Extracto
Montaje y desmontaje de adhesión focal son esenciales para la migración celular y la invasión del cáncer, pero los mecanismos moleculares que regulan estos procesos detallados aún no se han dilucidado. Fosfatidilinositol tipo fosfato quinasa Iγ (PIPKIγ) se une Talin y es necesario para la formación de adhesión focal en células estimuladas con EGF, pero su papel en la regulación de la dinámica de adhesión focal y la invasión del cáncer es poco conocida. Hemos demostrado que la sobreexpresión de PIPKIγ promovió la formación de adhesión focal, mientras que las células que expresan bien PIPKIγ
K188,200R o PIPKIγ
D316K, dos mutantes quinasa-muerta, tenía mucho menos adherencias focales que aquellos que expresan WT PIPKIγ en células CHO-K1 las células y las células de cáncer de colon HCT116. Además, la sobreexpresión de PIPKIγ, pero no PIPKIγ
K188,200R, resultó en un aumento en las tasas de montaje y desmontaje de adhesión focales. El agotamiento de PIPKIγ mediante el uso de shRNA inhibió fuertemente la formación de adherencias focales en células HCT116. La sobreexpresión de PIPKIγ
K188,200R o el agotamiento de PIPKIγ reduce la fuerza de adhesión de las células HCT116 a la fibronectina y se inhibe la capacidad invasiva de las células HCT116. PIPKIγ agotamiento reduce PIP
2 niveles a ~ 40% de control y PIP
3 a niveles indetectables, e inhibido vinculina localizar a adhesiones focales. Tomados en conjunto, PIPKIγ regula positivamente la dinámica de adhesión focal y la invasión del cáncer, la mayoría probablemente a través de PIP
2 vinculina la activación mediada por
Visto:. Wu Z, X Li, Sunkara M, H Spearman, Morris AJ, Huang C (2011) PIPKIγ regula la adhesión focal y la dinámica de la célula del cáncer de colon invasión. PLoS ONE 6 (9): e24775. doi: 10.1371 /journal.pone.0024775
Editor: Maddy Parsons, Kings College de Londres, Reino Unido
Recibido: 11 Julio, 2011; Aceptado: August 17, 2011; Publicado: 12 de septiembre 2011
Copyright: © 2011 Wu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio fue apoyado por Markey Centro de cáncer fondo inicial (Universidad de Kentucky) (Cai Huang) y en parte por la migración Consorcio de donación (NIH GM64346) (a Ken Jacobson, de la Universidad de Carolina del Norte-Chapel Hill). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
adhesiones focales (FAS, también llamadas adherencias célula-matriz) son tipos específicos de grandes ensamblajes macromoleculares en la superficie ventral de las células, que funcionan como dos mecanismos mecánicos y centros de señalización reglamentarios [1], [2]. Se requiere la regulación temporal y espacial de adhesión focal montaje /desmontaje para la migración celular [3]. Durante la migración celular, se forman adhesiones focales nacientes (también llamados complejos focales) para estabilizar lamellipodia en la parte delantera de las células mientras que las adhesiones focales se disuelven en los bordes de salida de las células [4], [5].
adhesión focal montaje y desmontaje también están implicados en la invasión del cáncer, un requisito previo para la metástasis. RRD (abajo reguladas en el carcinoma de células renales) se asocia con la actina y los microtúbulos y estimula la invasión glioma mediante la promoción de desmontaje de adhesión focal [6]. La actina de reticulación filamin proteína A suprime la invasión desmontaje adhesión y cáncer de mama de células focal [7]. señalización Rho /Rock promueve la migración de células tumorales y la invasión mediante la regulación de la dinámica de adhesión focal a través de la caveolina-1 fosforilación [8]. FAK promueve también el desmontaje de adhesión focal y la invasión del cáncer [9], [10], [11]. dinámica de adhesión focal y vías de señalización que regulan este proceso podría ser por lo tanto un objetivo atractivo para la terapia del cáncer.
Muchas moléculas se han demostrado para regular la dinámica de adhesión focales. FAK regula el volumen de negocios de adhesión focal [9], [12], probablemente a través de un dynamin y dependiente de microtúbulos vía [13]. Paxilina, un adaptador de adhesión focal, también modula la dinámica de adhesión focal por JNK y PAK mediada por fosforilación [14], [15]. Talin activa integrinas e inicia la formación de adhesión focal [16], [17], [18], mientras que la escisión de Talin por calpaína media la adhesión focal desmontaje [19]. Calpaína también escinde FAK y paxillin para modular la dinámica de adhesión focal [20], [21]. Hemos demostrado que la ubiquitinación mediada por Smurf1 del dominio cabeza talina, uno de los dos productos de escisión, juega un papel importante en el desmontaje de adhesión focal y la migración celular [22]. ACF7, un microtúbulo y proteína de unión a actina filamentosa, regula la adhesión focal de montaje /desmontaje a través de su actividad de ATPasa [23]. Sin embargo, los mecanismos moleculares que controlan focal conjunto de adhesión /desmontaje no se entienden completamente.
