Se necesitan con urgencia
Extracto
biomarcadores novedosos para el diagnóstico del cáncer y la selección de la terapia para facilitar la detección temprana y mejorar los resultados de la terapia. Anteriormente hemos identificado un nuevo sitio de fosforilación en la serina 506 (PS506) sobre la topoisomerasa-I (topo-I) y hemos demostrado que en general se expresa en líneas celulares derivadas de varios tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de pulmón, pero es baja en líneas celulares derivadas de los tejidos no cancerosos. Aquí hemos investigado cómo la expresión PS506 en muestras de tejido pulmonar se correlaciona con su estado maligno. Encontramos que la expresión PS506 es significativamente elevado en los tumores malignos de cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) en comparación con el tejido pulmonar adyacente, no cancerosas y tumores benignos de pulmón. PS506 expresión era de hasta 6 veces mayor en las muestras malignas que en tejido no maligno emparejado. Uso del panel de la línea NIH /NCI 60 de células bien caracterizada, que correlacionar los más elevados niveles de expresión de PS506 en líneas de células de pulmón, de ovario, y cáncer de colon con mayor sensibilidad a la camptotecina, un alcaloide vegetal que se dirige a topo-I. Esto es consistente con nuestros estudios anteriores en una toma de muestras más pequeño de líneas celulares y con nuestro hallazgo de que PS506 aumenta topo I-unión al ADN. Dos fármacos quimioterapéuticos ampliamente utilizados para de ovario y cáncer de colon, topotecan e irinotecan, respectivamente, se derivan de la camptotecina. Irinotecan también ha mostrado eficacia en ensayos clínicos de NSCLC. Nuestros resultados sugieren que la expresión PS506 elevada puede correlacionar con la quimiosensibilidad clínica a estos agentes en ovario, colon, y NSCLC. Por lo tanto, PS506 puede servir como un biomarcador para el diagnóstico o la terapia de la selección
Visto:. Zhao M, Gjerset RA (2015) de la topoisomerasa-I PS506 como una función dual biomarcador del cáncer. PLoS ONE 10 (8): e0134929. doi: 10.1371 /journal.pone.0134929
Editor: Zhiqian Zhang, la Universidad de Pekín Hospital del Cáncer & amp; Instituto, CHINA
Recibido: 4 de octubre de 2014; Aceptado: July 15, 2015; Publicado: 6 Agosto, 2015
Derechos de Autor © 2015 Zhao, Gjerset. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. RG Biopharma prestado apoyo en forma de salarios de los autores (RAG, MZ), pero no tuvo ningún papel adicional en el diseño del estudio, la recogida de datos y el análisis, decisión de publicar, o la preparación del manuscrito. Las funciones específicas de los autores se articulan en la sección "autores contribuciones"
Conflicto de intereses:. MZ y RAG están afiliados a RG Biopharma, donde se llevó a cabo esta investigación. Esta afiliación de la compañía no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales. RG es el inventor en la patente estadounidense#8,431,353 y Estados Unidos de patente provisional de aplicación 62054242.
Introducción
Los nuevos biomarcadores moleculares para el cáncer, en particular las relacionadas con el mecanismo de cáncer o para la terapia del cáncer, podría mejorar el poder de los enfoques de diagnóstico utilizados actualmente, a reducir el riesgo de sobre-diagnóstico, facilitar la selección del tratamiento, y mejorar en gran medida la supervivencia del cáncer. Hemos identificado previamente un sitio de fosforilación novela sobre la topoisomerasa I (Topo I) en el residuo serina 506 (PS506) que está altamente expresado en líneas celulares de cáncer derivado pero es de baja a indetectable en líneas celulares derivadas de tejidos normales, lo que es un posible candidato como un biomarcador malignidad asociada para el diagnóstico [1].
