Extracto
La quimiorresistencia es la principal causa de fracaso del tratamiento en el cáncer colorrectal avanzado (CRC). Sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen a este fenómeno aún no se han dilucidado. En un trabajo anterior hemos identificado bajos niveles de PKM2 como un marcador de resistencia a oxaliplatino putativa en líneas de células HT29 CRC y también en los pacientes. Con el fin de evaluar cómo influye en la respuesta PKM2 oxaliplatino en las células CRC, silenciamos PKM2 utilizando siRNAs específicos en HT29, SW480 y células HCT116. prueba MTT demostraron que PKM2 silenciamiento resistencia en células HT29 y SW480 y la sensibilidad en las células HCT116 inducida. Los mismos experimentos en células nulas HCT116 p53 isogénicas y doble silenciamiento de p53 y PKM2 en las células HT29 no pudieron demostrar una influencia de p53. Mediante el uso de tinción con azul de tripano y las pruebas /PI FITC-anexina V detectamos que PKM2 desmontables se asocia con un aumento de la viabilidad celular, pero no con una disminución en la activación de la apoptosis en las células HT29. Microscopía de fluorescencia reveló PKM2 translocación nuclear en respuesta a oxaliplatino en células HCT116 y HT29, pero no en las células HTOXAR3 OXA-resistente. Por último, mediante el uso de una matriz de qPCR hemos demostrado que oxaliplatino y PKM2 silenciar los patrones de expresión de genes de muerte celular alterados incluyendo los de BMF, que fue significativamente mayor en las células HT29 en respuesta a oxaliplatino, de una manera dosis y dependiente del tiempo, pero no en siPKM2 -HT29 células y HTOXAR3. BMF silenciamiento de genes en células HT29 conducen a una disminución en la muerte celular inducida por oxaliplatino. En conclusión, nuestros datos informan de nuevos roles no glucolíticas de PKM2 en respuesta al daño genotóxico y propone BMF como un posible gen diana de PKM2 estar involucrado en respuesta oxaliplatino y resistencia en las células CRC
Visto:. Un Ginés , Bystrup S, Ruiz de Porras V, Guardia C, Musulén E, Martínez-Cardús A, et al. (2015) PKM2 localización subcelular participa en Resistencia oxaliplatino Adquisición en líneas celulares de cáncer colorrectal HT29 humano. PLoS ONE 10 (5): e0123830. doi: 10.1371 /journal.pone.0123830
Editor Académico: Hiromu Suzuki, Universidad Médica de Sapporo, Japón
Recibido: 16 Septiembre, 2014; Aceptado: 7 Marzo 2015; Publicado: May 8, 2015
Derechos de Autor © 2015 Ginés et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue financiado por la beca bianual de la Fundación Olga Torres 2008-2009 (http://www.fundacioolgatorres.org/beques_d-investigacio/) a EMB AGM AA AMC EM JLM
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CRC) sigue siendo uno de los más frecuentes. Las causas de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo. La tasa de supervivencia global a los 5 años es inferior al 10% en estadios avanzados de la enfermedad y el tratamiento de quimioterapia sigue siendo esencial para estos pacientes. A pesar de la disponibilidad de nuevas terapias diana contra EGFR o VEGF, combinaciones de oxaliplatino (OXA) con fluoropirimidinas siguen siendo los regímenes de primera línea más utilizados en el tratamiento del cáncer metastásico [1, 2]. Citotoxicidad de OXA se genera principalmente a través de la formación de aductos de platino-ADN resultantes en la transcripción del ADN y el bloqueo de replicación. En consecuencia, se activa varias vías de señalización que conducen a la reparación de daño del ADN y /o la activación de programas de muerte celular [3], que a su vez depende, entre otros factores, de la estado mutacional del gen supresor tumoral p53 [4-6]. Sin embargo, es evidente que no todos los pacientes se benefician del tratamiento con OXA procesos de resistencia que representan el obstáculo principal de la eficacia del tratamiento. Quimio-resistencia a los agentes de platino es un proceso complejo y multifactorial en la que varios mecanismos, como el flujo de drogas /modificaciones de flujo de salida, las alteraciones en la reparación de daños en el ADN, disminución de la activación de la muerte celular, la supervivencia de señalización autocrina o alta actividad de desintoxicación podrían participar [7-10]. Por desgracia, la mayoría de los estudios relativos a la resistencia a fármacos de platino se han centrado en el cisplatino y el comportamiento real biológica y mecanismos de respuesta a OXA en células colorrectales es en su mayoría desconocidos.
