Extracto
Los péptidos bioactivos, o bien derivados de los recursos naturales o sintetizados por el diseño racional, se ha demostrado potencial para agentes terapéuticos contra numerosos enfermedades humanas, incluyendo el cáncer. Sin embargo, el mecanismo de péptidos terapéuticos contra el cáncer no ha sido bien dilucidado. Aquí nos muestran que PGPIPN, un hexapéptido derivado de β-caseína bovina, inhibe la proliferación de células de cáncer de ovario humano Línea SKOV
3, así como las células de cáncer de ovario primario
in vitro
. Consistentemente, PGPIPIN también disminuyó la tasa de crecimiento del tumor en ratones modelo de xenoinjerto de cáncer de ovario en una forma dependiente de la dosis. El estudio adicional demostró que el efecto antitumoral de PGPIPN es parcialmente a través de la promoción de la apoptosis celular mediante la inhibición de la vía BCL2. Por lo tanto, nuestro estudio sugiere que PGPIPN es un agente terapéutico potencial para el tratamiento de cáncer de ovario o de otros tipos de cáncer
Visto:. Wang W, Gu F, Wei C, Tang Y, Zheng X, Ren H, et al. (2013) PGPIPN, un hexapéptido terapéutica, suprimió el crecimiento del cáncer de ovario humano por la orientación BCL2. PLoS ONE 8 (4): e60701. doi: 10.1371 /journal.pone.0060701
Editor: Robert W. Sobol, Universidad de Pittsburgh, Estados Unidos de América
Recibido: 15 Noviembre 2012; Aceptado: March 1, 2013; Publicado: 8 Abril 2013
Derechos de Autor © 2013 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (30872992) y la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Anhui (03043802). El RMB 300000 fue concedida para esta investigación por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China, la URL de los cuales es http://www.nsfc.gov.cn. La Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Anhui financiado 100.000 RMB para el estudio. Los donantes tenían papel en el diseño del estudio, los experimentos, recopilación de datos y el análisis, la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario es el cáncer ginecológico más letal. La incidencia de cáncer de ovario es el tercero en el cáncer ginecológico después de mama y cáncer de cuello uterino en las mujeres, pero es la que más número de muertos en el cáncer ginecológico. El curso de la terapia convencional para el cáncer de ovario incluye citorreducción quirúrgica de la masa tumoral seguida de quimioterapia adyuvante. Aunque se ha logrado un gran progreso en el desarrollo de terapias del cáncer en los últimos años, los problemas siguen surgiendo en particular con respecto a la quimioterapia, debido a los efectos secundarios, y la resistencia a la baja especificidad de los fármacos disponibles en la actualidad [1]. Por lo tanto, hay una necesidad de desarrollar agentes anticancerígenos seguros y eficaces [2].
Terapéutica
péptido es un campo prometedor para los agentes anti-cáncer emergentes, principalmente debido a que estos péptidos se pueden obtener fácilmente ya sea de naturaleza recursos o diseño racional basado en la estructura de la proteína diana. De hecho, varios estudios han demostrado que un número de péptidos bioactivos crecimiento de células tumorales inhibidas en senderos preclínicos [3] - [5]. En particular, estos péptidos terapéuticos generalmente no tienen o tienen una toxicidad limitada [2]. Por ejemplo, un péptido bioactivo contra el cáncer (ACBP) extraído a partir de bazos de cabra inhibió dramáticamente el crecimiento del tumor gástrico humano en un modelo de xenoinjerto sin citotoxicidad aparente al host [3]. Estudios posteriores sugirieron que los efectos anticancerígenos de algunos péptidos bioactivos se pueden atribuir a su capacidad en la inducción de la apoptosis celular y la detención del ciclo celular [3], [6] - [7]. Estudios recientes han revelado algunos péptidos puede afectar una ruta de señalización específica y posteriormente inhibido el crecimiento del tumor o la metástasis. Tales como, un péptido de SAH-BCL9 (estabilizado hélice alfa de linfoma de células B 9) de orientación beta-catenina inhibe la actividad de Wnt oncogénico, suprimió el crecimiento y la metástasis de cáncer colorrectal y de xenoinjerto de mieloma múltiple, y promovió la apoptosis de células tumorales [8] . El péptido hidrocarburos grapado SAHM1 impedido ensamblaje del complejo transcripcional activo de Notch, y la proliferación celular en consecuencia inhibe
in vitro
y la tumorigénesis en un modelo de ratón de leucemia aguda de células T NOTCH1 impulsada y linfoma [9].
