Extracto
Antecedentes
Nuestros resultados de investigaciones previas mostraron que tipo II GMPc proteína quinasa dependiente (PKG II) pudiera bloquear la activación del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y por consiguiente inhibir la proliferación y la relacionada MAPK /ERK mediada por la transducción de señales de la línea celular de cáncer gástrico BGC-823, lo que sugiere que PKG II podría inhibir otras vías de transducción de señales de EGFR activado y relacionados actividades biológicas de células de cáncer gástrico. Este documento fue diseñado para investigar la inhibición potencial de la PKG II sobre la actividad de la migración EGF /EGFR inducida y las vías de transducción de señales relacionadas.
Los resultados Metodología /Principales
En la línea celular de cáncer gástrico AGS, expresión y actividad de PKG II se aumentaron mediante la infección de las células con adenoviral construcción que codifica PKG II cDNA (Ad-PKG II) y el tratamiento de las células con cGMP análogo 8-PCPT-cGMP. La fosforilación de proteínas se detectó mediante Western Blot y pequeñas proteínas Ras G activas y Rac1 se midió por el método de "pull-down". Se detectó actividad de migración de las células con el equipo trans-así. La unión entre PKG II y EGFR se detectó con Co-IP. Los resultados mostraron EGF estimula la migración de células AGS y el efecto estaba relacionado con PLCγ1 y las vías de transducción de señales ERK mediada. PKG II inhibió la actividad de la migración inducida por EGF y EGF bloqueado iniciado por la transducción de señales de PLCγ1 y MAPK /ERK vías mediadas a través de la prevención de EGF inducida por Tyr y Tyr 992 1068 fosforilación de EGFR. PKG II ató con EGFR y causó la fosforilación de la treonina de la misma.
Conclusión /Importancia
Nuestros resultados confirman la inhibición sistémica de PKG II sobre la migración inducida por EGF y la transducción de señal relacionada de PLCγ1 y MAPK /vías ERK mediada, lo que indica que la PKG II tiene una inhibición fargoing de EGF relacionados /EGFR transducción de señales y actividades biológicas de las células de cáncer gástrico a través de la fosforilación de EGFR y el bloqueo de la activación de la misma
Visto:. Jiang L, T Lan , Chen Y, Sang J, Li Y, Wu M, et al. (2013) PKG II inhibe EGF /EGFR inducida por migración de células de cáncer gástrico. PLoS ONE 8 (4): e61674. doi: 10.1371 /journal.pone.0061674
Editor: Vladislav V. Glinskii, Universidad de Missouri-Columbia, Estados Unidos de América
Recibido: 30 de septiembre de 2012; Aceptado: March 12, 2013; Publicado: 16 Abril 2013
Derechos de Autor © 2013 Jiang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China, No.81272755, No.31040002, No.81001100 y No.31100974; La subvención para la innovación de la Universidad de Jiangsu. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Tipo II proteínas quinasas dependientes de GMPc (PKG II) es una serina /treonina quinasa y la acumulación de datos de la investigación indican que esta quinasa tuvo un papel importante en la regulación de actividades de la célula biológica, como la proliferación y la apoptosis, especialmente en las células tumorales . En 2004, Cook
et al encontraron que
PKG II podría inducir la apoptosis de las células del estroma prostático cultivadas humanos [1]. En 2009, Swartling
et al
informó que PKG II inhibió la proliferación de las células neuroglioma humanos y la inhibición se relaciona con la disminución de la expresión del factor de transcripción Sox9 y la fosforilación de Akt [2]. En 2011, Fallahian
y col Hola, ha encontrado que GMPc podría inducir la apoptosis de las células del cáncer de mama y este efecto se relaciona con PKG II [3]. Durante nuestras investigaciones, se encontró que la expresión y la actividad de PKG II en líneas celulares de cáncer gástrico humano fueron significativamente menores que la de las células normales de la mucosa gástrica [4]. El estudio adicional en nuestro laboratorio mostró que PKG II podría inhibir la proliferación de líneas celulares de cáncer gástrico y el bloque de EGF señal inducida transducción de la vía mediada por ERK MAPK /a través de la prevención de la activación de EGFR por EGF [5], [6]. Dado que la activación de EGFR puede iniciar varias vías de transducción de señales, incluyendo MAPK /ERK, PI3K /Akt, JAK /STAT y las vías mediadas por PLCγ1 [7], [8], el efecto de bloqueo de PKG II sobre la activación de EGFR sugiere que esta enzima puede tener un efecto inhibidor de amplio rango en la transducción de señales y las actividades biológicas relacionadas de células de cáncer gástrico. Este documento ha sido diseñado para confirmar este efecto inhibidor de toda la gama de PKG II a través de la investigación de la inhibición de la PKG II sobre la actividad de la migración inducida por EGF y la transducción de señales relacionada en células de cáncer gástrico.