Topo I juega un papel esencial en el metabolismo del ADN, y es la diana celular único para irinotecán y topotecán, dos fármacos quimioterapéuticos ampliamente utilizados derivan de la camptotecina planta alcaloide (CPT) [2, 3]. Al relajar supercoils de ADN que se forman durante la replicación del ADN y la transcripción, Topo I alivia la tensión de torsión en el ADN y permite la progresión del tenedor de replicación y transcripción complejo, respectivamente [4-6]. A nivel basal de fosforilación, principalmente en residuos de serina de su dominio N-terminal distinto de PS506 es necesario para la topo I ADN de unión y la actividad [7]. El aumento de la fosforilación de topo I se produce en muchas líneas celulares de cáncer de derivados y se correlaciona con la expresión de PS506 en el dominio del núcleo de la proteína [8, 9]. Se encontró que la expresión PS506 también se correlaciona con el aumento de los niveles de la serina-treonina proteína quinasa, CK2, y que topo I recombinante puede ser fosforilada en serina 506 por CK2 purificada [1]. CK2, que se expresa constitutivamente en niveles bajos en las células normales [10], tiende a aumentar en el cáncer, y los niveles altos son indicativos de mal pronóstico [11-15]. En ratones, la elevada potencia CK2 vías de señalización oncogénicas pro-oncogenes y colabora con la promoción de tumores [16-22], lo que sugiere que CK2 puede desempeñar un papel fundamental en el cáncer mediante la creación de un entorno propicio para nuevos cambios oncogénicos. Por lo tanto, la expresión aberrante de PS506 puede ser sintomático del medio ambiente pro-oncogénica creado por CK2 elevada
.
La relevancia terapéutica de la topoisomerasa I hace también PS506 un biomarcador potencial para la selección del tratamiento. CK2 mediada por fosforilación de S506 topo recombinante fosforilada, basales que genera un topo I con una mayor actividad de unión a ADN y un aumento de la actividad de la relajación del ADN en los plásmidos supercoiled [1, 8]. Hemos observado que las líneas celulares que expresan niveles elevados de PS506 eran a menudo más sensibles a CPT, de acuerdo con el mecanismo de acción de este fármaco, que utiliza la actividad enzimática de topo I para crear su efecto letal [1]. Debido a CPT y los medicamentos relacionados permiten topo ADN mellar I mediada pero inhibir la guía I mediada por la religación del ADN, que causan la ruptura cadena de ADN que persisten y en última instancia para formar un ADN letal de doble filamento romper. Este mecanismo se cree que dar cuenta de los efectos terapéuticos de irinotecán y topotecán [2, 23, 24]. La unión a ADN mejorada y actividad de relajación de ADN que observar con la forma PS506 del topo por lo tanto puedo contribuir a respuestas clínicas a irinotecán y topotecán mediante la promoción de la formación de ADN de doble filamento se rompe.
En este estudio hemos explorado la hipótesis de que la expresión PS506 es una característica de malignidad, y que los niveles más altos de expresión se correlaciona con las respuestas celulares a medicamentos a base de CPT. Para evaluar la relación de PS506 a la malignidad hemos examinado muestras de tejido de los tumores malignos de pulmón, emparejado epitelio pulmonar adyacente no malignos y tumores benignos de pulmón. Para evaluar la utilidad de PS506 como un indicador de la capacidad de respuesta a los medicamentos a base de CPT, hemos analizado su expresión en líneas celulares desde el panel NCI-60 línea celular para los que se disponía de perfiles de sensibilidad de CPT del Programa de Terapéutica del Instituto Nacional del Cáncer /Desarrollo ( NCI /DTP) de base de datos. Los resultados indican una sobreexpresión altamente selectiva de PS506 en todas las muestras de pulmón malignos examinados, en comparación con el tejido no maligno adyacente y muestras de tumores benignos. En líneas celulares derivadas de pulmón, colon y ovario, nos encontramos con que los más altos niveles de expresión PS506 se correlacionan con una mayor sensibilidad de CPT.
