Extracto
de Sonic (SHH) meduloblastoma (MB) subtipo es impulsado por una célula CD15 + del tumor se propaga proliferativa (TPC) , también considerado en la literatura como un cáncer de células madre putativa (CSC). A pesar de la investigación considerable, se desconoce gran parte de la biología de este TPC. Presentamos evidencia de que la fosfatasa y tensina homólogo (PTEN) y fosfoinosítido 3-quinasa (PI-3K) juegan un papel crucial en la propagación, la supervivencia y la respuesta a la terapia potencial en este CD15 + enfermedad maligna impulsado por el TPC CSC /. Utilizando el ND2-
SmoA1
modelo de ratón transgénico para MB, la genética del ratón y xenoinjertos derivados del paciente (PDXs), que demuestran que el CD15 + TPC son 1) obligatoriamente requerido para impulsado por SmoA1Tg tumorigenicidad 2) regulada por PTEN y PI-3K señalización 3) selectivamente sensibles a los efectos citotóxicos de los inhibidores de la PI-3K pan
in vitro
y
in vivo
pero resistente a la quimioterapia 4) en el modelo de ratón SmoA1Tg son similares genómicamente a la MB humana subgrupo SHH. Los resultados proporcionan la primera evidencia de que PTEN desempeña un papel en la señalización de MB TPC y la biología y que PI-3K inhibidores de destino y suprimir la supervivencia y la proliferación de las células dentro del compartimento de células de ratón y humano CD15 + madre de cáncer. Por el contrario, CD15 + TPC son resistentes a cisplatino, temozolomida y el inhibidor de SHH, NVP-LDE-225, agentes utilizados actualmente en el tratamiento de meduloblastoma. Estos estudios validan la eficacia terapéutica de los inhibidores de la PI-3K pan en el tratamiento de meduloblastoma dependiente de CD15 + TPC y sugieren una combinación secuencial de los inhibidores de la PI-3K y la quimioterapia se habrá incrementado la eficacia en el tratamiento de esta enfermedad.
Visto : AR Singh, Joshi S, M Zulcic, Alcaraz M, Garlich JR, Morales GA, et al. (2016) PI-3K Inhibidores De preferencia Target CD15 + Cáncer del tallo población de células en el meduloblastoma SHH Driven. PLoS ONE 11 (3): e0150836. doi: 10.1371 /journal.pone.0150836
Editor: Javier S. Castresana, Universidad de Navarra, ESPAÑA
Recibido: 13 Octubre, 2015; Aceptado: 19 Febrero de 2016; Publicado: 3 Marzo 2016
Derechos de Autor © 2016 Singh et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Los datos de microarrays han sido depositados en la base de datos pública GEO (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), con número de GEO adhesión GSE41717
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención RO1 CA94233 -09 y la FDA SR1 FD 04385 de LDN y subvenciones de limonada de Alex soporte Fundación para el cáncer Infantil (ALSF), (Trampolín de subvención) y la Fundación esperanza de Hyundai en las ruedas, esperanza Grant, Cricket Corporation y la Fundación Olivia Hudson. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Joseph R. Garlich y Guillermo A. Morales son empleados por SignalRx farmacéuticos. SignalRx farmacéuticos prestado apoyo en forma de salarios de los autores JRG y el GAM, pero no tuvo ningún papel adicional en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Las funciones específicas de estos autores se articulan en la sección 'autor' contribuciones
Conflicto de intereses:. Los autores tienen los siguientes: los autores Joseph R. Garlich y Guillermo A. Morales son empleados por SignalRx farmacéuticos. El Dr. Durden revela conflicto de intereses financieros en SignalRx productos farmacéuticos y drogas en el SF1126. Existen las siguientes patentes relacionadas con las materias pertinentes a este artículo (PI-3-quinasa inhibidor profármacos Patente Nº: 6.949.537). La relación entre el Dr. Durden y SignalRx ha sido revisado y aprobado internamente por la Universidad de California, San Diego, de acuerdo con su conflicto de intereses políticas. Este estudio fue financiado en parte por Cricket Corporation. No hay más patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales
Abreviaturas:. CSC, cáncer de células madre; TPC, tumor de multiplicación celular; PI-3K, phosphoinositide 3-quinasa; PTEN, fosfatasa y homólogo de tensina; PDX, derivado del paciente xenoinjerto
Introducción