Resultados
la migración celular inducida por EGF PKG II inhibe la que está asociada con la transducción de señales de PLCγ1 y MAPK /ERK mediada por Pathways
la migración celular es importante en la fisiología normal y en la enfermedad. Adquisición de capacidad migratoria de las células cancerosas es una característica que contribuye a la propagación de las células tumorales metastásicas a órganos distantes. Los datos recientes muestran que el EGF podría estimular la migración de células cancerosas. El mecanismo a través del cual el EGF estimula la migración celular no está clara, pero algunos datos indicó que el EGF puede hacer esto mediante la iniciación de la transducción de señales de PLCγ1 y las vías de MAPK /ERK mediada. En este experimento, se detectó el efecto estimulante de la migración de EGF en las células AGS y utilizamos inhibidor de los componentes clave en las vías de señalización para investigar la posible transducción de señales asociado con el efecto. Los resultados mostraron que el tratamiento con EGF aumenta la actividad de migración de las células AGS y ambos MEK (componente clave de la vía mediada por ERK MAPK /) U0126 inhibidor y PLCγ1 inhibidor U73122 inhibido EGF inducida por la migración, lo que indica que EGF estimula la actividad de migración celular a través de la activación de ambos MAPK /ERK y PLCγ1 vías de transducción de señal mediada por (Fig. 1).
actividad de migración de las células AGS se analizó con transwell sistema. Las células fueron infectadas con Ad-LacZ o Ad-PKG II para 48 h y privadas de suero o /n. En Ad-lacZ + EGF y grupos Ad-PKGII + EGF, EGF (100 ng /ml) se añadió al medio de cultivo; En Ad-LacZ + cGMP + EGF y Ad-PKGII + cGMP + EGF grupos, las células se trataron con 8-PCPT-cGMP para 1 h y luego EGF (100 ng /ml) se añadió al medio de cultivo. El tiempo de migración fue de 12 h. R: figuras representativas de células migradas teñidas con Giemsa (× 200); B: El número de células migradas en cada grupo. Los datos mostrados son la media ± SD de 5 experimentos independientes, cada uno realizado por duplicado (* P & lt; 0,01, comparado con el grupo de LacZ;
& amp; P & lt; 0,01, comparado con el grupo lacZ + EGF).
PKG II Bloques EGF inducida Tyr 992 y Tyr 1068 la fosforilación de EGFR
Cuando EGF se une con EGFR, causa auto-fosforilación del receptor. Hay varios sitios de auto-fosforilación que están conectados a diferente vía de transducción de señales. La tirosina 992 y tirosina 1068 están entre los sitios de auto-fosforilación de EGFR y se asocian con PLCγ1 mediada y la señalización de MAPK /ERK mediada respectivamente. En este experimento, se investigó el efecto inhibidor de PKG II en la tirosina 992 y tirosina 1068 fosforilación de EGFR en células AGS tratados de manera diferente mediante el uso de transferencia Western. Los resultados mostraron que el tratamiento con EGF causó un aumento de 14 pliegues de la tirosina 992 y un aumento de 8 pliegues de la tirosina 1068 fosforilación de EGFR. En las células infectadas con Ad-PKG II y estimuladas con cGMP, la fosforilación disminuyó significativamente (Fig. 2, 3). Esto indicó que la PKG II podría prevenir inducida por EGF tirosina 992 y tirosina 1068 fosforilación de EGFR y en consecuencia inhibir PLCγ1 mediada por la señalización de MAPK y /ERK mediada.