En los últimos años, muchos estudios se han dirigido su atención a metabolismo de las células tumorales como un mecanismo de adaptación celular a la sensibilidad de drogas [11, 12]. En esta línea, se encontró en un estudio previo que isoforma M2 de la enzima piruvato quinasa (PKM2) está vinculada a la adquisición de resistencia a OXA en un
in vitro
modelo y hemos sido capaces de traducir nuestros resultados en una pequeña cohorte de pacientes CCR metastásico que habían recibido quimioterapia OXA /5-FU [8]. Otros autores han informado de que la expresión y actividad PKM2 está relacionada con la resistencia a cisplatino en las células tumorales gástricas [13] y en células de cáncer colorrectal con la resistencia adquirida a 5-FU tratamiento [14]. Estos hechos indican que esta enzima podría tener un papel importante en los procesos de adquisición de resistencia a diferentes fármacos quimioterapéuticos. Además, se ha demostrado que algunas de las funciones biológicas PKM2 dependen de la translocación nuclear de la enzima que es promovido por diferentes modificaciones post-traduccionales, tales como la fosforilación de tirosina [15-17], lisina acetilación [18], o sumoylation [19] en respuesta a la EGFR factores [20], IL-3 [21] o Oct-4 [22], respectivamente. Mientras que en la mayoría de los mencionados resultados de translocación casos PKM2 en la estimulación de la proliferación celular, se ha demostrado que después de otros tipos de estímulos, como daños en el ADN o el estrés oxidativo, PKM2 transloca al núcleo de las células que conducen a la activación de la muerte celular en un caspasas y Bcl-2 de manera independiente [23].
en el trabajo presentado aquí, hemos querido dilucidar los mecanismos moleculares relacionados PKM2-responsables de la adquisición de resistencia OXA en un
in vitro
modelo descrito previamente por nosotros [24]. Como se muestra, la modulación de la expresión PKM2 sensibilidad OXA alterado no sólo en este modelo celular, sino también en otras líneas celulares de CRC humanos. Se demuestra que PKM2 se transloca al núcleo en respuesta al daño genotóxico causado por OXA en sensible pero no en líneas celulares con resistencia adquirida a la droga y que regula el patrón de expresión de genes de la muerte celular, tales como BMF, que se ha demostrado estar involucrados en la activación de la muerte celular apoptótica y no apoptótica.
Materiales y Métodos
el consentimiento firmado se obtuvo de cada paciente, y el Comité ético de Investigación clínica del hospital Germans Trias i Pujol proporcionó la aprobación para el estudio.
las líneas celulares
células de carcinoma de colon HCT116 y su derivado isogénica con una inactivación selectiva de p53 fueron un regalo del Dr. Vogelstein (Universidad Johns Hopkins School de Medicina). SW480 y HT29 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). Este último se utiliza como las células de los padres del HTOXAR3 sublínea OXA-resistente, que se obtuvo como resultado de la continua y una mayor exposición a OXA tal como se describe anteriormente [9]. Las líneas celulares fueron cultivadas en monocapa en DMEM (HT29, SW480 y HTOXAR3; Invitrogen, Life Technologies) o RPMI 1640 (HCT116 y p53 HCT116 nula; Invitrogen, Life Technologies) suplementado con inactivado por calor al 10% de FCS (Reactiva), 400 unidades /ml de penicilina, 40 mg /ml de gentamicina, y 2 mM de L-glutamina (Sigma) y se cultivaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2. Las células fueron probados periódicamente para la contaminación por
Mycoplasma Opiniones y fueron autenticadas por corto perfiles de repetición en tándem.
Medicamentos
OXA se preparó en agua (1 mM) como solución madre y se almacenan a -20 ° C. Diluciones adicionales de la droga se hicieron en medio de cultivo a concentraciones finales antes del uso.