Además de sus valores nutricionales primarias, proteínas de la leche son fuentes importantes de péptidos biológicamente activos [10] - [11]. proteínas de la leche son los precursores de muchos péptidos biológicamente activos que son inactivos en las proteínas precursoras, pero pueden ser liberados y activados mediante proteolisis enzimática [12]. Algunos péptidos derivados de proteínas de la leche son buenos candidatos para agentes anticancerígenos clínicos o adyuvante, ya que son fácilmente absorbidos con menos toxicidad potencial. Además, aquí están aumentando estudios que muestran que los péptidos bioactivos de la leche pueden ser absorbidos intactos desde la luz intestinal hacia la circulación sanguínea - éstos pueden servir así como nuevos agentes farmacéuticos, que no causan efectos secundarios significativos en humanos sanos [13]. De hecho, la exploración de los efectos anticancerígenos de péptidos bioactivos a partir de proteínas de la leche se perfila como una de las regiones más calientes recientemente. Por ejemplo, talactoferrina (TLF), una lactoferrina humana recombinante (LF), es un nuevo agente contra el cáncer desarrollada que ha entrado en la fase III de ensayos clínicos [14] - [15].
PGPIPN (Pro-Gly-Pro -Ile-Pro-Asn, residuos 63-68 de ß-caseína), un péptido inmunomodulador, era el péptido activo descubierto de proteínas de la leche bovina [16] - [18]. Estudios previos han demostrado que este péptido desempeña un papel importante en la respuesta de defensa inmune. Por ejemplo, el péptido mejorado la actividad fagocítica de los macrófagos
in vitro
contra ovejas glóbulos rojos (SRBC) y ratones protegidos contra la infección con Klebsiella pneumoniae
in vivo
. En los últimos años, nuestro laboratorio dedicado a explorar las funciones fisiológicas de PGPIPN. En comparación con otros péptidos inmunomoduladores, PGPIPN es más resistente al sistema degradante de enzimas debido a su rico contenido de prolina [19]. Por otra parte, un aminoácido de cadena ramificada (BCAA) de este péptido ayuda en cierta medida para resistir microorganismos. Nuestros estudios previos sugirieron que PGPIPN promovió significativamente la fagocitosis de macrófagos peritoneal y la inmunidad de las células rojas de la sangre en ratas. También puede estimular la proliferación de linfocitos tanto en ratas y ratones [20] - [21]. Por otra parte, nuestro estudio posterior demostró que este péptido tiene buen efecto antioxidante
in vivo
[22].
Aquí nos muestran que la PGPIPN hexapéptido puede inhibir eficazmente la proliferación de células de cáncer de ovario, cáncer de inducir la apoptosis de las células y disminuir el crecimiento tumoral en el modelo de xenoinjerto de cáncer de ovario. Los resultados de este estudio proporcionan la prueba de concepto para el uso de PGPIPN como agente terapéutico potencial para el tratamiento de cáncer de ovario.
Materiales y Métodos
Reactivos
El PGPIPN (la pureza se confirmó mediante RP-HPLC para ser & gt; 99,5%) fue proporcionado por Shanghai Sangon Biológica tecnología de ingeniería. kit Tunel se adquirió de Roche. Gen Eluir mamíferos Genomic DNA Miniprep Kit se adquirió de Sigma. anticuerpos monoclonales de ratón de BCL2, Bax, y β-actina fueron adquiridos de Santa Cruz Biotechnology, Inc.