células AGS fueron infectadas con Ad-LacZ o Ad-PKG II durante 48 h y suero de hambre o /n. En Ad-lacZ + EGF y grupos Ad-PKGII + EGF, las células se incubaron con EGF (100 ng /ml) durante 5 min. En Ad-LacZ + cGMP + EGF y Ad-PKGII + cGMP + EGF grupos, las células se trataron con 8-PCPT-cGMP para 1 h y luego con EGF (100 ng /ml) durante 5 min. Las células se recogieron y se lisaron como se describe en materiales y métodos. El lisado celular se sometió a transferencia Western con anticuerpo contra Tyr 992 fosfo-EGFR y EGFR. Total de los niveles de proteína EGFR fueron utilizados como control de carga. Se realizó un análisis de densitometría de cuantificar las bandas positivas. R: Un representante de los primeros resultados de tres experimentos independientes. B: Resultados del análisis de densitometría. Los datos mostrados son la media ± SD de 3 experimentos independientes (* P & lt; 0,05, en comparación con grupo LacZ y el grupo PKG II;
& amp; P & lt; 0,05, comparado con el grupo LacZ + EGF, LacZ + cGMP (250 M) + EGF grupo y el grupo PKG II + EGF).
células AGS se trataron mismo que se describe en la Figura 2. se aplicó Western Blot para detectar Tyr 1068 fosforilación de EGFR y se realizó un análisis para cuantificar la densitometría bandas positivas. R: Un representante de los primeros resultados de tres experimentos independientes. B: Resultados del análisis de densitometría. Los datos mostrados son la media ± SD de 3 experimentos independientes (* P & lt; 0,05, en comparación con grupo LacZ y el grupo PKG II;
& amp; P & lt; 0,05, comparado con el grupo LacZ + EGF, LacZ + cGMP (250 M) + EGF grupo y el grupo PKG II + EGF).
PKG II Previene EGF provocado principales eventos de transducción de señales Camino
(1) la activación mediada por PLCγ1 PLCγ1.
PLCγ es el componente de aguas abajo de los receptores tirosina quinasas (RTK). Tiene dos isoformas: PLCγ1 se distribuye de forma ubicua y PLCγ2 se expresa principalmente en células hematopoyéticas. La activación de PLCγ1 requiere su reclutamiento a la membrana y de asociación, a través de su dominio SH2, con las RTK activado tal como EGFR. Esta asociación dará como resultado la fosforilación de residuos de tirosina en PLCγ1, en particular en la tirosina 783, y un aumento de su actividad enzimática. Se aplicó el método IP para aislar PLCγ1 y luego utilizó el método de Western blot para detectar la fosforilación de PLCγ1. Los resultados mostraron que el tratamiento con EGF causó un aumento evidente de Tyr783 fosforilación de PLCγ1 y el aumento de la actividad PKG II a través de la infección de las células con Ad-PKG II y la estimulación de las células con cGMP impedido eficazmente la fosforilación inducida por EGF de PLCγ1 (Fig. 4 ).
células AGS se cultivaron en placas de 100 mm y se infectaron con cualquiera de Ad-LacZ o Ad-PKG II. A continuación, las células se privaron de suero o /n y tratados de manera diferente: en el grupo Ad-lacZ, sin tratamiento farmacológico; en el grupo Ad-LacZ + EGF, las células se incubaron con EGF (100 ng /ml) durante 5 min; en el grupo + cGMP + EGF Ad-PKG II, las células se incubaron con 250 M 8-PCPT-cGMP para 1 h y seguido por incubación con EGF (100 ng /ml) durante 5 min. Inmunoprecipitación con anticuerpos contra PLCγ1 se realizó para precipitar PLCγ1 y la fosforilación de PLCγ1 precipitado fue analizar por Western Blot con anticuerpos contra fosfo- PLCγ1 (Tyr783). Los resultados mostrados son representativos de tres experimentos independientes.
(2) la formación de DAG.
Una vez que se activa, PLCγ1 puede catalizar la hidrólisis de fosfatidilinositol 4,5-bisphos-fosfato (PI-4,5P
2) en inositol 1,4,5-trifosfato (IP
3) y diacilglicerol (DAG), dos moléculas que regulan la movilización intracelular de Ca
2 + y la proteína quinasa actividad C respectivamente. Para observar los efectos de EGF y PKG II en la formación de DAG, se utilizó el método ELISA para detectar la concentración de DAG en células AGS. Los resultados mostraron que en EGF estimula las células AGS, el nivel de DAG aumenta obviamente y pre-infección con Ad-PKG II y el tratamiento con 8p-CPT-GMPc inhibe la formación de DAG causada por la estimulación con EGF (Fig. 5).
células AGS se trataron mismo que el descrito en la Figura 4. La concentración de DAG en los extractos celulares se midió mediante ELISA. Los datos mostrados son la media ± SD de 5 experimentos independientes, cada uno realizado por duplicado [* P & lt; 0,05, comparado con el grupo LacZ;
& amp; P. & Lt; 0,05, comparado con el grupo lacZ + EGF, LacZ + cGMP (250 M) + EGF grupo y el grupo PKG II + EGF]
(3) Ca
2 + liberación
.