siRNA transfecciones
Las células se sembraron a 60% de confluencia en el suero y libre de antibióticos medio OptiMem (Invitrogen) en 6 , 12 y placas de 96 pocillos, en función de los siguientes experimentos. PKM2 se silenció de forma transitoria mediante el uso de tres diferentes siRNAs dirigidos PKM2 (ss; NM_002654. NM_182470 NM_182471;; Ambion). P53 y la inhibición de BMF se llevó a cabo con grupos de 4 diferentes siRNAs (Smartpool on-objetivo más:
TP53
,#L-003.329;
BMF
,#L-004393-00, Dhamacon, GE). Como un agente de transfección Lipofectamine utilizamos RNAiMAX (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Un control de la transcripción negativo silenciador (Cat No. AM4611; Ambion) se introdujo en cada experimento. Después de 24 h de la transfección, el medio se reemplazó con DMEM completo o RPMI 1640 suplementado con medios de suero y antibiótico. Validación de PKM2, p53 y caída de BMF se evaluó mediante qPCR y Western blot (WB), solo por WB y sólo por qPCR, respectivamente. En experimentos afinar, siGAPDH 3 nM control positivo; se introdujeron (NM_002046 Ambion) y las células no transfectadas (Mock) para asegurar que la transfección tuvo efectos mínimos sobre la expresión génica, la proliferación y la viabilidad celular (Figura S1)
Western blot
Las células se homogeneizaron en RIPA más tampón [tampón fosfato salino (PBS); NP-40 1%; Na deoxicolato 0,5%; SDS 0.1%; EDTA 1 mM; NaF 50 mM; Navo
3 5 mM] que contiene un cóctel de inhibidores de proteasa libre de EDTA (Roche). La concentración de proteína se determinó por el método de Bradford utilizando el Kit BCA Protein Assay (Pierce) y albúmina de suero bovino como estándar. Veinte microgramos de proteína se cargaron y se sometieron a electroforesis en 10% geles de SDS-PAGE (Invitrogen) y se transfirieron a membranas de PVDF (Bio Rad). Después de 1 h de bloqueo (LICOR Biosciences) membranas se incubaron durante la noche a 4 ° C con un anticuerpo policlonal de conejo anti-PKM2 anticuerpo primario (de señalización de la célula; 1: 1000) o con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-p53 (Abcam; 1: 500). monoclonal de conejo anti-actina (1: 2000) y anticuerpos monoclonales de ratón anti-alfa-tubulina (1: 15.000) (ambos de Sigma Aldrich) se utilizaron como controles internos. Las membranas fueron incubadas con conejo IRDye y secundaria de anticuerpos de ratón (1: 15000) (Licor Biosciences) durante 45 minutos protegido de la luz. Las membranas fueron escaneados mediante el uso del sistema de imágenes Odyssey y se analizaron con el software v2.0 Odyssey (Licor Biosciences).
qPCR
experimentos de expresión génica se realizaron como se describe en un trabajo previo [24]. Retrotranscripción se llevó a cabo con transcriptasa inversa MMLV (Invitrogen) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Los cebadores y sondas para PKM2 (ensayo no. Hs00762869_s1) y BMF (Hs.00372938_m1) análisis de la expresión de ARNm se adquirieron prediseñados de Applied Biosystems. El tamaño del producto de PCR generado con estos cebadores fue de 62 pb para PKM2 y 59 pb para BMF. Relativa cuantificación de la expresión génica se calculó de acuerdo con el método comparativo Ct como se describe en otra parte utilizando 18S (Stratagene) o β-actina (Applied Biosystems) como controles endógenos. En todos los experimentos, sólo se triplica con un valor de Ct inferior a 0.20 SD fueron aceptados. Además, para cada muestra analizada, un control retrotranscriptasa menos se llevó a cabo en la misma placa para asegurar la ausencia de contaminación de ADN genómico.
MTT
La citotoxicidad de OXA fue evaluada por el 3- ( 4, 5-dimetiltiazol-2-il) bromuro de 2,5-difeniltetrazolio prueba (MTT). Las células se sembraron y se transfectaron en placas de microtitulación de 96 pocillos (Nunc) a una densidad de 1000 (HT29 y SW480) y 2.000 células /pocillo (HCT116). Cuarenta y ocho horas después de la transfección siRNA, se añadió OXA a diferentes concentraciones; la viabilidad celular se determinó 24 h después de la incubación mediante el ensayo de MTT (Roche Diagnostics) [25]. concentraciones inhibidoras (CI, que van desde 10% a 90% de la viabilidad celular) se determinaron en cada línea celular por el método de la línea mediana-efecto. Los datos presentados representan la media ± SD de un mínimo de tres experimentos independientes.