Cultivos Celulares
línea celular de cáncer de ovario humano SKOV celular hepática normal
3 y humana línea de LO2 se compró a la ATCC. células murino fibroblastos de embrión (MEFs) originalmente de la Harvard Medical School en los Estados Unidos,
p
53 genes de los cuales había sido noqueado, fue presentado por el profesor Zhang Hongbin en la Academia China de Ciencias Médicas & amp; Peking Union Medical College, China. Estas líneas celulares se cultivaron en DMEM con 10% FBS en 5% de CO
2 a 37 ° C. Para el cultivo de células de ovario primario, tejido tumoral ovárica primaria fresca, que fue evaluada y clasificada como serosa adenocarcinoma de ovario (grado I-II) de acuerdo con los criterios de la OMS, se obtuvieron de 5 pacientes con cáncer de ovario en la cirugía inicial de citorreducción en el primer hospital afiliado de Universidad médica de Anhui. Todos los pacientes firmaron los consentimientos escritos que documentan la donación de sus tejidos para fines de investigación de acuerdo con la Declaración de Helsinki antes de la deposición de tejido. Este estudio fue aprobado por el Consejo de Revisión Médica de la Universidad de Anhui. Los tejidos tumorales se cortaron en trozos pequeños de aproximadamente 1,0 mm
3, y se enjuagaron con PBS dos veces y se digirieron con 0,25% de tripsina en tubo de centrífuga estéril a 37 ° C durante 30 minutos. Para obtener las células de suspensión individuales, por encima de los tejidos digeridos se filtran con 100 um filtro de células. Después se centrifugó a 1000 rpm durante cinco minutos, el sedimento celular se resuspendió en DMEM complementaria medio con suero humano al 10%. Cuando las células crecieron hasta 70-80% de confluencia, se drenó el medio de cultivo en el matraz; las células se digirieron con 0,25% de colagenasa II. Cuando aproximadamente 1/3 células cayendo por la observación bajo un microscopio, la digestión se detuvo inmediatamente y el medio de cultivo en matraz se drenó de nuevo. Debido a su vertimiento primera, la mayor parte de los fibroblastos fueron eliminados por digestión con colagenasa. Las células se cultivaron permanecido continuamente para ensayo de proliferación celular. La parte de estas células se hicieron a la diapositiva de células y se identifica por medio de inmunofluorescencia de citoqueratina 7 para analizar su pureza.
Ensayo de proliferación celular
SKOV
3 células se sembraron en 96- y placas en octuplicado a una densidad inicial de 5 × 10
3 células /pocillo. Después de cultivo durante la noche, se añadió PGPIPN a las concentraciones finales de 0 (como control), 3 × 10
-8, 3 × 10
-7, 3 × 10
-6, 3 × 10
-5, 3 × 10
-4, 3 × 10
-3 y 3 × 10
-2 g /l, respectivamente. 5-fluorouracilo (5-FU) a 3 x 10
-3 g /L se añadió en la misma placa como control positivo. La proliferación de las células se midió a diferentes puntos de tiempo por el método MTT, como se describe [23]. La siguiente fórmula se utilizó para calcular la proporción de crecimiento de células de inhibición (IR): IR (%) = (1 - el grupo experimental A /grupo de control
490 nm valor A
490 valor nm) x 100%. Cada experimento se realizó por triplicado de forma independiente.
Utilizando el mismo procedimiento, también se ensayaron la inhibición del crecimiento de PGPIPN en células de cáncer de ovario primario, a excepción de las concentraciones finales de PGPIPN en 0 (como control), 3 × 10
-6, 3 × 10
-5, 3 × 10
-4, 3 × 10
-3 y 3 × 10
-2 g /l, respectivamente. Los experimentos se realizaron por duplicado con células de cáncer de ovario primario de cinco pacientes, respectivamente.
Para la detección de la toxicidad de PGPIPN, las inhibiciones de crecimiento de PGPIPN en líneas celulares no transformadas LO2 y MEFs se sometieron a ensayo con el mismo procedimiento que el de SKOV
3 células, a excepción de las concentraciones finales de PGPIPN en 0 (como control), 3 × 10
-4, 3 × 10
-3, 3 × 10
-2, 3 × 10
-1 y 3 g /L, respectivamente. Cada experimento se realizó por triplicado de forma independiente.
observación morfológica de las células tratadas con PGPIPN
Los cambios morfológicos dinámicos de la SKOV
3 células tratadas con PGPIPN se observaron con microscopio óptico. La cubierta de cristal de rastreo celular estaba preparado. El vidrio de cubierta casi completa de las células en su superficie fue tomada para H & amp; E de la tinción, con el procedimiento de acuerdo con la referencia [24] - [25]. El método utilizado para observar la apoptosis de las células SKOV
3 con microscopio electrónico de transmisión se ha descrito anteriormente.