Materiales y Métodos
Los anticuerpos
El IgG de conejo fue generado pAb506P a un fosfopéptido 21-amino ácido (TVGCCS * LRVEHINLHPELKKC, en el que fosfoserina 506 se indica con *), como [1] se describe anteriormente. De cabra anti-IgG topo I, que reconoce el topo I C-terminal, y monoclonal de ratón anti-actina se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). monoclonal de ratón anti-tubulina se adquirió de Novus Productos Biológicos (Littleton, CO). Los anticuerpos secundarios fueron de cabra anti-conejo-peroxidasa de rábano (HRP), de cabra anti-ratón-HRP y burro anti-cabra-HRP (Santa Cruz Biotechnology). Para el post-inmunoprecipitación del Oeste, se detectó el anticuerpo primario usando el reactivo Pierce Clean-Blot Detección IP (Thermo Scientific, Waltham, MA), que sólo reconoce su conjunto, IgG intacta y no las subunidades disociadas cadena ligera o pesada.
línea celular
NCI-H358 de carcinoma de células (H358), número de catálogo CRL-5907, fueron compradas en mayo de 2011 de la American Type Culture Collection y estaban libres de micoplasma. Las células se cultivaron a 37 ° C en 10% de CO
2 en medio de Eagle Modificado de Dulbecco suplementado con suero de ternero recién nacido al 10% y aditivos, como [8] se describe anteriormente. Para el tratamiento de la camptotecina, se incubaron las células durante 24 horas en presencia de 0,1 o 1 M de camptotecina (Sigma, St. Louis, MO), seguido de la recolección y análisis de Western como se describe a continuación.
sedimentos celulares
pellets de células congeladas desde el panel de línea de 60 células NCI se obtuvieron de la División de Tratamiento y Diagnóstico del repositorio (DCTD) tumor del Instituto Nacional del cáncer (NCI) y se almacenaron a -80 ° C hasta su uso. Las líneas celulares de los que se recibieron los sedimentos celulares se enumeran en la (Tabla S3).
Las muestras de tejido
Todas las muestras de tejidos utilizados en este estudio fueron congeladas, muestras, archivos de acceso público de la no anónimos el cáncer de pulmón de células pequeñas con tejido de control no maligna emparejado, o muestras de tumores benignos de pulmón. Todas las muestras fueron recibidas de la División Oeste de la Red Cooperativa de Tejidos Humanos (CHTN), la Universidad de Vanderbilt, Nashville, TN. No información del paciente o donante privada identificable se suministra con los especímenes. Dado que no se obtuvieron datos a través de la intervención o interacción con el individuo y por falta de información privada identificable fue suministrada a nosotros, esta investigación no constituía la investigación con sujetos humanos definida en el CFR 46.102f y Orientación OHRP en investigación que afecta a la información privada de código o muestras biológicas , y se le concedió la exención de revisión por parte del Instituto Torrey Pines para Estudios moleculares IRB.
los análisis por Western
los sedimentos celulares (equivalente a ~ 10
7 células /pellets) o dos cercano confluentes placas de 10 cm de H358 células lavadas con PBS (equivalente a ~ 2 x 10
7 células) fueron lisadas por la adición de 350 l por pellet o 700 l por placa de tampón RIPA frío (TRIS 10 mM pH 8, 0,15 M NaCl, 0,1% de SDS, 1% de NP40, 1% desoxicolato) a la que Roche, Nutley, NJ) se añadieron inhibidores de la proteasa y de fosfatasa completas (justo antes del uso, y se procesa como se describe anteriormente [8]. muestras de tejido congeladas (peso promedio de ~ 0,3-0,5 g) se homogeneizaron en 3 ml de tampón RIPA en hielo usando un triturador de tejidos y luego se centrifugaron para eliminar los residuos. Los lisados de células y tejidos se dividen en partes alícuotas y se congelaron a -80 ° C hasta su uso. Un lisado recién descongelado se utiliza para cada carrera gel.