El meduloblastoma (MB) es un tumor agresivo cerebelosa y el tumor maligno cerebral pediátrico más común [1, 2]. El tratamiento actual para el meduloblastoma incluye la resección del tumor seguida de radiación y la quimioterapia que incluye regímenes de cisplatino. Aunque la tasa de curación es del 50-80%, los sobrevivientes sufren efectos secundarios graves, incluyendo el deterioro del crecimiento, trastornos endocrinos, y marcados déficits neurocognitivos [3]. Por lo tanto, se necesitan urgentemente terapias más eficaces y menos tóxicos para el meduloblastoma. Recientemente, varios grupos [4-8] han realizado perfiles de expresión génica y el análisis del número de copias de ADN de MB, y se han identificado al menos cuatro subtipos principales de la enfermedad: WNT, Sonic hedgehog (Shh), Grupo C y Grupo D . Estos subtipos moleculares tienen características distintas en cuanto a la expresión de genes, los perfiles mutacionales, la epidemiología y el pronóstico. Entre los subtipos moleculares, los tumores asociados con la activación incontrolada de la vía de SHH se definen comúnmente como MB SHH. La vía de SHH es una cascada de señalización que regula embrionario esencial de las células madre y la diferenciación de células progenitoras en múltiples procesos del desarrollo [9]. Las mutaciones en el supresor de vía de SHH
Patched
o alteraciones de otros componentes de la vía SHH dan como resultado su activación permanente y la formación de tumor MB [10, 11]. Alrededor del 30% de Mo exhibe la activación incontrolada de la vía de señalización de SHH [11]. Aunque, varias (SMO) antagonistas smoothened incluyendo NVP-LDE225 & amp; GDC0449 se están evaluando actualmente en ensayos clínicos en pacientes con meduloblastoma, hay un rápido desarrollo de la resistencia del tumor [12, 13]. Un estudio realizado por Buonamici et al demostraron que la resistencia a NVP-LDE225 en MB está mediada por la activación de la fosfoinosítido 3-quinasa (PI3K) vía de señalización. [14]. La literatura existente sugiere que el supresor de tumores, PTEN y su objetivo de PI-3K son importantes en la patogénesis de la MB asociado-SHH [15-20]. Recientes análisis genómico de los tumores de meduloblastoma reveló que la mutación PI-3K (PIK3CA, PTEN, PIK3C2G) es frecuente en los tumores de los subgrupos SHH [21, 22]. En uno de los estudios, de los 13 tumores subgrupo Hedgehog perfiladas, 2 tenían mutaciones de pérdida de función en
PTEN
, y otro paciente tenía una mutación activadora en PIK3CA [22]. En otro estudio, un total de 133 MB de SHH tumores perfiladas, vía PI-3K está mutado en & gt; 5% de MB SHH [21, 22]
Múltiples informes indican que Mo es impulsado por células madre resistentes al tratamiento. -como células, denominadas células madre de cáncer /tumor de células de multiplicación (CSC /TPC). importantes estudios demuestran que las muestras tumorales extraídas de modelos genéticos murinos MB, Sonic hedgehog (
SHH-parcheado) y desde MB humana, se propagan por las células que expresan la CD15 marcador progenitor /SSEA [23, 24]. CD15 es un antígeno de hidratos de carbono que se expresa en ambos progenitores y células madre en el sistema nervioso central embrionario y adulto [25, 26] y sobre todo se considera como un marcador importante para TPC en el subgrupo de SHH de meduloblastoma [23].
TPC se consideran proliferativa y un importante contribuyente a la resistencia del tumor y la recurrencia [27-30]. Varios estudios han demostrado un papel para la vía PI-3K /AKT en la proliferación y propagación de TPC [31-33]. Los informes han demostrado que el bloqueo de la actividad de PI-3K suprime la proliferación de TPC en mama, ovario y varios otros tipos de cáncer [34]. Hambardzumyan
et al
. sugirió que la actividad de la vía PI-3K regula la supervivencia de las células madre del cáncer después de la radiación en el meduloblastoma
in vivo
. [35]. Por lo tanto, la hipótesis de que la orientación del eje de señalización de PTEN-PI-3K en el compartimento MB TPC puede proporcionar un control de tumor a largo plazo y /o la erradicación de meduloblastoma. Anteriormente, nuestro grupo ha informado de que la heterocigosidad de PTEN promueve la tumorigénesis en humanos y en el
SmoA1
modelo de ratón de meduloblastoma [15]. Nos informó que el 61% de los tumores de meduloblastoma humanos han perdido la expresión de la proteína PTEN y esta pérdida de PTEN es de importancia pronóstica en esta enfermedad (15). En este documento, el uso de la etiqueta
SmoA1Tg
modelo de ratón y muestras de tumores de xenoinjertos MB pacientes humanos primarios (PDXs), se observó que la capacidad de propagación del tumor de CD15 + TPC en MB impulsado por SHH se regula por lo menos en parte, por la PTEN- PI-3K vías de señalización, y que la orientación de este eje el uso de inhibidores de la PI-3K puede bloquear la
in vivo
propagación de cursos de política comercial e inducir la apoptosis.