Detección de la apoptosis en células cultivadas por FCM
se detectaron [26]
Las células apoptóticas utilizando FITC-conjugado de Anexina-V y yoduro de propidio (PI) a partir de Sigma. Las células se lavaron dos veces con PBS frío y se resuspendieron en tampón de unión de Anexina-V (mM HEPES 10, NaCl 140 mM y CaCl 5 mM
2) a una concentración de 1 × 10
6 células /ml. A continuación, la suspensión individual de 1 × 10
6 SKOV
3 células se preparó en un tubo de cultivo de 5 ml de acuerdo con la referencia [23], en el que 5μL anexina-V-FITC en 10 ug /mL y 10 de propidio l se añadió yoduro en 10 ug /mL. Luego el tubo se agitó en vórtice suavemente y se incubó durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad. A continuación se añadió tampón de unión (400 l) a cada tubo y las células se analizaron por citometría de flujo.
Tratamiento Animales
Veinticuatro ratones desnudos femeninos sanos fueron utilizados en las investigaciones. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo bajo el protocolo aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad Médica de Anhui. Durante los experimentos con animales, se ha mejorado en lo posible el sufrimiento animal. Todos los ratones desnudos se sacrificaron al final de los experimentos. Los ratones desnudos en cepa endogámica (BALB /Cann-nu /nu), 8-10 semanas de edad, fueron adquiridos de Shanghai Slac Animales de Laboratorio Co. Ltd. Todos los ratones se mantuvieron en su clase SPF ambiente estéril en el Centro Médico de Anhui animales de experimentación.
Cada ratón desnudo se inoculó por vía subcutánea en su axila derecha con 0,2 ml SKOV
3 células de suspensión al (1 × 10
7) células /ml. En el segundo día después de la inoculación, los ratones se dividieron al azar en cuatro grupos: NS (solución salina normal), dosis bajas de PGPIPN, alta dosis PGPIPN y 5-FU (como control positivo) groups. NS, los grupos de dosis baja PGPIPN, alta dosis PGPIPN y 5-FU fueron inyectados por vía intraperitoneal con 0,2 ml de solución salina, 0,2 ml PGPIPN en el 0,25 gL
-1, 0,2 ml PGPIPN en 0,50 gL
-1 y 0,2 ml de 5- FU a 30 mg /kg de peso corporal, respectivamente. Los fármacos se administraron una vez cada dos días durante 4 semanas
El tamaño del tumor se midió semanalmente con pie de rey, y se calculan según la fórmula de la siguiente manera:. V = (1/2) ab
2 , donde el volumen V = tumor; A = el diámetro mayor de tumor; b = la mayor cantidad de senderos de tumor. En el cuarto fin de semana después de la siembra, todos los ratones desnudos fueron sacrificados y se pesaron los tumores de xenoinjertos. Los xenoinjertos de tumores se congelaron en nitrógeno líquido para experimentos posteriores.
TUNEL (TDT mediada por dUTP Nick-End Labeling) Ensayo
Las muestras tumorales fueron fijadas y embebidas con parafina. El ensayo TUNEL se realizó como el manual del fabricante (Roche). Por último, las secciones se contratiñeron con hematoxilina. Las células apoptóticas se cuantificaron mediante microscopía de luz sobre hematoxilina y eosina (HE) secciones teñidas por el promedio del número de células con cromatina densa homogénea o fragmentos nucleares cariorrécticos en las fotografías de los cinco seleccionados al azar × 40 campos. Los casos fueron evaluados por dos examinadores independientes. índice de apoptosis (AI) se calculó de la siguiente fórmula: AI = (el número de células apoptóticas /número total de células) x 100%
Fragmentación Ensayo de ADN por electroforesis en gel de agarosa
ADN. fragmentos en los tejidos tumorales se analizaron por electroforesis en gel de agarosa, de acuerdo con el método descrito por Sambrook & amp; Russell (2001) [27]. ADN en los tejidos tumorales se extrajo utilizando genes de mamíferos Eluir Genomic DNA Miniprep Kit (Sigma), y se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1,5% (que contiene 0,25 mg /ml de bromuro de etidio). Las bandas electroforéticas se visualizaron y fotografiaron bajo luz ultravioleta transmitida.