Tipo de fosfatidilinositol fosfato quinasa I gamma (PIPKIγ) es una enzima que cataliza la fosforilación dependiente de ATP de fosfatidilinositol 4-fosfato (PI (4 ) P) para generar PI (4,5) P
2, que regula una variedad de procesos biológicos, incluyendo la formación de adhesión focal [24]. PIPKIγ tiene un dominio catalítico de quinasa bien conservado en la región central [25]. Dentro del dominio catalítico, hay un subdominio llamado el bucle de activación, que determina el sitio de fosforilación en el anillo de inositol del sustrato. PIPKIγ interactúa fuertemente con la talina y compite por la unión con la cola β integrina [26] talina, [27]. Se localiza en las uniones adherentes en las células epiteliales [28], [29]. Se ha informado de que PIPKIγ se requiere para la formación de adhesión focal en células migratorias [30]. Sin embargo, las funciones precisas de las actividades lípido cinasa de PIPKIγ en la dinámica de adhesión focal no están definidos.
En el presente estudio, se investigó el requisito de la actividad quinasa de lípidos de PIPKIγ en la dinámica de adhesión focal y la invasión del cáncer de colon . Nuestros resultados identifican un papel esencial de PIPKIγ en el montaje focal adhesión /desmontaje y el cáncer de invasión.
Resultados
PIPKIγ promueve la formación de adhesión focal
Para examinar el posible papel de PIPKIγ en formación de adhesión focal, las células CHO-K1 fueron transfectadas con EGFP-PIPKIγ o vector EGFP, respectivamente. Las células se re-sembraron en fibronectina, se fijaron con paraformaldehído, se incubaron con un anticuerpo monoclonal anti-paxillin, y luego se tiñeron con DyLight 549 conjugado de cabra anti-IgG de ratón. adhesiones focales se alinearon alrededor de los bordes de las células transfectadas con el vector EGFP, con pocas adherencias focales en los centros de las células, mientras que la expresión PIPKIγ estimuló drásticamente la formación de adhesión focal en los centros de las células (Fig. 1A). La sobreexpresión de la PIPKIγ estimula un aumento en los números de adhesión focal (Figura 1B.) Y el aumento ha sido aportada principalmente por pequeñas adherencias focales (& lt; 3 m
2) (Fig. 1C). La estimulación de la formación de adhesión focal por PIPKIγ se basa en su interacción con la talina, porque PIPKIγ
W647F, un mutante que es deficiente en la interacción con la talina, no fue capaz de promover la formación de adhesión focal (Figura 1A, B, & amp.; C).
(A) imágenes TIRF de células CHO-K1 que expresan EGFP, EGFP-PIPKIγ WT o EGFP-PIPKIγ
W647F. Las células fueron transfectadas transitoriamente con pEGFP-vector, -PIPKIγ WT o -PIPKIγ
W647F, y después se tiñeron para paxillin. Barra de escala, 20 micras. (B) Expresión de PIPKIγ pero no PIPKIγ
W647F causó un aumento en el número de adhesión focal (n = 15, la barra de error = Media ± SEM; vectorial
vs
WT, P & lt; 0,001; WT
vs
W647F, P & lt; 0,001; vectorial
vs
W647F, P & gt; 0,05). (C) la distribución de la zona de adherencias focales en células que expresan EGFP, EGFP-PIPKIγ WT o EGFP-PIPKIγ
W647F.