Trypan Blue mancha
Las células se cultivaron en placas de 12 pocillos y se trató con OXA 15 M durante 24 h. Después las células se recogieron de exposición al fármaco y se resuspendieron en medio DMEM a una concentración de 1x10
5 células /ml. La citotoxicidad se evaluó mediante tinción con azul de tripano. Diez microlitros de 0,05% de azul de tripano (Invitrogen) se mezclaron con 10 l de suspensión de células, que se distribuyen en una cámara de Neubauer y cubiertos con un cubreobjetos. Mientras que las células viables excluyen el colorante y aparecen de color translúcido, las células no viables aparecen manchado azul. La viabilidad y la mortalidad de al menos 3 repeticiones de cada condición experimental se cuantificaron.
anexina V /yoduro de propidio prueba
La apoptosis se determinó mediante el uso de FITC Kit Anexina V Detección de Apoptosis I (BD Pharmingen) según con las instrucciones del fabricante. Un mínimo de 10
4 células por muestra fue analizada mediante el uso de flujo FACS Canto II citómetro (Becton Dickinson Immunocytometry System). Se analizaron al menos 3 repeticiones por condición experimental. Los controles positivos y negativos (tampón de unión única, yoduro de propidio (PI), Sólo FITC-anexina V) se utilizaron para establecer las condiciones adecuadas para compensar los detectores y cuadrantes. la muerte celular inducida por OXA después de BMF silenciamiento de los genes se midió mediante el uso de PI. BMF fue silenciada mediante siRNA dirigidos BMF como se ha descrito anteriormente. Después de 72 h de tratamiento oxaliplatino, se recogieron las células HT29 con Accutase (Ref. A11105-01, Invitrogen) y se resuspendieron en PBS frío con una concentración de PI 3μM. La fluorescencia PI se determinó en un citómetro de flujo FACSCanto II (Becton Dickinson Immunocytometry System). BMF silenciamiento de genes fue confirmada por qPCR.
ciclo celular análisis
Para evaluar las células se recogieron de distribución del ciclo celular, se lavaron en PBS, se fijaron en 1 ml etanol al 70% enfriado con hielo y se almacena a 4 ° C durante al menos 30 min. Los sedimentos se resuspendieron en 0,5 ml de tampón de HCl 0,1 M y se incubaron durante 10 minutos a 37 ° C. Las reacciones se detuvieron con 2,5 ml de PBS. Las células se incubaron en 1 ml de solución de tinción PI (30 M (AppliChem); RNasa A 200 mg /ml (Sigma)) durante al menos 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Un mínimo de 10.000 células se analizó para el contenido de ADN usando un citómetro de flujo FACS Canto II (Becton Dickinson Immunocytometry System). La proporción de células en G1, S y fase G2 /M se determinó usando v9.2 FlowJo Software.
Inmunofluorescencia análisis
localización subcelular
PKM2 se detectó por inmunofluorescencia. Después de 24 h de unión en portaobjetos de cámara celular (Millipore), las células se trataron con OXA y fijados a los cubreobjetos en acetona fría durante 10 min a temperatura ambiente. El bloqueo y la permeabilización se hizo con PBS-T /FBS 10%. Las células se incubaron a temperatura ambiente con un anticuerpo policlonal de conejo anti-PKM2 anticuerpo primario (Señalización Celular; 1: 100) durante 1,5 h y, posteriormente, con el anticuerpo secundario anti-conejo Alexa-568 (Invitrogen; 1: 200). Los núcleos se tiñeron con DAPI reactivo oro-antifade (Invitrogen). Los cubreobjetos se observaron con un microscopio de fluorescencia Axiovision Z1 mediante el uso del sistema Apotome a 40x lente de inmersión en aceite (Carl Zeiss, Heidelberg, Alemania). Múltiples imágenes fueron tomadas a diferentes distancias focales por medio de z-apilamiento (intervalo de espesor: 0,750 a 1 micras). PKM2 para localizar a diferentes profundidades focales
qPCR matriz
Cuantitativo en tiempo real PCR ( QRT-PCR) se realizó mediante el uso de la célula de la muerte Camino Buscador de PCR matriz 384 HT (HAP-212Z, SA Biosciences), una matriz de qPCR que contienen los genes relacionados con la muerte de células 84. Brevemente, el ARN total se recogió a partir de células utilizando EZNA Kit RNA total I (Omega) y se trató con ADNasa (Ambion). ARN se cuantificó con un NanoDrop ND-1000 TM (Thermo Scientific). La integridad del ARN y la falta de contaminación genómica se evaluaron mediante la ejecución de las muestras en 1% geles de agarosa. Se utilizó un total de 500 ng de RNA para la transcripción inversa con RT
2 Primera Strand Kit (SA Biosciences). Las reacciones de PCR se realizaron con el RT
2 perfilador PCR matriz mencionado antes y RT
2 en tiempo real SYBR Green PCR Master Mix (SA Biosciences) en un sistema de PCR en tiempo real rápida 7900HT (Applied Biosciences) y siguiendo el fabricante del instrucciones. Los cambios relativos en la expresión génica se calcularon utilizando el 2
^ - método? Ct (ciclo umbral). Se seleccionaron aquellos genes de limpieza que no mostraron variabilidad entre las condiciones experimentales para ser incluidos en la matriz (RPLP0 y ACTB) para normalizar el ADNc asciende. Se realizaron tres réplicas biológicas independientes.
El análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó utilizando SPSS 18 (IBM), excepto para el análisis de las curvas de dosis-respuesta, que se llevó a cabo con el programa Prism4 ( GraphPad Software). Las diferencias estadísticas entre IC
50 se determinaron mediante la representación gráfica de las curvas de dosis-respuesta y análisis de regresión no lineal y la posterior prueba F. Se utilizó la prueba U de Mann-Whitney para determinar las diferencias de distribución del ciclo celular. Las comparaciones entre diferentes condiciones experimentales en qPCR de la matriz y de BMF experimentos de expresión se llevaron a cabo a través de la prueba t de Student. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a
P & lt; 0
.
05
.
Resultados
gen PKM2 silenciar altera OXA sensibilidad de las células de cáncer colorrectal humano
En un trabajo previo se encontró menor los niveles de proteína PKM2 y la expresión de ARNm en las células de CRC con resistencia adquirida a OXA (HTOXAR3) y en tumores de pacientes no respondedores OXA, especialmente en aquellos con p53 mutado [8]. Con el fin de evaluar el efecto de la expresión génica PKM2 abajo de la regulación de la respuesta PKM2 OXA en las células parentales, que inhibe específicamente mediante el uso de oligonucleótidos de ARNsi en las células HT29. La sensibilidad a OXA en el control (siNTC) y desmontables células (PKM2 siPKM2) se comparó mediante el ensayo de MTT. Cuarenta y ocho horas después de silenciamiento de genes, las células fueron sembradas en placas de 96 pocillos y se trataron durante 24 h con dosis OXA que van desde 0 hasta 30 mM. eficiencia desmontables PKM2 fue mayor que 95%, tanto en los niveles de proteína y ARNm y se prolongó durante 96 h o más (S1 FIG). Como se puede ver en la figura 1, en células HT29, PKM2 silenciamiento llevó a un aumento de más de 40% en la resistencia OXA en comparación con células siNTC (sofá = 1,42; p & lt; 0,0001), que confirma la influencia de PKM2 baja regulación de la resistencia oxaliplatino en estas células. Estos resultados fueron validados en células SW480 (sofá = 1,61 p & lt; 0,0001), pero no en HCT116 donde PKM2 desmontables se asocia con una mayor sensibilidad a OXA (sofá = 0,80; p = 0,007) (Fig 1). La hipótesis de que PKM2 influenciado la respuesta de las células tumorales a OXA dependiendo de factores adicionales /s. Uno una posibilidad podría ser el estado mutacional de p53 ya que todas estas líneas celulares tienen anormal de la vía de señalización (HT29 alberga mutaciones en BRAF y PI3K, HCT116 en KRAS y PI3K y SW480 en KRAS) EGFR pero estatus diferente p53 mutacional presente (HT29 y SW480 son p53 mutado y HCT116 p53 son en peso). Para demostrar esta hipótesis, se utilizó un derivado de isogénica HCT116 con la inactivación dirigida de p53 (HCT116 p53 - /-) [26]. células nulas en p53 eran altamente resistentes a oxaliplatino como se informó anteriormente [27], pero la inhibición de la expresión génica de nuevo PKM2 condujo a una disminución en la resistencia a oxaliplatino (Fig 2). Estos resultados indican un posible efecto no en función de p53 en peso, pero en una ganancia de función (GOF) la mutación de p53. De acuerdo con esto, nos esperaba un cambio en la sensibilidad de oxaliplatino en las células HT29-siPKM2 después de silenciamiento de la expresión del gen p53. Como se muestra en la figura 2, el gen p53 derribar en las células HT29 (siNTC) condujo a una disminución de la resistencia al oxaliplatino, pero bajo estas condiciones, la falta de expresión PKM2 también aumentó la resistencia en estas células. Tomados en conjunto estos resultados sugieren que el papel de PKM2 en la sensibilidad oxaliplatino es la línea celular dependiente de que otros factores y, a diferencia de p53 mutado
per se
, pero probablemente asociado con un contexto cancerígeno p53 mutado, podría estar influyendo el diferente comportamiento observado en estas líneas celulares después de silenciamiento de genes PKM2. Otros experimentos están garantizados con el fin de demostrar este punto.