Western Blot El análisis de BCL2 y Bax proteínas en los tejidos tumorales
Las proteínas fueron aisladas de las muestras tumorales xengrafted y fueron separados por SDS -PAGE utilizando el protocolo estándar. Después se bloquearon con 5% (w /v) de leche desnatada seca, las membranas se incubaron con anticuerpos primarios (anticuerpo monoclonal de ratón Bax, BCL2 y anticuerpos beta-actina, 1:1000 de dilución) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Santa Cruz Biotechnology) y después se incubaron con peroxidasa de rábano anticuerpo secundario conjugado (de cabra anti-IgG de ratón, 1:8000 dilución). Las proteínas se detectaron con el sistema de quimioluminiscencia mejorada (ECL) (Pierce, Rockford, IL) seguido de exposición a película de rayos X. ß-actina se utilizó como control de carga. Las imágenes digitales fueron capturados por el sistema de documentación de gel Gel Doc ™ (Bio-Rad, EE.UU.) y las intensidades se cuantificaron utilizando la versión de software Cantidad Uno 4,62 (Bio-Rad, EE.UU.).
Análisis estadístico
Todos los datos medidos se presentan como media ±
SD
. Se analizaron las diferencias entre los grupos usando el ANOVA de una vía por SPSS12.0 software estadístico. La significación estadística se definió como
P
. & lt; 0,05
Resultados
PGPIPN tratamiento indujo inhibición de la proliferación celular y la apoptosis de SKOV
3 células de cáncer de ovario
en vitro
PGPIPN se ha demostrado que desempeñan un papel importante en la terapia inmunomoduladora y otros efectos en muchas investigaciones [19] - [22], [28] - [29]. Esto nos intriga para investigar si PGPIPN se puede utilizar como agente anticancerígeno. Para este fin, primero investigó el efecto de PGPIPN sobre la proliferación de SKOV
3 células. Para nuestra sorpresa, PGPIPN puede suprimir con eficacia la SKOV
3 de crecimiento de las células, incluso a bajas dosis de 3 × 10
8 g /L (Figura 1A). Esta capacidad de inhibición de la PGPIPN se comparó con el tratamiento con 5-FU cuando las células se expusieron a alta concentración de 3 × 10
3 g /L. El efecto de inhibición de PGPIPN también mostró Manor tiempo y dependiente de la dosis. Además, en comparación con el control, el tratamiento PGPIPN condujo a cambios morfológicos evidentes en SKOV
3 células, incluyendo células contracción, de cariopicnosis, y la apariencia de las vacuolas citoplásmicas en algunas células (fecha no se muestra). También mostraron una profunda manchada en la sección nuclear y una gran cantidad de cuerpos citoplasmáticos o trozos pequeños en las células tratadas con PGPIPN, que son las características típicas de las células apoptótica (datos no mostrados). Para validar esta observación, se realizó el ensayo de apoptosis con Anexina V-TITC y método de doble tinción PI. PFPIPN tratamiento indujo claramente SKOV
3 células se sometieron a la apoptosis después de la exposición al fármaco 48 horas a diferentes concentraciones (Figura 1B)
.
(A) PGPIPN a diferentes concentraciones inhibe la proliferación de células SKOV 3
, medido en diferentes puntos temporales. Los datos mostrados son la media ±
SD Red de tres experimentos independientes, *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01 en comparación con el control (el grupo del vehículo). (B) La citometría de flujo análisis muestra que el tratamiento PGPIPN inducida SKOV
3 apoptosis de las células después de 48 horas la exposición al fármaco. Esta medición se realizó por triplicado biológicamente.