se requiere la actividad quinasa PIPKIγ para la estimulación de la formación de adhesión focal
PI (4,5) P
2 se une Talin y refuerza la interacción entre Talin y la integrina β cola, la estimulación de la integrina agrupación [31]. PI (4,5) P
2 también se une vinculina y desenmascara los sitios de unión de actina y Talin en vinculina, promoviendo la formación de adhesión focal [32]. PI Por lo tanto, estimulada por PIPKIγ (4,5) P
2 síntesis podrían ser esenciales para la promoción de la formación de adhesión focal. Para probar esta hipótesis, la mutación de dos residuos de lisina, K188 y K200, a la arginina residuos dentro del sitio de unión a ATP de PIPKIγ. El mutante PIPKIγ
K188,200R y el WT se purificaron a partir de células CHO-K1 y se examinaron las actividades quinasa
in vitro fotos: por el uso de la espectrometría de masas para cuantificar la producción de PI (4,5) P
2 de PI (4) P. Como se muestra en la Fig. 2A, la mutación en K188 y K200 reducción de la actividad quinasa en un 95%. EGFP-etiquetados mutante PIPKIγ
K188,200R y WT PIPKIγ se expresaron de forma estable en células CHO-K1, y se examinaron sus efectos sobre la formación de adhesión focal después de la tinción paxillin. Las células que expresan de forma estable WT PIPKIγ forman adherencias focales en los bordes y en los centros de las células, mientras que las células que expresan PIPKIγ
K188,200R, similares a las células parentales, poseían pequeñas adherencias focales, la mayoría de los cuales eran alrededor de los bordes de la células, y tenían un defecto en la difusión (Fig. 2B). El análisis cuantitativo indicó que PIPKIγ aumentó adhesiones focales en más de 2 veces, mientras que PIPKIγ
K188,200R no promueven significativamente la formación de adhesión focal (Fig 2C & amp;. D). Estos resultados indican que la actividad PIPKIγ es esencial para la formación de adhesión focal en células CHO-K1.
(A) Análisis de las actividades de PIPKIγ y PIPKIγ
K188,200R. imágenes TIRF (B) de células CHO-K1 que expresan
K188,200R y las células CHO-K1 parentales PIPKIγ o PIPKIγ. Las células parentales y células que expresan EGFP-PIPKIγ WT o -PIPKIγ
K188, 200R se tiñeron para paxillin. Barra de escala, 20 micras. (C) Análisis cuantitativo de los números de adhesión focal (por célula) en las células parentales y células que expresan PIPKIγ o PIPKIγ
K188,200R (n = 30, barra de error = media ± SEM; parental vs PIPKIγ, P & lt; 0,001; los padres vs PIPKIγ
K188,200R, P & gt; 0,05). (D) la distribución de la zona de adhesiones focales en las células parentales y células que expresan PIPKIγ y PIPKIγ
K188,200R.
A fin de verificar el requisito de la actividad PIPKIγ para la formación de adhesión focal, probamos la capacidad de otra quinasa mutante muerto, PIPKIγ
D316K [33], para promover la formación de adhesión focal como se describe anteriormente. Como se muestra en la Fig. S1, el número medio de adhesión focal (por célula) en células que expresan PIPKIγ
D316K fue de aproximadamente 45, que es aproximadamente la misma que en células que expresan EGFP vector (Fig. 1). Las adherencias focales en células que expresan PIPKIγ
D316K acumulada en los bordes de las células, con muy pocas adhesiones focales en el centro de las células. Este resultado confirma el papel esencial de la actividad PIPKIγ en la formación de adhesión focal.
La actividad de PIPKIγ es esencial para su promoción de la dinámica de adhesión focal
Para examinar si se requiere la actividad lípido cinasa de adhesión focal PIPKIγ dinámica, células CHO-K1 que expresan de forma estable EGFP-PIPKIγ o -PIPKIγ
K188,200R fueron transfectadas con mDsRed-paxillin y luego en placas en platos MatTek (con un cubreobjetos de vidrio en la parte inferior) recubiertos previamente con fibronectina (5 mg /ml ) y se cultivaron durante 3 hr. TIRF imágenes de mDsRed-paxillin fueron tomadas usando un microscopio Nikon TIRF y la temperatura se mantuvo a 37 ° C usando un sistema de microscopio de incubación INU-TIZ-F1 (Tokai Hit). Las imágenes se registraron en intervalos de 1 min para un período de 120 min. Las constantes de montaje de adhesión focal y la tasa de desmontaje se calcularon como se describe anteriormente [22]. El conjunto de la FA y las constantes de velocidad de desmontaje en células que expresan PIPKIγ
K188,200R fueron 0,083 ± 0,014 y 0,072 ± 0,010 min
-1, respectivamente, que son similares a los de las células CHO-K1 normales que se informó anteriormente [ ,,,0],22], mientras que el montaje FA y constantes de velocidad de desmontaje fueron 0,190 ± 0,019 y 0,136 ± 0,014 min
-1, respectivamente, en las células que expresan WT PIPKIγ (Fig. 3). Este resultado indica que se requiere la actividad quinasa de lípidos de inositol de PIPKIγ por su estimulación de montaje y desmontaje de adhesión focal.
