal violeta.
Ensayos de proliferación celular
MGC803 células que incluían normales, la transfección de PFTK1#siRNA y Flag-PFTK1 se sembraron en placas de racimo de cultivo de células de 96 pocillos (Corning Inc, Corning NY) a una densidad de 2 × 10
4 células /pocillo en 100 l de cultivo y se hicieron crecer durante la noche. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, se midieron las células usando un comercial de CCK-8 (Dojindo, Kumamoto, Japón). CCK-8 reactivos se añadieron a cada pocillo durante 2 h de incubación a 37 ° C. La absorbancia se leyó a la longitud de onda de 450 nm en un lector de placas automatizado. Los experimentos deben repetir por lo menos tres veces.
curación de heridas ensayo
MGC803 células se cultivaron en placas de cultivo de seis pocillos (Corning Inc, Corning NY) a una densidad de 5 × 10
5 células /pocillo y se cultivan hasta la confluencia durante la noche. Después transfectadas 48 horas, las células se incubaron con medio libre de suero. Una línea estaba rayado dentro de la capa de células Conflent utilizando el extremo fie de una punta de pipeta de 10 ml (tiempo 0) y las células se lavaron con PBS. Imágenes de células que migran se tomaron secuencialmente después de 24 h, 48 h durante el cierre de la región heridos.
Trans-así ensayo de migración
ensayo de migración celular se realizó utilizando transwell cámara (tamaño de poro 8,0 lm ; Costar, Cambridge, Nueva York, EE.UU.). Acerca de 1 × 10
se sembraron 5 células /ml en las cámaras superiores en el medio, y se añadió RPMI-1640 a las cámaras inferiores. Después de 24 h, las células principales que no se migraron se retiraron y las células de fondo que se han migrado se fijaron con paraformaldehído y se tiñeron con cristal violeta. El número de células que migran en 5 campos fue contado por debajo de 200 × magnificación, y se determinaron los medios para cada cámara. Todos los experimentos se repitieron tres veces |
Trans-así ensayo de invasión
ensayo de migración celular se realizó utilizando transwell cámara (8,0 lm tamaño de poro; Costar, Cambridge, Nueva York, EE.UU.).. BD MatrigelTM membrana basal para la matriz se añadió a la cámara superior durante 1 hora a 37 ° C. Entonces, 500 l de medio que contiene el factor quimiotáctico se colocó en la cámara inferior. Acerca de 1 × 10
5 Se sembraron las células /ml en las cámaras superiores a 37 ° C durante 24 h.Cells fueron fijadas con paraformaldehído y se tiñeron con cristal violeta. Todos los experimentos se repitieron tres veces.
El análisis estadístico
Todos los análisis estadísticos se se realizaron utilizando las estadísticas SPSS 19 paquete de software. El PFTK1, Ki-67 expresión y las características clínico-patológicas se analizaron mediante el χ
2 test. curvas de supervivencia global se calcularon con el método de Kaplan-Meier y se pusieron a prueba con la prueba de log-rank. El análisis multivariante se analizó mediante el modelo de riesgos proporcionales de Cox, el riesgo relativo y su intervalo de confianza del 95% se registran para cada marcador. Los valores se expresan como media ± SE, y
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
PFTK1 se sobreexpresa en los tejidos tumorales gástricas
Se informa que PFTK1 es una quinasa dependiente de ciclina importante que puede regular el ciclo celular, pero la investigación sobre el cáncer gástrico nunca ha sido estudiado. Desde la sobreexpresión de PFTK1 se encontró en el cáncer de hígado y cáncer de esófago en comparación con los tejidos normales. Por lo que es interesante para el análisis de la expresión de PFTK1 en los tejidos tumorales gástricas y su coorelation con antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA). En primer lugar, se analizó la expresión de PFTK1 en 8 pares de tejidos tumorales gástricas y sus correspondientes tejidos de las mucosas gástricas nontumorous por Western blot. Como se muestra en la figura 1, en comparación con los tejidos normales adyacentes, se detectó la regulación positiva de PFTK1 en los ocho tejidos gástricos en acuerdo con PCNA. Con el fin de confirmar la significación clínica de PFTK1 en la progresión del cáncer gástrico, inmunohistoquímica (IHC) Los análisis se utilizó para observar la expresión de la proteína en 161 PFTK1 tejidos de cáncer gástrico. Como era de esperar, la expresión de PFTK1 y el grado tumoral se relaciona negativamente. PFTK1 tenía una expresión significativamente mayor en las muestras de especímenes pobremente diferenciados en bien diferenciados, lo cual era consistente con Ki-67. PFTK1 se expresó en la membrana celular, mientras que el citoplasma, Ki-67, principalmente en el núcleo. El resultado se muestra en la figura 2. A continuación, se investigó la correlación entre PFTK1 y Ki-67 por el coeficiente de correlación de Pearson. Podemos ver en la figura 3A que PFTK1 se asoció positivamente con Ki-67 (γ de Pearson = 0,833,
P Hotel & lt; 0,001)
(A) El nivel de proteína PFTK1 fue alta en. ocho representante emparejado muestras de tejido de cáncer gástrico (T) en comparación con los tejidos adyacentes no tumorosas (N). GAPDH se utilizó como control de carga. (B) El gráfico de barras muestra la relación entre la proteína PFTK1 a GAPDH. La media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. (*
P Hotel & lt; 0,05 en comparación con el control de los tejidos adyacentes nontumorous).