Materiales y Métodos
Animal Los estudios
ND2:
SmoA1 gratis (
SmoA1
) ratones transgénicos fueron un regalo de James Olson (Universidad de Washington, Seattle, WA) [36]. Los ratones se mantuvieron en el vivero Moores Cancer Center de la Universidad de California en San Diego, y todos los experimentos se realizaron con los procedimientos aprobados por la Universidad de California, San Diego comité IACUC.
estereotáxica implantación de células tumorales
estereotáxica implantación de células tumorales se realizó como se describe antes [23, 37]. Desnudo
ratones nu-nu fueron anestesiados utilizando 60 mg /kg de ketamina (Fort Dodge Animal Health) más 20 mg /kg de xilazina (Ben Venue Laboratories), y se colocan en un marco estereotáxico con un adaptador de ratón (Kopf Instruments ). Se realizó una incisión en la línea media del cuero cabelludo sobre el cerebelo, y un pequeño agujero se hizo en el cráneo (3 mm a la derecha y 1 mm anterior al bregma) usando un (punta afilada) biselado 25 G aguja. A 30 de calibre Hamilton jeringa cargada con células estaba montado en un micromanipulador y se introduce a través del orificio a la superficie del lóbulo frontal derecho, a una profundidad de 4,5 mm. Se inyectaron células recién según-CD15 +/- tumorales (no cultivados) en el transcurso de 2 minutos, y se dejó la aguja en su lugar durante cinco minutos más para evitar el reflujo. Por último, la piel se cerró con 6-0 absorción rápida sutura de tripa puro usando una PC-1 aguja 3/8 de corte (Ethicon). Los animales fueron controlados de forma continua durante y en el postoperatorio para asegurar que los ratones que se han recuperado de la cirugía ambulatoria y están sin evidencia de incomodidad. efectos dolorosos y estresantes potenciales de esta cirugía de supervivencia incluyen: 1) la mala alimentación, 2) la pérdida de peso, 3 abeto volantes), 4) la pérdida de la movilidad en la jaula, 5) evidencia de infección en el sitio quirúrgico. La buprenorfina analgésica (0,1 mg /kg) se inyectó en caso de dolor o malestar. suturas y /o grapas no absorbibles se eliminó 10-14 días después de la cirugía. Si no se corrige la morbilidad por nuestras intervenciones, los ratones fueron sacrificados utilizando CO2 seguido por dislocación cervical
Célula de aislamiento y amplificador.; la citometría de flujo
Las células tumorales fueron aisladas de PDX, así como ratones SmoA1Tg 4-6 meses de edad como sigue. Brevemente, el tejido tumoral se cortó en trozos pequeños, y se incubó a 37 ° C durante 30 min en tampón de digestión que consiste en PBS de Dulbecco (DPBS, Life Technologies, Grand Island, NY) con 10 U /ml de papaína (Worthington, Lakewood, NJ) , 200 mg /ml de L-cisteína, y 250 U /ml de DNasa (Sigma, St. Louis, MO). A continuación, el tampón de digestión fue removido y reemplazado con DPBS que contenía inhibidor de 8 mg /ml de tripsina de soja (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), 8 mg /ml de albúmina de suero bovino (BSA, Sigma), y 250 U /DNasa ml, seguido de valoración de tejido utilizando pipetas de la disminución de tamaño de diámetro para obtener una suspensión de una sola célula. Las células se centrifugaron a temperatura ambiente y se resuspendieron en PBS que contenía 200 mg /ml de BSA (PBS /BSA) y se pasó a través de un filtro de células (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) para eliminar los residuos. Esta suspensión se centrifugó a través de un gradiente escalonado de 35% y 65% Percol (Amersham Biosciences), y las células fueron cosechadas a partir de la interfaz de -65% 35%, se lavaron en PBS /BSA. Para la clasificación de CD15 + y células CD15-, las células tumorales se resuspendieron en tampón FACS (DPBS + 2% de FBS) y se tiñeron durante 30 minutos con anticuerpo CD15 (BD Biosciences, Cat no. 340850, antibodiy primaria), se lavó con tampón FACS, tiñeron durante 30 minutos con antibodiy secundario (FITC), y después se analizó o clasificar por medio de un FACSVantage sE citómetro de flujo.
la proliferación celular, la incorporación de BrdU, la apoptosis y el ciclo celular análisis
Las células tumorales fueron aislados como se describe anteriormente [23] a partir de xenoinjertos humanos derivadas del paciente (PDX), así como 4 a 6 meses de edad
SmoA1
PTEN + /+ ratones que presenten signos físicos y de comportamiento de meduloblastoma.