células CHO-K1 (A) que expresan de forma estable o PIPKIγ PIPKIγ
K188,200R fueron transfectadas transitoriamente con mDsRed-paxillin. Las células se sembraron en la fibronectina y la dinámica de paxillin se analizaron mediante microscopía de lapso de tiempo TIRF. Las puntas de flecha apuntan a dinámico (paneles superiores) y estables (paneles inferiores) las adhesiones focales. (B) La superposición de 0 y 24 min en "A". (C) Cuantificación de las constantes de montaje adhesión y desmontaje de tasa de actividad en las células que expresan PIPKIγ o PIPKIγ
K188,200R. Cuantificaciones se expresan como media ± s.e.m. de 50 adhesiones focales a partir de 10 células. Asamblea, WT vs K188,200R, P & lt; 0,00005; desmontaje, p. & lt; 0,005
Un papel esencial en la formación de PIPKIγ adhesión focal en células de cáncer de colon
adhesiones focales han sido implicados en la regulación de la invasión del cáncer, mientras que el papel de las adhesiones focales en células de cáncer de colon no ha sido bien definido. Para determinar si la actividad de PIPKIγ influye en la formación de adhesión focal en células de cáncer de colon, las células HCT116 que expresan de forma estable EGFP-PIPKIγ o -PIPKIγ
K188,200R se sembraron en fibronectina y se tiñeron para paxillin. Como se muestra en la Fig. 4A, la mayoría de las adhesiones focales se encuentra a la región periférica, y las células HCT116 que expresan PIPKIγ
K188,200R tenido mucho menos adherencias focales que los que expresan la enzima WT. El número de adhesión focal media en células que expresan WT PIPKIγ era 22,5 /célula, mientras que en células que expresan PIPKIγ
K188,200R era 11,5 /célula, las cuales fueron menos que los observados en las células CHO-K1 (Fig. 4B) . Además, PIPKIγ
K188,200R tenía más efecto sobre las adhesiones focales más pequeños que los de mayor tamaño (Fig. 4C).
(A) Imágenes TIRF de células CHO-K1 que expresan PIPKIγ o PIPKIγ
K188,200R. Las células que expresan de forma estable EGFP-PIPKIγ WT o -PIPKIγ
K188, 200R se tiñeron para paxillin. Barra de escala, 20 micras. (B) PIPKIγ
K188, 200R no logró estimular un aumento en el número de adhesión focal (n = 10, la barra de error = media ± E.E.M; prueba t pareada, P & lt; 0,005). distribución (C) Área de adhesiones focales en células que expresan PIPKIγ y PIPKIγ
K188,200R.
Para probar si PIPKIγ es esencial para la formación de adhesión focal en las células HCT116, las células HCT116 fueron infectadas con el recombinante lentivirus que expresan PIPKIγ shRNA o shRNA control y se seleccionaron con puromicina. Como se muestra en la Fig. 5A, la expresión de shRNA PIPKIγ resultó en una reducción dramática en el nivel PIPKIγ endógena de las células HCT116. Después las células se sembraron en fibronectina y se tiñeron para paxillin. Sorprendentemente, PIPKIγ caída casi abolió la formación de adhesión focal en células HCT116 (Fig. 5B). PIPKIγ agotamiento reducido número de adhesión focal en aproximadamente un 74% (Fig. 5C). Diferente de PIPKIγ
K188,200R, PIPKIγ shRNA tenía más efecto sobre las adhesiones focales más grandes que los más pequeños (Fig. 5D). Estos resultados indican un papel esencial de PIPKIγ en la formación de adhesión focal en células de cáncer de colon HCT116. Este efecto dramático de PIPKIγ caída no se produjo en 231 MDA-MB-células humanas de cáncer de mama, donde PIPKIγ knockdown única formación de adhesión focal parcialmente inhibida (datos no mostrados).