IP3 y DAG son segundos mensajeros en la transducción de señal vía mediada por PLCγ1. IP3 se sabe que estimula la liberación de calcio de las reservas internas. Utilizamos calcio indicador de fluo-3 /AM para detectar calcio en el citoplasma. Los resultados mostraron que el tratamiento con EGF aumenta la liberación de Ca
2 + de retículo endoplásmico (ER) para citoplasma y de alta expresión y actividad de PKG II inhibió significativamente la liberación, invirtiendo el efecto del tratamiento con EGF (Fig. 6).
Cualquiera de Ad-PKG II-infectado o células que crecen en una placa de 96 pocillos Ad-lacZ-infectado se privaron de suero durante 12 h, cargado con 5 M de membrana indicador de calcio permeable fluo-3 /AM para 30 min a 37 ° C en DMEM. Después de cargar con el fluo-3 /AM, las células se lavaron con solución PBS y se suspendieron en DMEM, y luego se incubaron con 8-PCPT-cGMP (100 μΜ y 250 μΜ) durante 30 min, y después se estimularon con EGF (100 ng /ml) durante 5 min. Las mediciones de fluorescencia se realizaron con un sistema confocal Olympus Fluoview-500. Los datos mostrados son la media ± SD de 5 experimentos independientes, cada uno realizado por duplicado [* P & lt; 0,05, comparado con el grupo LacZ;
& amp; P & lt; 0,05, comparado con el grupo lacZ + EGF, LacZ + cGMP (250 M) + EGF grupo y el grupo PKG II + EGF]
(4) La activación de PKCa..
PKCa, una isoforma de la proteína quinasa C, es un componente clave de la vía de señalización mediada por PLCγ1 y pueden ser activados por Ca
2 + y DAG. Al ser activado, PKCa transloca del citosol a la membrana de las células. Por lo tanto, la cantidad de PKCa sobre la membrana representa la activación de PKCa. En este experimento, se investigó el efecto inhibidor de PKG II sobre la activación de PKCa en células AGS tratados de manera diferente mediante el uso de transferencia Western. Los resultados mostraron que dentro de los cinco minutos después de añadir el EGF al medio de cultivo, la translocación de PKCa del citosol a la membrana aumentó dramáticamente y la translocación fue inhibida por pre-infección de las células con Ad-PKG II y tratamiento con 8-PCPT-cGMP ( La Fig. 7).
células AGS se trataron mismo que el descrito en la Figura 4. fraccionamiento subcelular en fracciones de citosol y la membrana se llevó a cabo mediante el uso de la membrana y el citosol Kit Protein Extraction. Western Blot se utiliza para detectar PKCa o bien en la membrana o en el citosol. Se realizó un análisis de densitometría de cuantificar las bandas positivas. R: Un representante de los primeros resultados de tres experimentos independientes. B: Resultados del análisis de densitometría. Los datos mostrados son las medias ± SD de 3 experimentos independientes (* P & lt; 0,05, comparado con el grupo de LacZ;
& amp; P & lt; 0,05, comparado con el grupo lacZ + EGF).
( 5) la activación de CaMKIIα.
los estudios sobre la regulación de Ca
2 + /calmodulina (CaM) dependiente de quinasa II alfa (CaMKIIα), que es una isoforma principal de CaMKII, han sugerido que cuando Ca
2 + /CaM se une con CaMKIIα, autofosforilación intra-molecular se produce y la fosforilación mantiene la activación persistente de la enzima. El anticuerpo contra fosfo-CaMKIIα (Thr286) se aplicó en la transferencia Western para detectar la fosforilación de CaMKIIα. Los resultados mostraron que en células AGS tratados con EGF, Thr286 fosforilación de CaMKIIα aumentó en casi 2,5 pliegues y la infección con Ad-PKG II y tratamiento con 8-PCPT-GMPc inhibe el aumento de la fosforilación inducida por EGF (Fig. 8).