PGPIPN puede inhibir eficazmente crecimiento de células cancerígenas de ovario humanos primarios
in vitro
A continuación, ponemos a prueba, además, si PGPIPN puede también inhibir la cáncer primario crecimiento celular humana. Nosotros le dé el sol con éxito y establecimos 5 células de cáncer primario de 5 pacientes con cáncer de ovario en la cirugía de reducción de volumen inicial en el primer hospital afiliado de la Universidad Médica de Anhui. Estas células primarias fueron la cultura en nuestro laboratorio. Estas células se presentan como células del epitelio morfológicamente típicas (Figura 2A izquierda y el panel medio). Estas células de cáncer de ovario primarios se identificaron adicionalmente por ensayo de inmunocitoquímica con anticuerpos anti-citoqueratina 7 tinción (panel derecho Figura 2A). La pureza media de las células de carcinoma de ovario fue de aproximadamente 85% basado en la citoqueratina 7 tinción. Para investigar si PGPIPN puede disminuir el crecimiento de células de cáncer de ovario primarios, se sembraron estas células en placas de 96 pocillos. Después de un crecimiento durante la noche de estas células se trataron con PGPIPN a diferentes concentraciones de 24, 48 y 72 h. Como se muestra en la Figura 2B, el tratamiento con diferentes concentraciones de PGPIPN condujo a una inhibición significativa de la proliferación de células de carcinoma de ovario, y el efecto de inhibición mostró Manor tiempo y dependiente de la dosis. Todo esto indica que las células de cáncer de ovario primarios también son sensibles al tratamiento PGPIPN.
(A) A representan la morfología de las células de carcinoma de ovario de un paciente que crece en el medio de cultivo primario (× 100, panel de la izquierda), H & amp ; e manchadas (panel central) y anti-citoqueratina 7-FITC manchado (panel derecho). ensayo (B) La proliferación celular muestra que PGPIPN a diferentes concentraciones suprimió el crecimiento de células de ovario primario. Los datos se calcularon a partir de 5 mediciones primarias células cancerosas y presentan como media, y las barras de error se refieren a SD de decuplicate los análisis, *
P
& lt; 0,05, **
P
& lt; 0,01 en comparación con de control (el grupo del vehículo).
PGPIPN tuvo poco o ningún efecto sobre el crecimiento celular no transformado
in vitro
se investigó la citotoxicidad de PGPIPN hacia líneas celulares transformadas . MTT ensayo se realizó para analizar los efectos de PGPIPN sobre las proliferaciones de LO2 humano normal línea celular hepática y células de fibroblastos de embriones murinos (MEF). Se encontró que el péptido no tener ningún efecto sobre la proliferación de células LO2 (Figura 3A). La proliferación de MEFs fue ligeramente afectada por PGPIPN, que fue inhibida significativamente sólo a una dosis alta (0,3 g /L) del péptido durante 72 horas, pero la influencia era mucho más pequeño en comparación con el grupo control positivo (grupo 5-FU) ( Figura 3B). En consecuencia, PGPIPN exhibido poca o ninguna citotoxicidad hacia células no transformadas, en comparación con los medicamentos contra el cáncer tradicionales (5-FU).
(A) PGPIPN no tuvo efecto sobre la proliferación de células LO2. (B) PGPIPN afectada ligeramente la proliferación de las MEFs, que fue inhibida significativamente sólo a una dosis alta (0,3 g /L) del péptido de 72 h. Los resultados se expresan como media ±
SD
de tres experimentos independientes, *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01 en comparación con el control (el grupo del vehículo) .
PGPIPN redujo significativamente el crecimiento del tumor xenoinjertado
in vivo
Para determinar si PGPIPN tiene un efecto anti-tumoral
in vivo
, nos implantada SKOV
3 células por vía subcutánea en ratones desnudos. Veinticuatro ratones se dividieron al azar en cuatro grupos: NS (solución salina normal), dosis bajas de PGPIPN, dosis alta PGPIPN y 5-FU (como control positivo) grupos como se describe en Materiales y Métodos. PGPIPN se administró intraperitonealmente cada dos días a partir de la segunda días después de la inoculación de las células tumorales. Saline sirvió como un control negativo, y 5-fluorouracilo se utilizó como control positivo. Estos ratones se trataron durante 4 semanas. En la cuarta semana, los tumores se retiraron y se midieron. Ambas dosis de PGPIPN pueden inhibir significativamente el crecimiento del tumor en comparación con el grupo NS (Figura 4A). Los tumores en el grupo NS crecieron hasta un volumen promedio de (1370.25 ± 303.12) mm
3. Por el contrario, los tumores en el grupo de dosis baja PGPIPN, PGPIPN grupo de dosis alta y el grupo 5-FU crecieron hasta un volumen promedio de (845,43 ± 205,09) mm
3, (346,78 ± 97,16) mm
3 y (705.82 ± 124.47) mm
3, respectivamente (Figura 4A). En comparación con el grupo NS, las tasas de inhibidores en PGPIPN grupo de dosis baja, grupo de dosis alta PGPIPN y el grupo 5-FU fueron 36,92%, 68,46% y 41,54%, respectivamente. Consistentemente, los tamaños de los tumores (Figura 4B) o pesos (Figura 4C) se redujeron notablemente en todos los grupos de tratamiento de drogas en comparación con el grupo control. En conjunto, estos datos indican que PGPIPN puede inhibir eficazmente el crecimiento del tumor xenoinjertado
in vivo
, que es en comparación con los tradicionales fármacos anti-ovario, 5-fluorouracilo.