(A) Expresión de PIPKIγ en células establemente expresando el control shRNA y PIPKIγ shRNA. imágenes (B) TIRF de células HCT116 que expresan de forma estable el control y PIPKIγ shRNA. Las células se infectaron con partículas lentiviral que llevan control o PIPKIγ shRNA, seleccionados con puromicina, y se tiñeron para paxillin. Barra de escala, 20 micras. (C) PIPKIγ agotamiento inhibió la formación de adhesión focal en células HCT116. (N = 10, la barra de error = Media ± SEM; prueba t pareada, P & lt; 0,0001). (D) Área de distribución de adherencias focales en células que expresan el control y PIPKIγ shRNA
PIPKIγ modula positivamente la adhesión la fuerza de las células de cáncer de colon a la fibronectina
para examinar si la actividad de PIPKIγ regula la fuerza de adhesión celular en la fibronectina, las células HCT116 que expresan de forma estable EGFP-PIPKIγ o -PIPKIγ
K188,200R fueron teñidas con calceína-AM y se sembraron en una placa de 96 pocillos que fue pre-recubierta con diferentes concentraciones de fibronectina. La fluorescencia de calceína fue leído, y a continuación, se invirtió la placa y se centrifugó a 150 xg durante 5 min. La fluorescencia de calceína se leyó de nuevo. Como se muestra en la Fig. 6A, la diferencia de fuerza de adhesión celular entre las células que expresan PIPKIγ
K188,200R y el WT no fue significativo a altas concentraciones de fibronectina. Sin embargo, a bajas concentraciones de fibronectina, las células que expresan PIPKIγ
K188,200R tenían significativamente menor fuerza de adhesión en comparación con las que expresan el WT. PIPKIγ desmontables también causó una disminución significativa en la fuerza de adhesión celular en las células HCT116 (Fig. 6B). Estos resultados indican que la actividad PIPKIγ regula la fuerza de adhesión celular en las células de cáncer de colon.
(A) Expresión de PIPKIγ
K188,200R inhibe las células HCT116 se adhieren a bajas concentraciones de fibronectina. Las células que expresan establemente PIPKIγ o PIPKIγ
K188,200R se incubaron con calceína-AM y se sembraron en una placa de 96 pocillos recubierta con fibronectina para los ensayos de centrifugación. (B) El agotamiento de PIPKIγ inhibe las células HCT116 que se adhieren a la fibronectina. Las células que expresan de manera estable el control y PIPKIγ shRNA se incubaron con calceína-AM y se sembraron en una placa de 96 pocillos recubierta con fibronectina para los ensayos de centrifugación. F
A /F
= 0 (fluorescencia después de la centrifugación) ÷ (fluorescencia antes de la centrifugación).
PIPKIγ es esencial para la invasión, pero no la migración de las células de cáncer de colon
se ha informado de que PIPKIγ juega un papel en la migración celular. Para probar si PIPKIγ regula la migración de células de cáncer de colon HCT116, se emplearon ensayos de curación de heridas en el tiempo transcurrido para examinar la migración de las células HCT116 que expresan EGFP-PIPKIγ y -PIPKIγ
K188,200R, respectivamente, en presencia de HGF . Como se muestra en la Fig. S2 A & amp; B, las células que expresan PIPKIγ
K188,200R emigraron ligeramente más rápido que aquellos que expresan la enzima WT medido mediante ensayos de curación de heridas de lapso de tiempo. Además, el agotamiento de PIPKIγ no tuvo ningún efecto significativo en la migración de las células HCT116 en transwell ensayos (Fig S2 C & amp;. D). Estos resultados sugieren que la actividad PIPKIγ no es esencial para la migración de células de cáncer de colon HCT116.
Para probar el papel de PIPKIγ en la invasión del cáncer, la invasión de las células HCT116 que expresan de forma estable PIPKIγ shRNA o un control de shRNA en el ausencia y presencia de HGF se examinó mediante el uso de ensayos de invasión de Matrigel. Como se muestra en la Fig. 7 (A & amp; B), PIPKIγ caída resultó en una reducción significativa en la invasión de las células HCT116, ya sea en ausencia o en presencia de HGF. El basal y capacidades invasivas estimuladas por HGF de células HCT116 que expresan establemente PIPKIγ
K188,200R también son significativamente inferiores a los de las células que expresan la enzima WT (Fig 7C & amp;. D). Estos resultados indican que PIPKIγ regula positivamente la invasión de células de cáncer de colon HCT116.