células AGS se trataron mismo que el descrito en la Figura 2. Western Blot se aplicó para detectar la fosforilación de CAMK IIα. Se realizó un análisis de densitometría de cuantificar las bandas positivas. R: Un representante de los primeros resultados de tres experimentos independientes. B: Resultados del análisis de densitometría. Los datos mostrados son la media ± SD de 3 experimentos independientes (* P & lt; 0,05, en comparación con grupo LacZ;
& amp; P & lt; 0,05, comparado con el grupo LacZ + EGF, LacZ + cGMP (250 mM) + grupo EGF y PKG II + EGF grupo).
la activación inducida por EGF inhibe la PKG II de los componentes clave de MAPK /ERK mediada por la transducción de señales Camino
(1) la activación de MAPK /ERK .
MAPK /ERK es el componente clave de la vía MAPK /ERK mediada. Se requiere la fosforilación en ambos treonina 202 y la tirosina 204 residuos de ERK1 y treonina 185 y la tirosina 187 residuos de ERK2 para la activación enzimática completa. El anticuerpo contra p-ERK1 /2 (Thr 202 /Tyr 204) se aplicó en la transferencia Western para detectar la fosforilación dual de ERK. Los resultados mostraron que dentro de los cinco minutos después de la adición de EGF al medio de cultivo de células, la fosforilación de ERK1 /2 en células AGS aumentó drásticamente (10 pliegues) y la fosforilación fue inhibida por pre-infección de las células con Ad-PKG II y la activación de la enzima con 8-PCPT-cGMP (Fig. 9).
células AGS se trataron mismo que el descrito en la Figura 2. se aplicó transferencia Western para detectar la fosforilación de ERK. Se realizó un análisis de densitometría de cuantificar las bandas positivas. R: Un representante de los primeros resultados de tres experimentos independientes. B: Resultados del análisis de densitometría. Los datos mostrados son la media ± SD de 3 experimentos independientes (* P & lt; 0,05, en comparación con grupo LacZ;
& amp; P & lt; 0,05, comparado con el grupo LacZ + EGF, LacZ + cGMP (250 mM) + grupo EGF y PKG II + EGF grupo).
(2) La activación de Ras.
Pequeño G proteína Ras es otro componente clave de la vía de señalización MAPK /ERK mediada. Tiene dos formas en las células: forma activa unida a GTP y la forma inactiva unida a GDP. Una vez Ras está en forma unida a GTP, puede unirse y activar Raf-1 y comenzar las consiguientes activaciones de serina /treonina quinasas en la ruta de señal. Se aplicó el método "pull-down" para detectar la Ras activado. El resultado mostró que después de añadir EGF al medio de cultivo, Ras activa en las células AGS aumentó obviamente dentro de los cinco minutos. La infección de las células con Ad-PKG II y estimularlos con 8-PCPT-GMPc antes de añadir EGF impidió significativamente la activación de Ras inducida por EGF (Fig. 10).
El método "pull-down" se utiliza para detectar la Ras activado. El lisado celular fue preparada y cantidades iguales de proteína se incubaron con perlas de GST-RBD como se describe en materiales y métodos. complejos de unión se recogieron por centrifugación, se resolvieron por SDS-PAGE, se transfirieron a una membrana de PVDF y se sondaron con anti-pan anticuerpo Ras. Los resultados mostrados son representativos de tres experimentos independientes.
La activación inducida por EGF inhibe la PKG II de RAC1
Pequeño proteína G RAC1 es el miembro principal de la familia Rho que juegan papel importante en regulación de la migración de células cancerosas. Tanto PLCγ1 y MAPK /ERK mediada por la transducción de señales pueden activar RAC1 y, posteriormente, estimular la migración celular. Para confirmar aún más el efecto inhibidor de PKG II el EGF /EGFR inducida por la señalización que está relacionada con la migración, se aplicó el método "pull-down" para detectar la inhibición de la PKG II sobre la activación de RAC1. El resultado mostró que el tratamiento EGF causó un aumento evidente de RAC1 activo y alta actividad de PKG II inhibe eficazmente la activación de RAC1 (Fig. 11). Esto proporciona una prueba más de la inhibición de la PKG II sobre la migración inducida por EGF de células de cáncer gástrico.