Las curvas de dosis-respuesta para HT29, SW480 y líneas celulares HCT116 después de silenciamiento génico PKM2 y tratamiento OXA al 0-140 M y 0-32 mM durante 24 horas. Curvas representan los valores medios de al menos tres experimentos independientes. La proliferación celular se midió mediante el ensayo de MTT. Las barras verticales en los gráficos representan ± SD. El recuadro muestra inmunoblotting PKM2 después de la inhibición de siRNA dirigidos. Los valores de IC50 específicos para el oxaliplatino en todas las condiciones se muestran en la tabla. Los valores de IC50 para las condiciones de Mock (sin transfección) fueron muy similares a los de siNTC y no se muestran. * p-valores son resultado de la comparación a la condición siNTC.
Las barras representan la IC50 ± SD (valores promedio de al menos tres experimentos independientes) de oxaliplatino para cada condición. El recuadro muestra PKM2 y inmunoblotting p53 después de silenciamiento génico PKM2. Los valores de IC50 específicos para el oxaliplatino en todas las condiciones se muestran en la tabla. Los valores de IC50 para las condiciones de Mock (sin transfección) fueron muy similares a los de siNTC y no se muestran. * P-valores son resultado de la comparación a la condición siNTC. *
valor P- Hotel & lt; 0.05. **
valor P & lt; 0,01
; ***
valor P & lt; 0,001
silenciamiento de los genes en las células HT29 PKM2 se asocia con un aumento de la viabilidad celular, pero no con una disminución de la apoptosis después de la exposición OXA
Después de nuestro objetivo principal, queríamos saber si el efecto del gen PKM2 silenciamiento sobre la resistencia a oxaliplatino en nuestro
in vitro
modelo, se debió a un aumento de la viabilidad celular, a una disminución de la apoptosis o ambos. PKM2 fue silenciado en las células HT29 antes de tratarlos con 15 OXA mu M durante 24 horas. Los efectos se compararon con las células control tratadas de la misma manera. Mediante el uso de la tinción de azul de tripano, las tasas de viabilidad entre OXA tratados (T) y se calcularon las células no tratadas (NT) durante 0, 24 y 48 los tiempos de recuperación h (después de tratamiento con oxaliplatino, se dejaron las células se recuperaran durante 0, 24 y 48 h, respectivamente). Veinticuatro horas después del tratamiento (punto 0h tiempo) se detectó un claro efecto de OXA. población celular de células siNTC y siPKM2 disminuye progresivamente después del tratamiento 48 h. Sin embargo, la viabilidad fue ligeramente mayor en las células siPKM2 comparación con las células siNTC en todos los puntos de tiempo, lo cual fue estadísticamente significativa a las 0 h (Figura 3A y 3B). Este hecho indica que PKM2 está afectando respuesta OXA en estas células. Para investigar aún más los mecanismos aguas abajo asociado con un aumento PKM2-en la viabilidad en respuesta a OXA, se analizó el efecto sobre la apoptosis mediante el ensayo de Anexina V /PI doble tinción (figura 3C). La citotoxicidad inducida por OXA no marcadamente alterar los niveles de apoptosis temprana inducida por hasta 48 horas después de la exposición continua (Fig 2D). Por otra parte, no se encontraron diferencias significativas en la activación de la apoptosis entre las células PKM2 y control silenciados en presencia de OXA, pero había una tendencia a que las células siNTC murieron en una proporción mayor que las células siPKM2. Estos resultados refuerzan la idea de que PKM2 participa en la resistencia a la apoptosis OXA y que no es la vía principal de implicado en la muerte de células activadas después de la exposición OXA en esta línea celular.