(A) El agotamiento de PIPKIγ mediante el uso de shRNA inhibe la invasión de células HCT116. Las capacidades invasivas de las células que expresan de manera estable el control shRNA o PIPKIγ shRNA fueron examinados en ausencia y en presencia de HGF (50 ng /ml) por ensayos de invasión basados en Matrigel. (B) Cuantificación de la invasión de las células HCT116 que expresan de manera estable el control shRNA o PIPKIγ shRNA. n = 5, barra de error = media ± E.E.M; ctrl vs PIPKIγ, p & lt; 0,01; ctrl HGF vs PIPKIγ HGF, p & lt; 0,01. (C) Expresión de PIPKIγ
K188,200R inhibió la invasión de las células HCT116. Las células que expresan de forma estable EGFP-PIPKIγ o -PIPKIγ
K188,200R se ensayaron para determinar las capacidades invasivas en ausencia y en presencia de HGF. (D) La cuantificación de la invasión de las células HCT116 que expresan de forma estable EGFP-PIPKIγ o -PIPKIγ
K188,200R. n = 3, barras de error = media ± E.E.M; WT vs K188,200R, P & lt; 0,01; WT HGF vs K188,200R HGF, P & lt;. 0.005
PIPKIγ regula la formación de adhesión focal a través de la activación de vinculina por PI (4,5) P
2
Para diseccionar el mecanismo por el cual PIPKIγ regula la formación de adhesión focal, que se propuso analizar los niveles de polifosfoinosítidos en las células HCT116 que expresan PIPKIγ shRNA o un control de shRNA mediante el uso de la espectrometría de masas. El agotamiento de PIPKIγ en las células HCT116 no tuvo ningún efecto significativo en el nivel de PIP, pero causó una reducción significativa en PIP
2 nivel (tenga en cuenta que estos métodos no pueden distinguir enantiómeros posicionales de estos lípidos por lo que es posible que PI (3,4) P
2 puede contribuir significativamente a los niveles residuales de PIP
2 en estas células). Curiosamente, en apoyo de esta idea desmontables de PIPKIγ reducida PIP
3 niveles por debajo del límite de detección de nuestro ensayo (Fig. 8). Estos resultados indican que PIPKIγ es una enzima clave responsable de la producción de PI (4,5) P
2 y PI (3,4,5) P
3 en células HCT116.
polifosfoinosítidos a partir de células que expresan de forma estable fueron extraídos de control de shRNA o PIPKIγ shRNA y derivatizarse usando diazometano de trimetilsililo, y luego se midieron mediante espectrometría de masas. N = 4, barras de error = media ± E.E.M; PIP, P & gt; 0,05; PIP2, P = 0,0034; PIP3, p = 0,001.
Para ver si la PI (3,4,5) P
3 es esencial para la formación de adhesión focal en células de cáncer de colon, las células HCT116 se trataron con LY294002, una inhibidor específico de la fosfatidilinositol 3-quinasa, y la formación de adhesión focal en estas células se examinaron después de la tinción paxillin. LY294002 (20 M) no tuvo efecto significativo sobre la formación de adhesión focal (datos no mostrados). Tomados en conjunto con las observaciones anteriores, este hallazgo indica que PI (4,5) P
2, pero no PI (3,4,5) P
3, se requiere para la formación de adhesión focal.
PI (4,5) P
2 se une y activa vinculina y está implicada en la regulación de la formación de adhesión focal [32]. Si mediada PIPKIγ-producción de PI (4,5) P
2 es esencial para la formación de adhesión focal en las células HCT116, el agotamiento de PIPKIγ reduciría PI (4,5) P
2 niveles y evitar vinculina de localización de adhesiones focales. Para probar esta hipótesis, las células PIPKIγ-agotado endógenos se infectaron con retrovirus que expresan una PIPKIγ codón modificado (de rescate) (Fig. 9A), y las células se tiñeron para vinculina. Vinculina rara vez se localiza en las adhesiones focales en células HCT116-agotado PIPKIγ, mientras que re-expresión de PIPKIγ en-agotadas las células PIPKIγ dio como resultado un aumento dramático en la focal vinculina adhesión localizada (Fig. 9B). El análisis cuantitativo indicó que PIPKIγ rescate restaurado formación de adhesión focal en-agotadas las células PIPKIγ (Fig 9C & amp;. D), en comparación con los datos de la Fig. 5. Estos datos sugieren que PIPKIγ puede regular la formación de adhesión focal a través de PI (4,5) P activación mediada por vinculina 2
.