Se utilizó el método "pull-down" para detectar el RAC1 activado. El lisado celular fue preparada y cantidades iguales de proteína se incubaron con perlas de GST-PBD como se describe en materiales y métodos. complejos de unión se recogieron por centrifugación, se resolvieron por SDS-PAGE, se transfirieron a una membrana de PVDF y se sondaron con anticuerpo anti-RAC1 pan. Los resultados mostrados son representativos de tres experimentos independientes.
PKGII interactúa con EGFR y causa Thr-phoshporylation del receptor
El mecanismo a través del cual PKGII bloquea la activación inducida por EGF de EGFR fue investigado preliminarmente en este experimento. Co-inmunoprecipitación se aplica para detectar la interacción entre PKGII y EGFR. Western Blot con la cacerola contra la fosforilación de treonina anticuerpo se utilizó para detectar la fosforilación de treonina de EGFR causada por PKGII. Los resultados de Co-inmunoprecipitación mostraron que en células AGS infectadas con Ad-PKG II y estimuladas con 8-CPT-cGMP, la unión directa entre PKG II y EGFR se detectó (Fig. 12, panel A). Los resultados de la transferencia Western mostraron que la activación de PKG II provocó la fosforilación de treonina de EGFR (Fig. 12, panel B). Esto indicó que PKG II bloqueó la activación de EGFR a través de unión con el receptor y causa la fosforilación de la misma
A:. Los resultados de Co-inmunoprecipitación. células AGS se cultivaron en placas de 100 mm y se infectaron con Ad-PKG II. Después de ser suero de hambre o /n, se trató con 250 M 8-PCPT-cGMP para 1 h, y se incubaron con EGF (100 ng /ml) durante 5 min, las células se lisaron y el lisado se inmunoprecipitaron con anti-PKG II anticuerpo o IgG de isotipo coincidente. Los precipitados se sondaron con anticuerpo anti-EGFR. Cinco porcentaje de lisado de células se utilizó como un control de entrada de la proteína. También se realizó el experimento contrario, es decir, se inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-EGFR y se sondaron con anticuerpo anti-PKG II,. B: Los resultados de la inmunoprecipitación y transferencia Western. células AGS se trataron igual que A, y el lisado se-inmunes se precipitaron con anticuerpo contra EGFR para enriquecer la proteína. Los precipitados se sometieron a transferencia de Western con anticuerpo anti-fosforilación de treonina pan. Los resultados mostrados son representativos de tres experimentos independientes.
Discusión
En la actualidad, dos proteínas quinasas dependientes de GMPc (PKG), PKG I y II PKG, se han identificado en células de mamíferos [10], [11]. PKG que se distribuya ampliamente en el cuerpo y debido a su efecto inhibidor sobre el crecimiento tumoral y la invasión y la inducción de efecto sobre la apoptosis de las células tumorales, se ha identificado como un supresor de tumores [12]. La expresión de PKG II es más tejido con restricción [13]. Durante mucho tiempo, en contraste con el efecto anti-tumor bien demostrado de PKG I, no hay datos de investigación indican claramente el papel antitumoral de PKG II y esta quinasa solamente estaba implicado en varias funciones fisiológicas incluyendo la secreción intestinal, el crecimiento óseo, y el aprendizaje y la memoria [14]. Sin embargo, el interés de la investigación sobre PKG II está aumentando y algunas nuevas funciones de PKG II se han encontrado recientemente, incluyendo el papel de PKG II en la regulación del canal de sodio epitelial y mecano-transducción de señales [15] - [17]. Más importante aún, la acumulación de datos de investigación indicó que PKG II estaba relacionada con la proliferación y la apoptosis en algunas células, especialmente en células tumorales, lo que sugiere fuertemente el papel potencial de esta enzima en la regulación de las actividades biológicas de las células tumorales [1] - [6].
existe EGFR en la superficie de todas las células. Con un peso molecular de 170KD, EGFR tiene un dominio extracelular, un dominio de membrana de cruz y un dominio intracelular. El dominio intracelular de EGFR tiene 542 residuos de aminoácidos y se puede dividir en membrana aproximada sub-dominio, tirosina quinasa sub-dominio, y C-terminal del subdominio [18]. El proceso de activación de EGFR incluye la fosforilación de la tirosina de su dominio intracelular y diferentes sitios de fosforilación en el dominio están relacionados con diferentes vías de señalización. Cuando se activa el EGFR, se puede reclutar proteínas efectoras a su fosforilada subdominio C-terminal e inicia las vías mediada por proteínas efectoras [19], [20]. Entre los sitios de fosforilación, la tirosina 1068 y 1086 están relacionados con la vía mediada por ERK MAPK /y la tirosina 992 y 1173 están relacionados con la vía de señalización mediada por PLCγ [7], [8]. Nuestros resultados anteriores mostraron que PKG II podría inhibir inducida por EGF de tirosina 1068 fosforilación de EGFR en la línea celular de cáncer gástrico BGC-823 [6], planteando la cuestión de si PKG II puede inhibir la fosforilación de otros sitios tirosina en EGF /EGFR y, posteriormente, tener una inhibición de toda la gama de transducción de señales de EGFR /EGF inducida y actividades biológicas relacionadas de células de cáncer gástrico.