FACS Las células clasificadas CD15 + y CD15- se sembraron a 4 x 10
4 células /pocillo en la unión placas de 96 pocillos en medio libre de suero que contiene suplementos Neurobasal y B27 ultrabajo. Las células se incubaron durante la noche y se trataron con DMSO o inhibidores durante 48 horas. ensayo de viabilidad celular se realizó mediante AlamarBlue® (Roche) según el protocolo del fabricante. Para los estudios de incorporación de BrdU, se aislaron células tumorales de modelo Smo A1 Tg como se describe anteriormente. 2 millones de células tumorales por pocillo se sembraron en placas de 24 pocillos en medio libre de suero que contiene suplementos Neurobasal y B27. Las células se sometieron a pulsos con BrdU durante 30 minutos y después se lavaron con medios para eliminar cualquier resto de BrdU. Las células se recogieron inmediatamente después del pulso ( "30 minutos") y se tiñeron con anticuerpo CD15 como se describió anteriormente. Después las células se fijaron y se tiñeron usando el Kit de flujo FITC BrdU (BD Biosciences) y yoduro de propidio (PI) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El análisis se realizó con un flujo FACS Calibur citómetro (BD Biosciences). Para los estudios de apoptosis, las células CD15 + y CD15- fueron tratados con inhibidor durante 24 horas, seguido de ensayo de actividad de caspasa-3 usando el kit (Roche) o tinción con anexina V
anticuerpo FITC y yoduro de propidio (PI) de acuerdo con las instrucciones del fabricante ( BD, Pharmingen, San Diego, CA). Para el ciclo celular se analizó el contenido de ADN con el análisis de flujo FACS Calibur citómetro (BD Biosciences).
Western El análisis de transferencia
FACS ordenados CD15 + o células CD15- se trataron con diferentes concentraciones de inhibidores o DMSO para 30 minutos y luego se estimularon con IGF 50 ng /ml durante 30 minutos. Las células se lisaron con tampón de lisis RIPA (Pierce) que contiene cóctel inhibidor de la proteasa. Las proteínas se cuantificaron mediante el ensayo de proteína BCA (Pierce) y cantidades iguales de proteína se resolvieron mediante geles de poliacrilamida, se transfirieron a membrana de nitrocelulosa y se sondaron con siguientes anticuerpos primarios: (Cat. No 9271) p-AKT (Ser473), p-AKT ( Thr308) (cat. 9275), AKT (no. 9272), p-p70s6k (Thr389) (no. 9205), p70S6K (no. 2708), p-4EBP1 (Thr37 /46) (no. 2855), 4EBP1 (no. 9452), perk (Thr202 /Tyr204) (no. 9101), p-PRAS40 (Thr246) (no. 2997), PRAS40 (no. 2610), p27 Kip1 (nº de cat . 2552), p-MDM2 (S166) (cat nº 3521), Bad (cat nº 9292) y PARP (cat nº 9542) (todos de Tecnologías de señalización Celular)...;
Cuantitativo en tiempo real de análisis
Se extrajo ARN de CD15 p21 Cip1 /Waf1 (sc-397), Bax (sc-493) y β-actina (SC-47778) de Santacruz. + y células CD15- utilizando RNeasy Kit (Qiagen, Germantown, MD) según las instrucciones del fabricante. Para RTPCR, cDNA se preparó a partir 1 g de la muestra de ARN usando iScript kit de síntesis de cDNA (Bio-Rad, Hercules, CA). cDNA se amplificó mediante reacciones de RT-PCR con 1 × SYBR Supermix verde (Bio-Rad, Hercules, CA) en placas de 96 pocillos en un sistema en tiempo real CFX96 (Bio-Rad, Hercules, CA) utilizando diferentes cebadores para humanos o de ratón genes. La secuencia de los cebadores son como se describen en la Tabla S1. niveles relativos de expresión se normalizaron a GAPDH expresión de acuerdo con la fórmula & lt; 2 ^ (Ct gen de interés-Ct GAPDH) & gt ;.