(A) re-expresión de etiquetado PIPKIγ-ZZ de rescate en las células que PIPKIγ ha sido derribado (KD) expresando de forma estable PIPKIγ shRNA. Las células PIPKIγ-KD se infectaron con partículas retrovirales que llevan rescate ZZ-etiquetados PIPKIγ seleccionado con neomicina. ZZ-PIPKI se detectó mediante transferencia de Western con un anticuerpo policlonal anti-PIPKIγ. imágenes (B) TIRF de células PIPKIγ-KD y las células que expresan KD células PIPKIγ de rescate se sembraron en placas con fondo de vidrio pre-recubiertas con fibronectina (5 g /ml), se fijaron y se tiñeron para vinculina. Barra de escala, 20 micras. (C) PIPKIγ de rescate restaura la formación de adhesión focal en células PIPKIγ-KD. (N = 11, la barra de error = Media ± SEM; prueba t pareada, P & lt; 0,0001). (D) Área de distribución de adherencias focales en células PIPKIγ-KD y KD células que expresan los PIPKIγ rescate
Discusión
Además de servir como precursor de otros segundos mensajeros, PI (4,5) P
2 sí se une muchas proteínas de adhesión focal del citoesqueleto y y se cree que es un regulador clave de la dinámica de adhesión focal [ ,,,0],34]. PI (4,5) P
2 se une vinculina para desenmascarar los sitios de unión de Talin-en vinculina [32]; también se une Talin estabilizando así las interacciones Talin-integrina [35]. PIPKIγ se cree que es la enzima que genera PI (4,5) P
2 espacial y temporalmente para la formación de adhesión focal durante la migración celular [27], [34]. Por otra parte, PI (4,5) P
2 no se ha detectado en las adhesiones focales y el papel de la regulación de la dinámica de PIPKIγ en adhesión focal es controvertida [36]. PIPKIγ se ha demostrado que se requiere para la formación de adhesión focal durante la migración celular estimulada por EGF [30], mientras que también se ha informado de que la expresión de PIPKIγ causado redondeo celular y adhesión focal desmontaje [26].
Mostramos aquí que la expresión de PIPKIγ a bajos niveles en células CHO-K1 estimuló la formación de adhesión focal (Fig. 1), mientras que los mutantes de quinasa muerta, PIPKIγ
K188,200R y PIPKIγ
D316K no para promover la formación de adhesión focal (Fig . 2, Fig. 4 y la Fig. S1). Además, PIPKIγ abolió caída casi completamente la formación de adhesión focal en células de cáncer de colon HCT116 (Fig. 5). Además, la expresión de PIPKIγ promovió el montaje de adhesión focal y también las tasas de desmontaje, mientras PIPKIγ
K188,200R era incapaz de hacerlo (Fig. 3). Estos resultados identifican un papel esencial en la regulación de PIPKIγ la dinámica de adhesión focal.
A pesar de la evidencia directa es deficiente, PI (4,5) P
2 ha sido también implicado en la regulación de la activación de la integrina. PI (4,5) P
2 se une Talin y bloquea su auto-inhibición (interacción cabeza-cola) promoviendo así su interacción con la integrina β cola [35]. También estimula la integrina agrupación [31]. El aumento tanto en la interacción y la integrina agrupación Talin-integrina debe estimular la activación de la integrina. Encontramos que las células HCT116 que expresan PIPKIγ
K188,200R tienen significativamente menor fuerza de adhesión en comparación con las que expresan el WT, y el agotamiento de PIPKIγ por shRNA también causó una disminución significativa en la fuerza de adhesión celular en las células HCT116 (Fig. 6), lo que sugiere que PIPKIγ puede modular la activación de la integrina en las células de cáncer de colon
.
se ha informado de que PIPKIγ se requiere para la migración estimulada por EGF de 231 MDA-MB-células humanas de cáncer de mama y células de cáncer de ovario humano HeLa [30] , [37]. Sin embargo, nuestros resultados aquí muestran que ni expresar PIPKIγ
K188,200R, un mutante quinasa-muerto, ni agotamiento de PIPKIγ inhibir la migración de las células HCT116 (Fig. S2). Las células MDA-MB-231 y HeLa migran mucho más rápido que las células HCT116, lo que sugiere que PIPKIγ es esencial para las células que se mueven rápidamente, pero no para células como las células HCT116 lenta migración. Esto es apoyado por nuestro resultado inédito que PIPKIγ
K188,200R inhibe drásticamente la migración de las células clon A, una línea celular de cáncer de colon en rápido movimiento.
Por otro lado, PIPKIγ parece ser necesario para la la invasión de células de cáncer de rápido ambos (tal como MDA-MB-231) y-invasor lento (como HCT116). El agotamiento de PIPKIγ se ha demostrado que inhiben la invasión estimulada por EGF de MDA-MB-231 células [37], y, o bien expresando PIPKIγ
K188,200R o el agotamiento de PIPKIγ inhibe la invasión de las células HCT116 (Fig. 7). Estos resultados indican un papel esencial de PIPKIγ en el control de la invasión del cáncer.