(A-H) secciones de tejido embebidas en parafina se tiñeron con anticuerpos para PFTK1 y Ki-67 y de contraste con hematoxilina. (A, E) tinción negativa de PFTK1, Ki-67 en tejidos normales adyacentes (× 200); (B, F) débil tinción de PFTK1, Ki-67 en tejidos de cáncer gástrico bien diferenciadas; (C, G) tinción moderada de PFTK1, Ki-67 en tejidos de cáncer gástrico diferenciadas moderados; (D, H) fuerte tinción de PFTK1, Ki-67 en pobres cáncer gástrico tejidos diferenciados, amplificación (100 ×, × 400).
(A) Correlación entre PFTK1 y Ki-67 en la expresión cáncer gástrico tissues.The correlación entre PFTK1 y Ki-67 expresión se evaluó mediante la prueba de correlación de Pearson (r = 0,833,
P Hotel & lt; 0,001). análisis de supervivencia (B) de Kaplan-Meier de 161 pacientes con cáncer gástrico según el nivel de expresión PFTK1. De acuerdo con los porcentajes PFTK1, los pacientes fueron divididos en expresadores altos PFTK1 y expresadores bajas PFTK1. Y se mostró la mediana de supervivencia y cociente de riesgos instantáneos. Los pacientes en el grupo de alta expresión PFTK1 tuvieron una supervivencia global significativamente más corto (
P Hotel & lt; 0,01).
PFTK1 se asocia con características clínicas adversas y escasa supervivencia de tumores gástricos pacientes '
estudio de asociación clínica se exploró para analizar la correlación de PFTK1 con las características clínico-patológicas de cáncer gástrico entre 161 tejidos. Los datos clínico-patológicos se enumeran en la Tabla 1. La alta expresión de PFTK1 se relaciona con el grado del tumor (
P
= 0,009), la profundidad de la infiltración (
P
= 0,002), la invasión de los ganglios linfáticos (
P
= 0,000), así como Ki-67 (
P
= 0,000). Sin embargo, no hubo correlación entre la expresión PFTK1 y otras variables clínicas, como la edad, el género, la invasión de los nervios, y el estadio TNM
Además., Se utilizó el análisis de Kaplan-Meier para analizar la asociación entre la expresión PFTK1 y 161 la supervivencia de los pacientes. De acuerdo con las curvas de supervivencia, la alta expresión de PFTK1 fue obviamente correlacionado con la supervivencia global pobre, mientras que la baja expresión de PFTK1 se correlacionó con una mejor supervivencia global. Y la relación de la mediana del tiempo de supervivencia y el peligro se mostró en la figura 3B. Por otra parte, el análisis univariado en tejidos de cáncer gástrico mostró que el grado del tumor (
P
= 0,020), la profundidad de la infiltración (
P = 0,011
), la invasión de los ganglios linfáticos (
P =
0,011), el estadio TNM (p = 0,031), la expresión PFTK1 (
P
= 0,002), y Ki-67 expresión (
P = 0,013
) eran factores pronósticos de la supervivencia global (Tabla 2 ). El análisis multivariado mediante el modelo de riesgos proporcionales de Cox sugirió PFTK1 era un indicadores pronósticos independientes de la supervivencia global de los pacientes (
P = 0,048
, Tabla 3). En resumen, nuestros resultados demuestran que la expresión de PFTK1 se asocia significativamente con las características clínicas y la mala supervivencia global.