Los lisados (70 g de proteína, salvo que se indique) se resolvieron mediante SDS-PAGE usando el Criterio 10-20% geles prefabricados de Tris-HCl (Bio-Rad Laboratories , Hercules, CA). Una cantidad equivalente de una alícuota recién descongelada del stock de referencia de H358 lisado se incluye en cada serie como un control común. Después de electroforesis, las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF y se inmunotiñeron por incubación con el anticuerpo primario (1: 500 para tubulina; todos los otros en 1: 100), seguido de anticuerpo apropiado conjugado con HRP secundario (1: 1.000), y el reactivo de Pierce ECL ( Thermo Scientific), seguido de exposición a película. Las películas fueron digitalizadas mediante un Imager Alfa y bandas se cuantificaron utilizando el software que lo acompaña. intensidades de banda PS506 se normalizaron con el control H358 referencia.
inmunoprecipitación /Western blotting
Las inmunoprecipitaciones se llevaron a cabo esencialmente como se describe [25]. Brevemente, los lisados de células a partir de células H358 en crecimiento exponencial se prepararon en tampón de RIPA como se describe anteriormente. Las proteínas celulares (1-2 mg) se inmunoprecipitaron oscilando durante la noche con 50 l de cabra anti-guía I (~ 10 g). Los inmunocomplejos se recogieron mediante la adición de 20 l de proteína AG agarosa seguido de centrifugación. Los complejos inmunes se disociaron a pH bajo en ausencia de ditiotreitol o β-mercaptoetanol para evitar la disociación de la IgG. se añadió tampón de muestra de electroforesis y las muestras se sometieron a SDS-PAGE como se describe para Westerns, sin hervir antes de asegurar, además, que la IgG se mantuvo intacta. El occidental se procesó como se ha descrito anteriormente, excepto que el reactivo de detección de IP Clean-Blot (Thermo Scientific) se utilizó para detectar el anticuerpo primario.
análisis ELISA
formas serina-506 fosforilados y no fosforilados del topo de 21 aminoácidos que peptídicos descritos anteriormente (véase la sección de Anticuerpos) fueron sintetizados por Biopeptide Co., Inc. (San Diego, CA). placas Immulon H2B ELISA (Thermo Scientific) se recubrieron durante la noche a 4 ° C con 100 l de péptidos se resuspendieron a 2 g /ml en tampón de recubrimiento (mM NaHCO 50
3, pH 9). Las placas se lavaron con tampón de lavado (solución salina tamponada con Tris [TBS] pH 7,5, 0,5% de Tween) y se bloquearon con TBS que contiene 1% de albúmina de suero bovino (BSA). Las placas se lavaron una vez con tampón de lavado y después se incubaron durante 1 h con diluciones en serie (por duplicado) de pAb506P en TBS /BSA al 1%, se lavaron de nuevo, y se incubaron durante 1 h con anticuerpo de cabra anti-conejo-HRP. Después de otra etapa de lavado, las placas se incubaron con HRP sustrato 3,3 ', 5,5'-tetrametil bencidina (1-paso LENTO TMB ELISA, Thermo Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La absorbancia a 450 nm se leyó.
Alkaline El tratamiento con fosfatasa
300 g de lisado celular preparado en tampón RIPA en ausencia de inhibidores de la fosfatasa se trató durante 1 hora a 37 ° C con 300 unidades de ternero fosfatasa alcalina intestinal (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO) en tampón ajustado a 0,1 M de NaCl, 0,01 M MgCl
2, 0,001 M de DTT según lo sugerido por el fabricante. Un lisado de control paralelo preparado en presencia de inhibidores de la fosfatasa se incubó en tampón que carecen de la fosfatasa alcalina.