in vivo
tratamiento BKM120
Para estudiar el efecto de BKM-120 sobre el crecimiento tumoral
in vivo
, CD15 + y CD15- TPC se implantaron por vía intracraneal en el cerebelo de ratones GSN secundarias o por vía subcutánea en ratones nu-nu. Para los tumores subcutáneos, 20 días después del trasplante, los ratones fueron separados al azar en dos grupos: Grupo 1 se le dio vehículo (no tratado) y el grupo 2 se administró 30 mg /kg BKM-120 por sonda oral una vez al día durante 21 días. dimensiones del tumor se registraron cada tercer día y el volumen del tumor se midió utilizando la siguiente fórmula: volumen = 0,5 x longitud x (anchura)
2. Para los tumores intracraneales, 40-50 días después de la implantación, los tumores fueron verificados por MRI y se dividieron en grupos y se trataron como se describe para los tumores subcutáneos. Medición del volumen tumoral para el tumor implantado subcutáneamente hecho por un compás y de tumor implantado intracraneal se realizó mediante imágenes de resonancia magnética (MRI). MRI se realizó con un 1,0-T MRI. Los ratones fueron anestesiados con 2% de isofluorano y los ratones fueron entonces con imagen formada con un Aspecto M2 1,0-Tesla escáner de pequeños animales (Imaging Aspecto; Shoham, Israel). T2, las imágenes se obtuvieron mediante el uso de un tiempo de repetición de 2500 ms, un tiempo de eco de 60 ms, un grosor de corte de 1 mm, campo de visión de 35 mm y un tamaño de matriz de 184 x 184 (en la resolución plano de 35 /184 = 0,19 mm). Para los estudios de RM, los volúmenes tumorales se midieron por tumores segmentar manualmente o bien utilizando el software Image Browser de Varian o el dominio público ImageJ programa de imagen (http://rsb.info.nih.gov/ij). imágenes ponderadas en T2 a veces se utilizan para ayudar a aclarar los márgenes del tumor.
aislamiento de tumores humanos y propagación
MB tejido humano para xenoinjertos derivados del paciente se obtuvo de la resección quirúrgica de los tumores en el Hospital de Niños Rady ( San Diego, CA). Todos los procedimientos que utilizan tejidos humanos fueron aprobados por las Juntas de Revisión Institucional del Hospital Infantil Rady. En la recuperación, el tejido se disoció mecánicamente en una suspensión de una sola célula, luego se inyecta inmediatamente en el cerebro de los ratones del GSN. Cuando los ratones se hizo sintomática, los tumores fueron disociadas de nuevo en una sola célula suspensiones y luego volver a trasplantadas en el cerebro de los ejércitos no tratados previamente para establecer una línea propagado por cada xenoinjerto derivado del paciente.
Análisis de microarrays
SmoA1Tg
células tumorales se clasificaron en poblaciones de CD15 + y CD15- y se utilizan para el aislamiento de ARN usando RNeasy Kit (Qiagen, Germantown, MD). La integridad del ARN se evaluó utilizando un Agilent 2100 Bioanalyzer. Las muestras que presenten la integridad del ARN (RIN) mayor que 8,0 se utilizaron para el análisis de microarrays. ARN se marcó y se hibridó a Affymetrix genoma del ratón 1.0 ST. El conjunto de datos se procesaron con el software de RMA. Se utilizó el análisis de microarrays importancia de software (SAM) para determinar la expresión diferencial con una tasa de falso descubrimiento (FDR) & lt; 1% y un factor de cambio mínimo de 2 a menos que se indique lo contrario. Heatmaps se generaron utilizando el paquete R. datos de expresión génica se transformaron en la puntuación Z y la agrupación jerárquica con se aplicó una distancia euclídea para generar la fila y columna dendrogramas. los datos de microarrays se han depositado en la base de datos pública GEO (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), con el número de acceso GEO es GSE41717.
Subclase y análisis Submap para comparar + CD15 murino TPC a subgrupos humanos MB
subclase MB y análisis Submap, lo que permite una multiplataforma y de especies cruzadas comparación de los datos de microarrays basados en estadísticas de Kolmogorov-Smirnov (33), se utilizó para comparar los tumores murinos a la humana muestras MB se describe en [4]. El módulo de asignación de Subclase en el paquete de software del patrón de genes (www.broadinstitute.org/genepattern) se utilizó para comparar el conjunto de datos del ratón a un conjunto de datos de expresión génica compuesta de MB humanas primarias clasificadas en subtipos moleculares (C1-C6) tal como se define en Cho et Alabama. y una serie de muestras de cerebelo normales y tumores rabdoides teratoides atípicos [4]. resultados de los mapas se representan como una asociación subclase (SA) rellenos de matriz con los valores de p para cada asociación subclase.