La expresión de PFTK1 en células de cáncer gástrico no transfectadas y transfectadas
Como PFTK1 se sobreexpresa en los tejidos tumorales gástricas, a continuación, analizamos la expresión de PFTK1 en líneas celulares incluyendo MGC803, SGC7901, HGC27, GES1. A partir de la figura 4A, la expresión de PFTK1 en la línea celular gástrica normal GES1 fue menor que en las líneas de células gástricas MGC803, SGC7901, HGC27. Para estudiar más a fondo la función de PFTK1 en células de cáncer gástrico
in vitro, España MGC803 células fueron transfectadas con siRNA y PFTK1-SGC7901 células fueron transfectadas con la bandera-PFTK1. Western blot se utilizó para medir la expresión PFTK1. Cuando la bandera-PFTK1 se transfectó en SGC7901, PFTK1 tenía una expresión más elevada (figura 4B). Mientras PFTK1-siRNA se transfectó en MGC803, PFTK1-siRNA#4 logra la más alta eficiencia caída en comparación con otros PFTK1-siRNA (Fig 4C). Así que elegimos la Bandera-PFTK1 y PFTK1-siRNA#4 para continuar los experimentos siguientes.
(A) El nivel de proteína en PFTK1 SGC7901, MGC803, HGC27, líneas celulares gástrico GES1. (B) células SGC7901 fueron transfectadas transitoriamente con Flag-PFTK1 plásmido como se ha descrito anteriormente para 48 h. El análisis de transferencia Western la expresión ectópica de PFTK1. MGC803 células (C) se transfectaron transitoriamente con PFTK1-siRNA#1, 2, 3, 4 para 48 h. Western blot desmontables expresión de PFTK1. El gráfico de barras muestra la relación entre la proteína PFTK1 a GAPDH. La media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. (*
P Hotel & lt; 0,05) guía empresas
PFTK1 puede promover las células migran e invasiva
in vitro
Se ha informado de PFTK1 sobreexpresión puede. aumentar la fosforilación de CAD y mejorar CaD de unirse a F-actins, que promueven hepatocelular células de carcinoma de migración [16]. Teniendo en cuenta que PFTK1 estaba relacionado con invasión ganglionar en muestras de cáncer gástrico, se estudió si PFTK1 gástrica podría afectar la migración de las células del cáncer y la invasión. Curación de heridas ensayos de ensayo y transwell mostró que la migración de las células Flag-PFTK1 se incrementó notablemente en comparación con las células de control. Por el contrario, la migración de PFTK1-siRNA#4 células se reduce en comparación con las células de control (Fig 5A y 5B). Además, los ensayos de invasión Matrigel también demostraron que la regulación al alza de PFTK1 por transfectar Bandera-PFTK1 podría avanzar en la capacidad invasiva y desmontables de PFTK1 podrían atenuar la capacidad invasiva de las células de cáncer gástrico (Figura 5C). En general, podríamos llegar a la conclusión de que PFTK1 promover la migración y la invasión de células de cáncer gástrico.
(A) La migración de las células transfectadas con Ctrl, Bandera-PFTK1, PFTK1-siRNA#4WAS examinados por ensayos de curación de heridas . La herida de las células se visualizó a 0 h, 24 h, y 48 h. la migración (B) de células transfectadas con Ctrl, Bandera-PFTK1, PFTK1-siRNA#4 se examinó mediante ensayos de trans-así. (C) La capacidad invasiva de células transfectadas con Ctrl, Bandera-PFTK1, PFTK1-siRNA#4 se examinó con cámaras de cultivo de células Matrigel. La parte izquierda mostró MGC803 células transfectadas con Ctrl, Bandera-PFTK1. La parte derecha mostró MGC803 células transfectadas con Ctrl, PFTK1-siRNA#4. Media ± desviación estándar de tres experimentos independientes (*
P Hotel & lt; 0,05). Estos resultados muestran la sobreexpresión de PFTK1 puede mejorar la migración y la invasión de las células, mientras que la precipitación PFTK1 reducir la migración y la invasión de las células.