Estadística
analiza
Los análisis estadísticos se llevaron a cabo (utilizando el software GraphPad® Prisma GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA).
resultados
Características de los pAb506P
La IgG de conejo policlonal, pAb506P, elevado a un péptido que contiene PS506-única de topo I, ha sido previamente se muestra a reconocer la topo celular 90 KDa I en líneas celulares de cáncer derivados, así como el formulario que contiene PS506-de topo recombinante tratado con la proteína quinasa CK2 [1]. El antisuero es altamente específico para la forma fosforilada del péptido inmunizante, como se muestra por las curvas de valoración comparativas en los ensayos de péptido ELISA (Fig 1A). Una especie pAb506P reactiva más prominentes adicionales que migran a aproximadamente 45 kDa en SDS-PAGE /Westerns también está presente (Fig 1B, carril 1, las flechas indican las posiciones de las 45 especies kDa y topo I de longitud completa en los lisados de células H358 NSCLC). Un topo I especies de tamaño similar se ha reportado en las células leucémicas Jurkat [26]. La especie de 45 kDa aparece como una banda menor en transferencias sondeadas con un anticuerpo de cabra anti-topo I (Figura 1B, carril 2), y puede ser inmunoprecipitada a partir de lisados de células H358 con cabra anti-topo I (Fig 1C), lo que indica que comparte inmunoreactividad con de longitud completa topo I, pero es probable que sea una especie menor. La reactividad más débil del topo longitud total I con pAb506P puede indicar que no es totalmente fosforilada en este sitio. pAb506P reactividad se reduce tras el tratamiento de los lisados de células H358 con fosfatasa alcalina, lo que confirma que representa una especie fosforilada (Fig 1D). Tanto de larga duración topo I y los 45 kDa especies PS506-positivas son selectivamente las reguladas después del tratamiento con camptotecina (CPT), en condiciones en que el control de la tubulina mantiene sin cambios, lo que indica que la topo larga duración I y los 45 kDa especies están reguladas de manera similar en respuesta a CPT (Fig 1E). Topo I es la única diana de la CPT, y anteriormente se ha demostrado que es específicamente el regulado en las células tratadas con CPT [27]. Tomados en conjunto, los resultados sugieren que la especie de 45 kDa es probable que sea un producto de degradación fosforilada de topo I. Debido a que es la especie primaria detectadas en lisados de células, se evaluó su expresión en muestras de tejido.
(A ) curvas comparativas de titulación de pAb506P en las placas de ELISA recubiertas con un topo I péptido que rodea a la serina 506 sitio, ya sea en su forma fosforilada o no fosforilada. análisis (B) Western de lisados de células H358 (100 g /carril) sondadas con pAb506P (carril 1) o con anticuerpo de cabra anti-topo I (carril 2). Las flechas indican las posiciones de 45 kDa especies y de larga duración Topo I (C) Topo I inmunoprecipitación (cabra anti-topo I C-terminal), seguido de pAb506P Western de los lisados celulares H358. Carril representa a 200 mg de material de partida. (D) El análisis de Western de PS506 y la actina en los lisados celulares H358 antes (CNTR) y después del tratamiento con fosfatasa alcalina (AP). (E) El análisis de Western de PS506 (usando pAb506P), de longitud completa topo I (usando anticuerpo de cabra anti-topo I) y la tubulina en las células H358 antes y después de un tratamiento de 24 h de células con CPT 0,1 o 1 mM.
PS506 expresión en maligna, benigna, y normal
tejido pulmonar
pAb506P se utilizó para la expresión PS506 pantalla en muestras anónimas de tejido pulmonar no microcítico de pulmón de células tumores (carcinomas, adenomas) y no maligno ( como muestras pareadas del mismo paciente), así como tumores benignos de pulmón. Las muestras se obtuvieron de la División Oeste de la Red Cooperativa de Tejidos Humanos (CHTN) y se enumeran con sus descripciones en (S1 Tabla Características de los pares de tumor /no tumor (proporcionadas por CHTN);.. S2 tabla Características de los tumores benignos (no proporcionado por CHTN)). Los homogenizados de tejido preparadas a partir del tumor emparejado no pequeñas de pulmón de células y tejido pulmonar no maligna, y muestras de tumores benignos de pulmón se analizaron por SDS-PAGE /Western para la presencia de PS506, y los niveles se cuantificaron por análisis digital de las intensidades de banda. Para asegurar la normalización a través de diferentes geles, preparamos una sola lisado de células H358, que se congeló en alícuotas. Una alícuota recién descongelada de este lisado se incluyó en cada gel funcionar como patrón de referencia.