análisis
Gene conjunto de enriquecimiento (GSEA)
GSEA se llevó a cabo como se describe en [ ,,,0],38]. En pocas palabras, los genes fueron ordenados en función de su expresión diferencial entre dos clases (CD15 + CD15-) vs. Una puntuación de enriquecimiento (ES) A continuación se calculó para cada conjunto de genes. conjuntos de genes con un valor de p & lt nominales; 0,05 se incluyeron como significativo. Para este análisis, se utilizaron conjuntos de genes comisariada (c2) de MSigDB v.3.0 (http://www.broadinstitute.org/gsea/msigdb/index.jsp). análisis de componentes principales de los 22 genes identificados de borde en la evaluación Submap se compararon a través barrera de las especies en CD15 +, CD15- y la base de datos de expresión génica del tumor MB humana [4].
Resultados
PI- 3K de señalización es muy elevada en CD15 + aislados de TPC
SmoA1 Tg
modelo de ratón meduloblastoma
está bien establecido que el CD15 es un marcador de las células tumorales en la propagación de modelo Ptc +/- de los meduloblastomas SHH impulsadas [ ,,,0],23]. En el presente estudio,
ND2SmoA1
modelo de ratón transgénico se utilizó para caracterizar las vías de señalización necesarios para la proliferación de CD15 + TPC. En primer lugar, hemos realizado experimentos preliminares en nuestro
SmoA1
modelo para validar que CD15 es un marcador de la superficie celular de las células tumorales en la propagación de esta Shh basado en modelos meduloblastoma. Para este fin, se estableció un ensayo de trasplante ortotópico en la que
SmoA1
PTEN + /+ tumor células se clasifican en fracciones CD15 + y CD15-, y 2 x 10
6 células de cada fracción se estereotáxicamente implantan en el cerebelo de
Tarjetas telefónicas ratones desnudos /nu-nu. S1A Fig muestra los datos de FACS de validación que puro CD15 + población está aislado de los tumores. Como se muestra en la Fig S1B, la implantación de solamente CD15 + TPC dio lugar a tumores secundarios dentro de 10-12 semanas que se parecían histológicamente los tumores primarios de los que proceden las células (datos no presentados). En la Figura S1B, se demuestra la tinción Ki67 sólo en tumores secundarios derivados de CD15 + TPC que indica el alto índice de proliferación de estas células en relación a la normal del cerebro. Por otra parte, nuestros resultados demuestran que las células CD15 + única de
SmoA1 PTEN + /+
meduloblastoma pueden generar tumores
in vivo
. Con el fin de evaluar adicionalmente la célula madre como propiedades de CD15 + TPC, se realizó análisis en tiempo real PCR de un número de marcadores de células madre y los resultados demuestran que ciertos marcadores de células madre por ejemplo, Oct4, KLF4, Sox2, CXCR4, POU5f1, nanog, nestina y Musashi son altamente enriquecido en el compartimento CD15 + TPC en el
SmoA1
Tg modelo de ratón (Fig S1C). Con el fin de obtener una mayor comprensión en el tumor se propaga propiedades de las células CD15 +, hemos realizado una serie de análisis bioquímicos y genómicos de las poblaciones de células CD15 + y CD15- aisladas de
SmoA1
tumores Tg. Sobre la base de este análisis, se encontró que el CD15 + población aislada de Smo
A1
Tg modelo de ratón de forma neuroesferas (datos no mostrados), muestra un patrón de expresión distinto y son altamente proliferativas como lo revela el aumento del número de células viables con el tiempo (Fig 1A, panel de la izquierda) y una mayor incorporación de BrdU en las células CD15 + en comparación con células CD15- del mismo tumor (Fig 1A, panel derecho). Este resultado también es apoyado por mayor H
incorporación 3-timidina (datos no mostrados) en CD15 + células en comparación con células CD15-. Los datos presentados en la Tabla S2 y S2 figura muestra que los genes relacionados con la proliferación y supervivencia de las células (Figura S2A), vía de señalización de SHH (S2 B & amp; S2C la figura) y la angiogénesis (Fig S2D) son muy elevados en el CD15 + población. En general, estos datos indican que la capacidad de propagación de tumor de las células CD15 + se asocia con una mayor capacidad para proliferar y una menor tendencia a sufrir apoptosis y la diferenciación.