Estudios anteriores se han centrado en el papel de desmontaje de adhesión focal en la regulación de la invasión del cáncer. DRR promueve la invasión glioma mediante la promoción de la adhesión focal desmontaje [6]. Filamina A suprime la invasión de células de cáncer de mama mediante la inhibición de la adhesión focal desmontaje [7]. FAK promueve también el desmontaje de adhesión focal y la invasión del cáncer [9]. Sin embargo, nuestros resultados muestran que tanto la expresión de PIPKIγ
K188,200R, el mutante quinasa-muerto, y el agotamiento de PIPKIγ impedir la formación de adhesión focal, que acompaña a la inhibición de la invasión de HCT116 (Fig. 4, 5 y 7). Además, PIPKIγ estimula tanto el montaje de adhesión focal y desmontaje (Fig. 3), lo que sugiere que la rotación de adhesión focal, que requiere el montaje de adhesión focal y desmontaje espacialmente y temporalmente, regula la invasión de las células cancerosas.
PIPKIγ es una principal enzima que controla el metabolismo polyphosphoinositide en células HCT116. PIPKIγ desmontables resultados en la reducción significativa en el nivel de PI (4,5) P
2 y disminuye PI (3,4,5) P
3 niveles aún más sustancialmente (Fig. 8). PI (3,4,5) P
3 juega un papel importante en la tumorigénesis y metástasis del cáncer. Sin embargo, PIPKIγ caída no afecta a la activación de Akt, un objetivo importante de la PI (3,4,5) P
3, en las células HCT116 (datos no mostrados), probablemente porque Akt puede ser activada por PI (3, 4) P
2, que no se ve directamente afectado por PIPKIγ.
La inhibición de la PI 3-quinasa usando LY294002 no influir en la formación de adhesión focal en las células HCT116, lo que sugiere que PI (4,5) P
2 en lugar de PI (3,4,5) P
3 es responsable de la formación de adhesión focal mediada por PIPKIγ. PI (4,5) P
2 promueve la unión a talina y actina vinculina y se ha demostrado ser esencial para la formación de adhesión focal [32]. Nuestro resultado muestra que PIPKIγ regula de localización vinculina a adherencias focales en células HCT116 (Fig. 9). Tomados en conjunto, lo más probable es que PIPKIγ regula la formación de adhesión focal a través de PI (4,5) P
2 mediada por la activación vinculina.
invasión del cáncer es un proceso complicado, que requiere regulación espacial y temporal de la célula -matrix adherencias, salientes de células y matriz-degradación [38]. PI (4,5) P
2 generada por PIPKIγ regula la invasión del cáncer a través de la modulación de la dinámica de adhesión celular. Aunque PI (3,4,5) P
3 no es esencial para la formación de adhesión focal, sino que también puede jugar un papel en otros aspectos de la invasión del cáncer, probablemente a través de la activación de Rac [39].
Materiales Métodos y
Reactivos
anticuerpo
anti-paxillin (clon 5H11) fue de Millipore; Anti-PIPKIγ anticuerpo policlonal fue de Señalización Celular Tecnología; El anticuerpo anti-tubulina y pLKO1 lentivirus PIPKIγ shRNA (secuencia: CCG GGC AGT CCT ACA GGT TCA TCA ACT CGA GTT GAT GAA CCT GTA GGA CTG TCT TTT G) fueron de Sigma; DyLight 549 conjugado de cabra anti-ratón IgG (H + L) fue de Thermo Scientific; Fibronectina y HGF recombinante eran de Akron Biotech; el factor de crecimiento reducido Matrigel fue de BD Bioscience; El plásmido pEGFP-PIPKIγ fue un regalo del Dr. Mark Ginsberg (Universidad de California-San Diego); Pfu Ultra fue de Agilent Technologies; Los cebadores de ADN fueron sintetizados por Integrated DNA Technologies.
Construcción de plásmidos
El plásmido pEGFP-PIPKIγ
W647F se generó por PCR pfu basada en el uso de ultra-pEGFP PIPKIγ como plantilla y 5 ' GAT GAG AGG AGC TTT GTG TAC TCC CCG CTC-3 '/5'-CGG GAG GGA GTA CAC AAA GCT CCT CTC ATC-3' como cebadores. pEGFP-PIPKIγ
K188,200R y pZZ-PIPKIγ
K188,200R fueron creados por PCR usando pEGFP-PIPKIγ y pZZ-PIPKIγ [40] como plantillas, respectivamente, y en secuencia 5'-GAC GAG TTC ATC ATC AGG ACC GTC ATG CAC-3 '/5' GTG CAT GAC GGT CCT GAT GAT GAA CTC GTC-3 'y 5'-GTT CCT GCA GAG TCG TCG CCC TGG CTA C-3' /5 'GTA GCC AGG CAG GAG AAC CTG CAG GAA C-3 'como cebadores.