PGPIPN crecimiento tumoral inhibido notablemente después de 4 -weeks tratamiento (a) y disminuyó el tamaño del tumor (B) y el peso del tumor (C) al final del tratamiento. Los datos se presentan como media ±
SD Red de 6 ratones, *
P Hotel & lt; 0,05, **
P
. & Lt; 0,01 en comparación con el grupo NS
inhibición del crecimiento tumoral inducido por PGPIPN está asociado con apoptosis de las células
in vivo
la citometría de flujo análisis mostró que PGPIPN inducida SKOV
3 células se sometieron a la apoptosis
In
vitro (Figura 1B). Para probar si PGPIPN también puede inducir la apoptosis celular en el tratamiento de tumores
in vivo
, se realizó un ensayo de TUNEL en las muestras tumorales extraídas de ratones desnudos injertados. El número de células TUNEL positivas en muestras de tumores extraídos de los grupos de tratamiento PGPIPN se incrementó significativamente (Figura 5 A y B). En consonancia con esta observación, ensayo de fragmento de ADN también demostró la notable la degradación del ADN en muestras de tumores tratados con PGPIPN, lo que indica que las células apoptóticas alto porcentaje en estas muestras (Figura 5 C). Por el contrario, NS tratado muestras de tumores no mostraron este patrón típico de escalera de ADN en la electroforesis (Figura 5 C). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que PGPIPN inhibe el crecimiento tumoral a través de la inducción de las células tumorales que experimentan apoptosis. Ensayo
(A) TUNEL muestra las células tumorales apoptóticas en muestras tratadas con PGPIPN extraídos de ratones de xenoinjerto (× 400). índice (B) apoptótica se calculó como fórmula siguiente: AI = (el número de células apoptóticas /número total de células) x 100% (media ±
SD
, n = 6), **
P
& lt; 0,01. ensayo (C) fragmento de ADN de muestra que PGPIPN inducida por la degradación del ADN del tumor en el grupo de dosis alta PGPIPN (alto) y el grupo de dosis baja PGPIPN (bajo), pero no en el grupo de solución salina normal (NS). niveles (D) de la proteína BCL2 y Bax fueron examinados por Western blot en muestras de tumores extraídos de los ratones xenoinjertados (panel superior). Las intensidades de las bandas se midieron mediante un software de imágenes J y resumido (panel inferior). Los datos son de 6 tumores de cada grupo, *
P Hotel & lt; 0,05, **
P
. & Lt; 0,01 en comparación con el grupo NS
Para más confirmar que la inducción de la apoptosis está implicada en la regresión del crecimiento del tumor después del tratamiento PGPIPN, dos genes relacionados con la apoptosis,
BCL2
y
bax
, se evaluaron mediante análisis de transferencia Western. ensayo de inmunotransferencia con anticuerpos BCL2 y Bax demostró que los niveles de proteína BCL2 se redujeron significativamente en los grupos tratados con PGPIPN (
P
& lt; 0,05 o
P
& lt; 0,01) en comparación con la del grupo de control (Figura 5D). Por el contrario, las expresiones de Bax fueron dramáticamente hasta reguladas en grupos tratados con PGPIPN, en comparación con el control (Figura 5D). Estos datos sugieren claramente que PGPIPN inhibió el crecimiento del tumor, al menos en parte a través de la inducción de apoptosis de las células.