Expresión de PFTK1 promover la proliferación de células de cáncer gástrico
De acuerdo con los resultados presentado arriba, PFTK1 se correlacionó positivamente con PCNA, Ki-67 expresión y el grado del tumor, que eran marcador de las células de proliferación. Se analiza el papel de PFTK1 en la regulación de la capacidad de proliferación. En primer lugar, MGC803 células fueron transfectadas con siRNA PFTK1-# 4, Flag-PFTK1 y se determinaron CCK-8 ensayo. La sobreexpresión de PFTK1 demostrado para mejorar la tasa de crecimiento de las células gástricas control, mientras que desmontables de PFTK1 mostró el resultado opuesto (figura 6A). De acuerdo con la mejora de la tasa de crecimiento celular después de la sobreexpresión PFTK1, ensayo de formación de colonias también mostró que podría aumentar la formación de colonias. Y desmontables de PFTK1 mostró el mismo resultado con CCK-8 de ensayo (Fig 6B). Por último, hemos explorado el mecanismo de proliferación de PFTK1 por análisis de citometría de flujo, y datos sugirieron que se encuentran células cancerosas más gástricos en la fase S en presencia de PFTK1 ectópico, se encontraron células de cáncer gástrico menos en la fase S en la transfección con PFTK1- siRNA#4 (figura 6C). En resumen, estos datos demuestran que PFTK1 participó en la regulación del ciclo celular mediante la aceleración de la transición G0 /G1 -S.
(A)
in vitro
Cell Counting Kit (CCK) se utilizó el ensayo -8 a examin crecimiento celular por absorbancia a 450 nm en el momento indicado. (Los datos son medias ± SD de tres experimentos independientes *
P
. & Lt; 0,05) Análisis (B) La formación de colonias de células transfectadas con MGC803 Ctrl, Bandera-PFTK1, PFTK1-siRNA#4. (C) Análisis del ciclo celular se indica tras transfectadas con Ctrl, Bandera-PFTK1, PFTK1-siRNA#4 por citometría de flujo. El número de células Bandera-PFTK1 se redujo en la fase G0 /G1 y el aumento correspondiente se observó en la fase S comparar con Ctrl. El#4 el número de células PFTK1-siRNA se incrementó en la fase G0 /G1 y se observó la reducción correspondiente en la fase S comparar con Ctrl. La parte izquierda mostró MGC803 células transfectadas con Ctrl, Bandera-PFTK1. La parte derecha mostró MGC803 células transfectadas con Ctrl, PFTK1-siRNA#4. Estos resultados muestran la sobreexpresión de PFTK1 puede aumentar la proliferación de las células, mientras que PFTK1 caída reducir la proliferación de las células.
La vía de señalización de PFTK1 en la promoción de la proliferación y migración
Para estudiar más a fondo el mecanismo de los cuales células de cáncer gástrico regulados PFTK1 proliferación, migración, invasión, decidimos para detectar la proteína relacionada cambiado por Western blot cuando PFTK1 se sobreexpresa o una caída en MGC803. Como se informó, PFTK1 podría activar no canónica de señalización Wnt en el carcinoma hepatocelular [17]. la señalización de Wnt se relaciona con la proliferación de tumores y la migración. La regulación positiva de PFTK1 activa en parte Dvl2, Naked1, MMP2 y elevó la expresión de regulador del ciclo celular ciclina E, pero no cambió DVL1, β-catenina. Lo que es más, encontramos que desmontables de expresión endógena PFTK1 podría disminuir Dvl2, Naked1, la MMP-2, ciclina E de expresión, pero no cambiamos DVL1, β-catenina (Figura 7).
Los efectos de PFTK1 sobre la expresión de ciclina E, PCNA, MMP2, Wnt vías tales como β-catenina, DVL1, Dvl2, Naked1 por Western blot relacionado. El aumento de la expresión PFTK1 promted la expresión de ciclina E, PCNA, Dvl2, Naked1, la MMP-2, pero no había cambiado la expresión de β-catenina, DVL1. Mientras derribando la expresión endógena PFTK1 mostró el resultado opuesto.