en este trabajo, se investigó la acción de PKG II sobre la actividad de la migración inducida por EGF de la línea celular de cáncer gástrico AGS. El resultado mostró que PKG II tenía una inhibición significativa en la migración celular provocada por EGF. Esto proporciona evidencia adicional para revelar el efecto inhibidor de PKG tumor II. Datos de la investigación han demostrado que entre los /EGFR iniciado vías de transducción de señales EGF, PLCγ1 y MAPK /ERK vías de transducción de señales mediada están relacionados con la actividad de migración [21], [22]. Para confirmar esto en células de cáncer gástrico, se utilizó inhibidor del componente de transducción de señales para identificar la participación de MAPK /ERK y las vías mediadas por PLCγ1 en el proceso. Los resultados mostraron que MEK U0126 inhibidor y PLCγ1 inhibidor U73122 bloqueado parcialmente la actividad de migración EGF /EGFR inducida de las células AGS, que indica que ambas vías de transducción de señales han participado en el proceso de regulación. Para dilucidar el potencial de acción inhibidora de PKG II en estas vías de transducción de señales, que primero exploramos el efecto inhibidor de PKG II en EGF inició PLCγ1 mediada por vía de transducción de señales. Los resultados mostraron que PKG II impedido todos los eventos principales en esta vía de transducción de señales, incluyendo la Tyr 992 fosforilación /activación de EGFR, la fosforilación /activación de PLCγ1, la formación de segundo mensajero DAG, la liberación de calcio en citoplasma, y la activación de PKC y CAMK IIα. Para la inhibición de la PKG II /EGFR inducida por la vía de transducción de señales EGF MAPK /ERK mediada, nuestros trabajos anteriores han demostrado que la PKG II inhibe la activación de todos los componentes clave en la vía inducida por EGF en la línea celular de cáncer gástrico BGC-823 [ ,,,0],6]. En este trabajo, se investigó el efecto inhibidor de PKG II el EGF /EGFR inducida por la activación de los componentes clave en esta vía. Los resultados confirmaron que PKG II inhibe la activación inducida por EGF de la proteína Ras y MAPK /ERK en las células AGS, lo que sugiere que PKG II también inhibió EGF /EGFR inducida por la transducción de señales de MAPK /ERK vía mediada en esta línea celular de cáncer. Estos resultados revelaron sistemáticamente que PKG II inhibe la migración inducida por EGF de células de cáncer gástrico a través del bloqueo de EGF /EGFR iniciado la transducción de señales de PLCγ1 y MAP /ERK rutas mediadas por
.
La transducción de la señal de ambos PLCγ1 y MAP /ERK mediadas por las vías pueden activar la proteína G pequeña Rac1, que es un componente clave en la regulación de la migración celular [23], [24]. Para confirmar la inhibición de la PKG II en este importante evento en la migración inducida por EGF de células de gas, se aplicó el método "pull-down" para comprobar la actividad de Rac1 en células AGS tratados de manera diferente. Los resultados mostraron que durante la migración inducida por EGF, Rac1 se activó y la activación se relaciona tanto con PLCγ1 y la señalización de MAP /ERK mediada. Además, PKG II inhibe la activación inducida por EGF de Rac 1. Esto confirmó aún más el efecto inhibidor de PKG II en EGF /EGFR iniciado la migración celular.