Discusión
Muchos péptidos bioactivos derivados de proteínas de la leche son inactivos dentro de sus proteínas de la leche de los padres, y sobre liberan durante digestión o procesamiento de alimentos, que pueden actuar como compuestos reguladores con actividades biológicas. En el presente estudio, somos los primeros en demostrar que PGPIPN puede inhibir profundamente las células del cáncer de ovario humano, tanto en el modelo de ratón con xenoinjerto, así como en las células de cáncer primario sin efectos tóxicos no específicos, lo que sugiere PGPIPN puede ser un agente anticáncer novedoso y debe ser considerados para su posterior ensayo preclínico en otros tipos de cáncer.
los péptidos terapéuticos pueden someterse a través de diferentes mecanismos de los efectos anticancerígenos que dependen de sus características. Algunos péptidos interactúan muy específicamente con las ciclinas y /o quinasas dependientes de ciclina o con los miembros de las cascadas de apoptosis [30] - [31]. Estudios recientes han demostrado que los péptidos pueden poner en peligro las vías de señalización específicos y posteriormente inhibido el crecimiento del tumor o metástasis [8] - [9], [32]. En nuestro estudio, el cáncer de antiovarian PGPIPN fue principalmente a través de la inducción de la apoptosis mediada por la baja regulación de BCL2 (Figura 5). En consonancia con esta observación, también encontramos muchos cambios morfológicos relacionados con la apoptosis de las células, tales como, los picos celulares, ampollas, ampollas superficiales y redondeo celular y la desintegración nuclear (la fecha no se muestra).
Exactamente cómo PGPIPN abajo BCL2 expresión regulada aún no se ha determinado. investigaciones anteriores mostraron que los dos péptidos derivados de β-caseína humana (GLF y VEPIPY), se pueden unir a la membrana de la célula [33] - [34]. Recientes investigaciones indican que algunos péptidos bioactivos derivados de proteínas de la leche bovina eran capaces de unirse y afectar a las células [13], [35] - [38]. Por ejemplo, Kreider RB et al. [13] informaron de que una nueva mezcla de péptidos de la leche inhibe la actividad de la tirosina quinasa del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), factor de crecimiento vascular endotelial receptor 2 (VEGFR2), y receptor de insulina (IR), respectivamente. Este inhibidor multi-quinasa causó la apoptosis en células HT-29 de cáncer de colon
in vitro
, mientras que la mezcla de péptidos de la leche era segura para el consumo por vía oral a voluntarios sanos y clínicamente se reportaron efectos secundarios significativos [13]. Fiedorowicz E, et al. informaron la bioactivo péptidos-casomorfina-7 (YPFPGPI), casoxin-D (YVPFPPF) y casoxin-6 (SRYPSY) a partir de caseínas bovina podría obligar receptor μ-opioide en citomembrana para influir en la proliferación y la secreción de citoquinas de las células mononucleares de sangre periférica humana ( PBMCs) [35]. Almansour NM et al. [2], [39] informó de que el péptido análogo del virus mixoma pueden dirigirse a la vía de señalización Akt como una posible vía de la muerte celular en las células cancerosas de la piel humana.
En nuestro experimento en curso, se observó que PGPIPN marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) surgió en SKOV membrana
3 células bajo el microscopio de barrido láser confocal (CLSM) (fecha no se muestra), lo que indica que este péptido puede unirse a la membrana celular, al igual que algunos otros péptidos de proteína de la leche. Pensamos que PGPIPN puede unirse al receptor celular específico (s) y las vías de transducción de señales celulares dysregulate, y redujo la expresión de BCL, la apoptosis celular inducida a continuación. Todos estos necesitan ser investigadas en el trabajo futuro. Por supuesto, puede PGPIPN a través a través de otros mecanismos para afectar el crecimiento celular.
En resumen, el hexapéptido puede PGPIPN la proliferación de células de cáncer de ovario inhibe eficazmente tanto in vitro como in vivo. Este efecto de inhibición es principalmente a través de PGPIPN apoptosis de células de cáncer inducido. Estos datos sugieren que PGPIPN es un potente péptido terapéutico para el tratamiento de cáncer de ovario, y proporcionan un fundamento para su posterior evaluación en la clínica.
Reconocimientos
Nos gustaría dar las gracias a Lianfang Zhang y Cao Liyu desde el primer hospital afiliado de la Universidad médica de Anhui, por su ayuda en recoger, evaluar y clasificar el tejido tumoral ovárica primaria fresca, de 5 pacientes con cáncer de ovario en la cirugía de reducción de volumen inicial en el primer hospital afiliado de la Universidad médica de Anhui.