Después de la transfección las células fueron tratadas con siRNA OXA 15 M durante 24 período h, observado por microscopía óptica a 0, 24 y 48 h después del final de la exposición al fármaco (0 h se refiere a las células tratadas durante 24 horas; 24 h se refiere a las células tratadas durante 24 h y se dejó que se recuperaran durante adicional 24 h) (a ) y se cuantifica por tinción con azul de tripano (B). la activación de apoptosis después de 24 y 48 horas de exposición OXA 10 M se determinó por FITC-anexina V /PI tinción doble (C) y se midió como la relación entre los porcentajes de apoptosis tratados (T) y las células no tratadas (NT) (D) . Las barras verticales en los gráficos representan ± SD. *
P-valor Hotel & lt; 0.05. NT: células no tratadas. Microscopía óptica:. objetivo un aumento de 10x
distribución del ciclo celular después de la exposición OXA se ve alterada por PKM2 caída en HT29, pero no las células HCT116
OXA ha informado de modificar la expresión de proteínas y la estabilidad de p53 conduce a una detención de las células en G1 y /o G2 /M en función principalmente de su estado mutacional [5, 27-29]. A fin de evaluar si la expresión PKM2, OXA y el estado de p53 mutacional llevó a diferencias en la progresión del ciclo celular, se estudió la distribución del ciclo celular a lo largo de 72 h en PKM2 silenciados y HT29 de control y las células HCT116 después de un tratamiento continuo con OXA 10 mM. Como se muestra en la figura 4, las células no tratadas muestran la misma distribución del ciclo celular, en presencia o ausencia de PKM2, lo que significa que esta proteína no tiene ningún efecto sobre la regulación del ciclo celular
per se
. Sin embargo, OXA indujo respuestas diferentes en el control del ciclo celular entre las dos líneas celulares. células HCT116 tratados con OXA fueron retenidos principalmente en G1 y G2 /M fases a lo largo de 72 h de exposición continua al fármaco de platino y la ablación PKM2 no tuvieron un efecto significativo en la distribución del ciclo celular. En contraste, el tratamiento de las células HT29, llevó a ser retenidos en S y G2 /M fases principalmente. Estas células fueron significativamente afectados por PKM2 caída en los últimos 48 y 72 horas de exposición (S células en fase: siNTC vs siPKM2 67,2% 48%; p = 0,05; G2 células /M fase: 66,5% siNTC vs 39,7% siPKM2; p = 0,05). siPKM2 células HT29-no tienen más de 24 horas en cualquier fase del ciclo celular, evitando así los puntos de control del ciclo celular. Estos resultados confirman que las células responden a CRC OXA alterar su ciclo celular dependiendo del estado de p53 y la expresión de mutaciones PKM2.
Ambas líneas celulares fueron transfectadas y /o expuestos a 10 OXA mu M durante 8, 24, 48 y 72 h . Después de la tinción con yoduro de propidio, la proporción de células en fases del ciclo celular G1, S y G2 /M se midió por citometría de flujo y se cuantificó mediante software v9.2 FlowJo. Los resultados representan al menos tres experimentos independientes.
Los valores de p ≤ 0,05
se representan como un *.
PKM2 se transloca al núcleo en respuesta a OXA en minúsculas, pero no en las células resistentes
Tiene se ha demostrado que el daño genotóxico causado por los rayos UV y el estrés oxidativo estimula PKM2 translocación nuclear de promover la muerte celular [23]. Debido a las características farmacológicas y mecanismo de acción de OXA, queríamos saber si podría inducir cambios similares en PKM2 localización subcelular. Se han tratado HCT116, células HT29 y HTOXAR3 con diferentes dosis de la droga (1,65, 10 y 30 mM) a lo largo de 72 h y se observó la localización PKM2 mediante el uso de microscopía de fluorescencia. Como se muestra en la figura 5, en condiciones basales PKM2 fue distribuido en el citoplasma de todas las líneas celulares analizadas. Sin embargo, la exposición a OXA indujo cambios sustanciales en la localización PKM2 en líneas celulares HCT116 y HT29, pero sorprendentemente, estos cambios no se observaron en células HTOXAR3. se observó la translocación nuclear transitoria de PKM2 en las células HCT116 en las primeras 24 horas después de la exposición OXA 1,65 M. Cuarenta y ocho horas más tarde, PKM2 se trasladó de nuevo en el citoplasma. En este momento, la mayoría de las células parecían encogido y separado en correlación con un aumento en la cantidad de muerte celular inducida por de drogas. En las células HT29, OXA indujo una acumulación nuclear progresiva y creciente de PKM2 a lo largo de 72 h, tanto a 10 o 30 mM. Las células con PKM2 en el núcleo mostraron un marcado aumento en el tamaño y muestran un patrón de expresión de la proteína puntuado. Por el contrario, PKM2 permaneció en el citoplasma de las células HTOXAR3 a través de todo el tratamiento puntos de tiempo a baja (10 mM) y IC
50 (30 M) dosis del agente de platino. Es importante destacar que, las células HTOXAR3 mostraron menos tinción PKM2 de células HT29 que corrobora los resultados anteriores [8]. Se utilizaron células HT29 siPKM2 como control de la tinción de anticuerpos de especificidad (Fig S2).