EGFR está estrechamente asociado con tumorigenensis. Más de expresión y mutación de EGFR suceder a menudo en la mayoría de tipos de cáncer. Datos de la investigación mostró que más del 50% -70% de cáncer de pulmón, cáncer de colon y cáncer de mama tienen una alta expresión de EGFR [25]. Además, los pacientes de cáncer con sobre-expresión de EGFR por lo general tienen un mal pronóstico. Por ejemplo, el EGFR se detectó un exceso de expresión en el 60% de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) y el pronóstico de los pacientes eran pobres, con una supervivencia de sólo 4-5 meses [26].
in vitro
experimentos confirmaron que la sobreexpresión de EGFR causó transformación de los NIH-3T3, Rat-1 y células NRK y la activación de EGFR bloqueando inhibió la proliferación de algunas células tumorales [27]. Por consiguiente, el EGFR es la primera receptor del factor de crecimiento tomado como objetivo la terapia del cáncer. Varios métodos para inhibir la actividad de EGFR y la transducción de señales relacionada, incluyendo anticuerpos específicos contra EGFR y los inhibidores de EGFR, recibieron una intensa investigación [28] - [30]. métodos nuevos y más eficaces en el bloqueo de EGFR mediada por la transducción de señales serán útiles en la terapia del cáncer. Por lo tanto, el hallazgo de que PKG II puede inhibir la activación de EGFR y la consiguiente transducción de señales tiene una gran importancia. Se sugiere fuertemente que PKG II es un potencial inhibidor de EGFR endógeno y proporcionará nueva pista sobre estrategia de terapia del cáncer.
Los datos de investigación demostraron que algunas proteínas quinasas pueden causar la fosforilación de EGFR y afectar a su activación y /o destino. Por ejemplo, la proteína quinasa C (PKC) puede causar la fosforilación de la treonina 654 de EGFR y regula la unión al receptor y la internalización [31]. Se requiere serina 1046/1047 (/1047 Ser1046) sitio de fosforilación para la desensibilización de EGFR en las células tratadas con EGF [32] .En nuestros experimentos, hemos detectado la fosforilación de Thr654 y Ser1046 /1047 del EGFR y encontraron que la PKG II no fue la causa del fosforilación de estos sitios de fosforilación. Sin embargo, nuestros resultados mostraron que existía una interacción directa entre PKG II y EGFR y PKG II causada treonina fosforilación de EGFR. Esto indicó que PKG II bloqueó la activación de EGFR a través de unión con y fosforilar el receptor. El sitio de fosforilación exacta será nuestro próximo objetivo de la investigación.
Materiales y Métodos
Línea Celular y Reactivos
línea celular de cáncer gástrico humano AGS fue proporcionado por el Instituto de Biología Celular (Shanghai, China). Los vectores adenovirales que codifican β-galactosidasa (PAD-LacZ) y PKG II (PAD-PKG II) fueron regalos de tipo Dr. Gerry Boss y el Dr. Renate Pilz en la Universidad de California, San Diego, Modificado medio de Eagle de EE.UU. Dulbecco (DMEM) y suero bovino fetal (FBS) eran de GIBCO (Grand Island, NY). El anticuerpo contra PKG II era de Abgent Biotecnología (San Diego, CA). Cabra anti-β-actina, de ratón anti-pan-Ras, y el ratón anticuerpos anti-PLCγ1 eran de Santa Cruz (Santa Cruz, CA). Rabbit anti-p-EGFR (Tyr1068), conejo anti-p-EGFR de conejo (Tyr992), anti-EGFR, ratón anti-p-ERK (Thr 202 /Tyr 204), conejo anti-ERK y conejo anti-p-PLCγ1 (Tyr783) anticuerpos eran de Señalización celular Tecnología (Danvers, MA). Conejo anti-PKCa y conejo anti-p-CaMK IIα (Thr286) eran de Bioworld Tecnología (St. Louis Park, MN). Anticuerpo de conejo anti-p-Thr fue de Abcam (MA, EE.UU.) peroxidasa .Horseradish (HRP) y conjugado con anticuerpos secundarios eran de Jackson Immuno Research Laboratories (West Grove, PA). El celular analógico cGMP permeable 8-PCPT-cGMP era de Calbiochem (San Diego, CA). EGF, U73122 y U0126 fueron de Sigma (St. Louis, MO). Electroquimioluminiscencia (ECL) reactivos eran de Millipore (Billerica, MA). Ca
2 + indicador de Fluo-3 /hy membrana y el citosol Kit de Extracción de proteínas eran de Beyotime (Jiangsu, China). diacil-glicerol humana (DAG /DG) Kit ELISA fue de Cusabio Biotech Co., Ltd. (Newark, DE).