Discusión
Al ser uno de los más altos de incidencia de cáncer en el mundo, la tasa de supervivencia a 5 años del cáncer gástrico es inferior a 20% -25% en los EE.UU., Europa y china debido fácil de recaída y la alta tasa de metástasis en el postoperatorio [2]. Infección por Helicobacter pylori, el cambio de oncogenes y genes supresores de tumores, la regulación del ciclo celular y la activación de la telomerasa se asocia con el cáncer gástrico [21]. la regulación del ciclo celular anormal en el desarrollo de cáncer gástrico ha sido el tema de investigación en los últimos años. regulación precisa y estricta del ciclo celular depende de algunos factores de control que incluyen la quinasa dependiente del ciclo celular (CDKs), proteína del ciclo celular (ciclinas) y los inhibidores de la quinasa dependiente del ciclo celular (CKIs). Todo el mundo está familiarizado con 11 clásicos (CDK) CDK1-11, PFTK1 como una quinasa dependiente de nuevo del ciclo celular se encuentra no a lo largo y la conexión entre PFTK1 y el cáncer no es mucho, también en el cáncer gástrico [22].
PFTK1 se encontró originalmente en el sistema nervioso de ratas [23]. PFTK1 modula la diferenciación de oligodendrocitos a través de la vía PI3K /AKT [13]. La investigación más reciente informó que PFTK1 está regulada positivamente en el cáncer de esófago humano, carcinoma hepatocelular y se asocia con el crecimiento del tumor, la migración y la invasión [14,24]. En nuestro estudio, hemos explorado si la expresión de PFTK1 estuvo implicado en el cáncer gástrico células de proliferación, la migración y la invasión. En primer lugar, hemos demostrado que PFTK1 expresó mayor en tejidos de cáncer gástrico que en los tejidos no tumorales adyacentes por Western blot que, de acuerdo con los resultados en otros tipos de cáncer (Fig 1). Posteriormente, la inmunohistoquímica mostró una elevada expresión de PFTK1 se relaciona con el grado del tumor, la profundidad de la infiltración, la invasión ganglionar, así como de Ki-67 en 161 tejidos de cáncer gástrico. Estos hallazgos llevaron PFTK1 podría afectar a la proliferación del cáncer gástrico y la migración. De Kaplan-Meier análisis reveló que PFTK1 predice la supervivencia global pobre (Figura 3B). El análisis multivariado mediante el modelo de riesgos proporcionales de Cox sugirió PFTK1 era un indicadores pronósticos independientes de la supervivencia global de los pacientes. Con el fin de comprender mejor el efecto regulador de PFTK1 sobre las células gástricas, MGC803 células fueron transfectadas con siRNA-PFTK1#4, Bandera-PFTK1
in vitro gratis (figura 4). Fig 6 mostró PFTK1 podría promover la proliferación de CCK-8, el ensayo de formación de colonias. Al mismo tiempo, PFTK1 aumentó la transformación de fase G1-S de acuerdo con la citometría de flujo, coincidiendo con el hallazgo de PFTK1 en el carcinoma hepatocelular [10]. Ciclina E fue uno de los factores reguladores importantes durante la transformación de la fase G1-S y la proteína ciclina E podrían definir como un factor pronóstico para los pacientes con cáncer gástrico [25]. Curiosamente, el nivel PFTK1 se incrementó después de la transfección con la bandera-PFTK1 consistented con PCNA, la MMP-2 y ciclina E (figura 7).
Además, también examinamos si PFTK1 podría afectar la migración de las células y la capacidad de invasión de la curación de heridas de ensayo y transwell ensayos. Los resultados mostraron que la sobreexpresión de PFTK1 podría mejorar la migración y la invasión de células, lo que podría ser debido a un cambio de aguas abajo de las vías de señales PFTK1 (Fig 5). Como se informó en el cáncer hepatocelular, PFTK1 y /o CCNY por sí sola podría activar la señalización Wnt no canónica causando la migración y la invasión de células [17]. vías de Wnt incluyen la canónica de Wnt /β-catenina señalización y no canónica de señalización Wnt vías (Wnt /Ca
2 + y Wnt /PCP). camino de señalización Wnt juega un papel importante en el desarrollo del cáncer y la proliferación de las células regulado, la migración y la invasión [26]. Posteriormente, encontramos la expresión de las proteínas β-catenina, DVL1, Dvl2, Naked1. Dvl2 y Naked1 se correlacionaron positivamente con PFTK1 y las proteínas relacionadas canónica de Wnt /β-catenina beta-catenina, DVL1 no había cambiado (Figura 7).