inmunofluorescencia tinción de PKM2 (rojo) demuestra la acumulación nuclear en las células HCT116 y HT29 después del tratamiento con OXA en un tiempo y de manera dependiente de la dosis pero no en células HTOXAR3 resistentes. Los núcleos se tiñeron de azul. NT: Las células no tratadas. objetivo: aceite de inmersión 40x. Barra de escala:. 10 micras
Se ha informado de que PKM2 nuclear y los niveles de fosforilación de β-catenina se correlacionan con los grados de malignidad glioma y el pronóstico [30]. Otros autores también han informado basal de localización nuclear PKM2 en líneas celulares humanas de origen diferente, incluyendo el cáncer de colon [31]. Para confirmar PKM2 localización subcelular en tumores colorrectales humanos y su posible relación con el total de β-catenina, se analizaron sus respectivos tinción inmunohistoquímica en un microarray de tejido de 41 muestras de tumores de pacientes con CCR metastásico que se utilizó anteriormente por nosotros [8]. Nuestros resultados confirman claramente PKM2 tinción citoplasmática en todos los tumores analizados (Fig S3). Es de destacar que estas observaciones se llevaron a cabo con el uso de 2 anticuerpos diferentes (véase S1 File). PKM2 y β-catenina fueron altamente expresado en la mayoría de los tumores analizados, pero no pudimos encontrar ninguna correlación positiva entre PKM2 y β-catenina nuclear localización.
silenciamiento génico PKM2 altera los patrones de expresión de genes de la muerte celular en el CCR líneas celulares en respuesta a OXA
Como se ha demostrado en este trabajo, PKM2 transloca al núcleo de las células HT29 en respuesta a este agente de platino, mientras que en sus células derivados OXA-resistentes no lo hace. Teniendo en cuenta los resultados anteriores asociar translocación nuclear de PKM2 y la activación de las vías de muerte celular independiente de caspasas [23], especuló que PKM2 promueve la transcripción de genes implicados en la respuesta a OXA. Mediante el uso de un RT
2 perfilador qPCR matriz se analizó la expresión de 84 genes clave relacionados con diferentes mecanismos de muerte celular (apoptosis, necrosis y autofagia) con el fin de aclarar qué vía de la muerte celular /s o gen /s juegan un papel importante en respuesta a OXA y si el silenciamiento de genes PKM2 afecta a los patrones de transcripción asociados. Para hacer eso, HT29 células fueron transfectadas con siRNAs específicos como se ha descrito antes, y se trataron con 10 OXA mu M durante 48 h para asegurar altos niveles de PKM2 nuclear (Fig 5). Como se muestra en la figura 6A, los patrones de expresión génica en respuesta a OXA eran muy diferentes entre las células HT29, siPKM2-HT29 y HTOXAR3. Como era de esperar, la proporción de genes desregulados como consecuencia de la exposición OXA era considerablemente mayor en las células HT29 en comparación con HTOXAR3 desde OXA 10 M corresponde a la IC
50 de las células sensibles y aproximadamente a IC
25 para HTOXAR3 células. Curiosamente, las células siPKM2 exhibieron un patrón de "intermedia" de la expresión de genes de muerte celular. Como se muestra claramente en el mapa de calor en la figura 6B, después del tratamiento OXA, el perfil de expresión génica de células siPKM2 estaba más cerca de la de las células HTOXAR3 que a la de las células sensibles. Veintiocho de estos genes mostraron la más alta (factor de cambio) y /o diferencias estadísticamente significativas entre las condiciones experimentales analizados (Tabla 1 y Tabla S1). 0.05.