CD15 + aisladas de TPC
SmoA1
Tg meduloblastoma modelo de ratón son altamente proliferativas y muestra elevada de señalización PI-3K (A) El panel izquierdo muestra la proliferación de las células CD15 + y CD15- aisladas de
Smo A1
tumores. FACS ordenados CD15 + y células tumorales CD15- (n = 4) se cultivaron durante 48 horas en medio libre de suero, seguido de la adición de AlamarBlue® y la incubación de las placas a 37 ° C en 5% de CO
2 durante 6 horas. Las señales de fluorescencia se leyeron como emisión a 590 nm después de excitación a 560 nm. El panel derecho muestra incorporación de BrdU en las células CD15 + y CD15- aislados del Smo A1 Tg. CD15 + y CD15- de tumores Smo se sometieron a pulsos con BrdU como se describe en Materiales y Métodos. (B) FACS CD15 + y CD15- se analizaron las células para la expresión de PTEN y la fosforilación de Akt, 4EBP1, p70s6k y Erk. β-actina se utilizó como control de carga. análisis (C) PCR cuantitativa de ARNm para la expresión de PTEN en FACS ordenados CD15 + y células CD15- (n = 3). los niveles relativos de expresión se normalizaron a GAPDH expresión. El experimento se repitió 3 veces con resultados similares.
PI-3K /AKT se ha demostrado ser importante para la proliferación de TPC en ambos tumores sólidos y leucemia [31-33]. Con el fin de examinar el potencial función mecánica de la vía de señalización PI-3K en la propagación del TPC y la supervivencia en el meduloblastoma, se determinó el estado de activación relativa de PI-3K /AKT en CD15 + CD15- vs. TPC no TPC. El análisis de transferencia Western reveló que las células CD15 + tienen niveles basales más bajos de expresión de PTEN y tienen un eje de señalización de PI-3K activado en comparación con células CD15-, que muestra aumento sustancial de la fosfo-AKT, fosfo-S6 y fosfo-4EBP1 (Fig 1B). Estos resultados fueron apoyados por los niveles aumentados de PTEN mRNA detectado en la población CD15- en comparación con las células CD15 + (Fig 1C). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la expresión de PTEN es downregulated y la señalización de PI-3K es elevada en CD15 + TPC en comparación con la población CD15-.
orientación preferencial de TPC por los inhibidores de PI-3K
in vitro
los resultados anteriores demuestran que la señalización PI-3K está regulada positivamente en CD15 + TPC según lo determinado por los niveles más bajos de PTEN y la activación de AKT. Por lo tanto, la hipótesis de que el tratamiento de células CD15 + con inhibidores de la PI-3K sería preferentemente bloquear la proliferación de CD15 + TPC. Para ello, se utiliza un panel de inhibidores de la PI-3K, SF1126 [39], Bez-235 [40] (productos químicos Selleck), PF4691502 [41] (productos químicos Selleck) y BKM120 [42] (Novartis). Cisplatino, TMZ y NVP-LDE-225 se adquirieron de Selleck químicos. Los resultados en la figura 2A muestran que, aunque los inhibidores de PI-3K dosis dependiente a reducir la proliferación tanto de CD15 + y CD15- TPC aislados de
SmoA1
Tg modelo de ratón, era más potente contra CD15 + población. El IC
50 para BKM120, BEZ, PF4691502 y SF1126 es 0,156 M, 0,167 M, 2,6 M y 4,3 M para las células CD15 + y 6,17 M, 5,54 M, 4,8 M y 19,9 micras o CD15- células, respectivamente. El trabajo previo ha sugerido que BKM120 tiene una excelente penetración de la barrera hematoencefálica [42]. Por lo tanto, elegimos para nuestros BKM120
in vivo
estudios. Las terapias actuales para los niños más pequeños con meduloblastoma han incluido el uso de enfoques quimioterapéuticos multiagente incluyendo los agentes quimioterapéuticos, temozolomida, cisplatino [43, 44] y NVP-LDE225, un antagonista del Smo desarrollado por Novartis [45]. Por lo tanto, se analizó la citotoxicidad relativa de estos fármacos en CD15 + CD15- vs células tumorales. Para estos experimentos, CD15 + y células CD15- aisladas de Smo
A1
modelo Tg fueron tratados con BKM120, cisplatino, TMZ, NVP-LDE225 o combinación de BKM120 con cisplatino o TMZ o NVP-LDE225. Curiosamente, cisplatino (IC
50 11,4 M para las células CD15 + y CD15- 4,5 M para las células) y TMZ (IC
50 30 M para las células CD15 + y CD15- 20 M para las células) no tiene ningún efecto, mientras que NVP LDE-225 (IC
50 2,8 M para las células CD15 + y CD15- 2,5 M para las células) tiene muy menos efecto sobre la supervivencia de las células CD15 + (figura 2B), lo que sugiere que CSC /TPC son resistentes a la quimioterapia convencional. S3 A y S3 B figura muestra el efecto dependiente de la dosis de cisplatino y TMZ en células CD15 + y CD15-. NVP-LDE-225 mostró efectos citotóxicos a dosis altas en las células CD15 + y CD15-, sin ningún efecto significativo a 100 nM conc. (S3 A & amp; S3 B figura) Es interesante que la combinación de BKM120 & amp; cisplatino y BKM120 & amp; TMZ no resultó en el aumento de la actividad de citotoxicidad en las células CD15 + (Figura 2B). Sin embargo, la combinación de BKM120 y NVP-LDE225 mostró sinergia en las células CD15 + (Figura 2B). A continuación se determinó si los inhibidores de la PI-3K pueden bloquear la cascada de señalización elevada PI-3K en CD15 + TPC. Tratamiento de CD15 + células con diferentes dosis de BKM120 durante 30 minutos, la fosforilación inhibe de AKT, sus PRAS40 objetivo y mTOR sustratos aguas abajo PS6, p4EBP1 de una manera dependiente de la dosis (Figura 2C) que presenta una disminución dramática en 2.0 M y la inhibición casi completa a 10,0 M. en tiempo real PCR análisis demostró que la concentración 2 M de BKM120 suprimió por completo la expresión de genes de la vía SHH a saber.,
GLI1
,
gli2
,
N-Myc
,
C-Myc
, y
ciclina D1-gratis (figura 2D).
La orientación preferente de los cursos de política comercial por los inhibidores de la PI-3K
in vitro
Efecto en (a) de inhibidores de PI-3K sobre la proliferación de las células CD15 + y CD15-. células CD15 + y CD15- se cultivaron en medio libre de suero que no contiene aditivo, DMSO (vehículo), BKM-120, BEZ-235, PF-04691502, y SF1126 en diferente conc. Después de 48 horas, se añadió AlamarBlue® y las placas se incubaron a 37 ° C en 5% de CO
2 durante 6 horas. Las señales de fluorescencia se leyeron como emisión a 590 nm después de excitación a 560 nm. células CD15 + y CD15- (B) fueron tratadas con 100 nM conc. de cisplatino, TMZ, NVP-LDE-225 ya sea solo o en combinación con BKM 120 y se analizaron para la viabilidad celular usando Alamar Blue. (C) CD15 + TPC se trataron con BKM120 durante 30 minutos seguido de la estimulación con IGF (50 ng /ml). Los lisados celulares se analizaron mediante transferencia Western para la fosforilación de sustratos de la señalización de PI-3K. (D) Expresión relativa de los genes de la vía SHH en BKM120 tratada (0,2, 2,0 M) y sin tratar CD15 + TPC. niveles relativos de expresión se normalizaron a GAPDH. Los gráficos presentan la media ± SEM de 3-4 ratones en cada grupo para B y D. La significación estadística se evaluó mediante dos muestras
t-test
donde * denota
P Hotel & lt; 0,05, ** denota
P Restaurant & lt; 0,01 y *** denota
P Hotel & lt; 0,001. Experimento se repitió 4-5 veces con resultados similares
sensibilidad diferencial de CD15 + CD15- vs células a la PI-3-quinasa inhibidor.; La inhibición de la vía de PI-3K suprime la proliferación mediante la inducción de la detención del ciclo celular y la inducción de apoptosis en CD15 + TPC pero no en células CD15-
A continuación se investigó si los inhibidores de PI-3K pueden inducir la detención del ciclo celular en el compartimento CD15 + TPC . Para esto, primero evaluamos los porcentajes basales de las células CD15 + y CD15- en diferentes fases del ciclo celular y encontramos que el 67% & amp; 26% de la CD15- TPC estaban en G0-G1 frente a la fase S, respectivamente, mientras que las células CD15 + comprenden 48% y 45% de las células en G0-G1 frente a la fase S, respectivamente (Fig 3A). Por otra parte el tratamiento de CD15 + TPC con BKM120 resultó en la detención del ciclo celular con un aumento proporcional en G0-G1 y una disminución en el número de células en la fase S del ciclo celular (Fig 3A, panel izquierdo), mientras que el tratamiento de CD15- Los datos son representativos de tres experimentos independientes.