figura 2A muestra una transferencia Western representativa para PS506 en pares coincidentes malignas /no malignas de muestras 8-13, junto con el H358 estándar de referencia. niveles PS506 relativos a H358 se evaluaron de manera similar para los 21 pares emparejados más 8 tumores benignos y los resultados fueron verificados en un segundo experimento independiente. Los promedios y las desviaciones estándar para los dos experimentos se muestran en la Tabla 1 (emparejado pares) y en la Tabla 2 (tumores benignos) y se representan en la figura 2B. En los 21 pares de muestras malignas /no malignas, la expresión PS506 fue elevado en la muestra malignos. Dieciséis de los 21 (76%) muestras malignas expresaron aproximadamente 2-6 veces más PS506 que hizo la muestra de pares no malignos, siendo el promedio de ~ 3 veces mayores. Quince de los 21 (71%) muestras malignas expresaron PS506 a niveles por encima del promedio general de 0,39 para todas las muestras (línea roja punteada en la figura 2B). Es importante destacar que ninguna de las 8 muestras benignas y sólo 2 de los 21 especímenes emparejados no malignos (para un total de 2/29 [7%]) expresado PS506 por encima de este nivel medio. Por lo tanto, un espécimen maligna era & gt;. 10 veces más probabilidades que un espécimen no malignas expresar PS506 en mayor que el nivel promedio de todas las muestras
(A) Borrón representativo PS506 occidental de las muestras de NSCLC y su pareadas no malignas muestras (muestras pares 8-13). H358 es la de control de referencia para la cuantificación de todos los borrones PS506. Las Tablas 1 y 2 se enumeran los especímenes analizados y cuantificación de los niveles PS506 relación a H358. gráfico (B) Barra de los niveles PS506 se muestran en las Tablas 1 y 2, agrupados como especímenes no malignas emparejadas malignos y tumores benignos /. (C) Diagrama de dispersión de los niveles de PS506 de las tablas 1 y 2, agrupados como malignos (M), no maligno (N), y tumores benignos (B). Los valores de p se calcularon mediante una prueba t no pareada
El gráfico de dispersión en la figura 2C muestra los niveles de PS506 en los tres juegos de muestras:. El 21 emparejado maligno (M) y no malignas (N) tejidos, y los 8 tejidos tumorales benignas (B). Los niveles promedio PS506 (indicadas por las líneas negras en cada conjunto) son 0,60 (maligno), 0,24 (emparejados no maligna) y 0,24 (benigno). Las diferencias en los niveles medios de PS506 entre conjuntos de muestras fueron evaluados por un, prueba t de dos colas no apareada. Como se indica en la figura 2C, la diferencia entre el tejido maligno y el tejido emparejado no maligno fue altamente significativa (
p
& lt; 0,0001), y la diferencia entre el tejido maligno y el tejido tumoral benigna fue significativa (
p
= 0,0115). No se observó diferencia significativa entre los niveles PS506 en los tejidos benignos y no malignas (
p
= 0,86). Estos resultados indican que la expresión PS506 está fuertemente asociada con la malignidad.
expresión PS506 y CPT sensibilidad
En un estudio anterior examinando los niveles PS506 en una variedad de líneas celulares de cáncer, se encontró que la mayor PS506 los niveles estaban presentes en las líneas celulares con la mayor sensibilidad a la guía I-dirigidos alcaloide vegetal, CPT, con diferencias de aproximadamente 2-3 veces mayor entre las líneas celulares de CPT-sensibles y resistentes a [1]. Para extender estas observaciones, se evaluaron los niveles PS506 relativas entre el panel de la línea 60 de células NCI, disponible en forma de pellets de células congeladas de la División de Tratamiento y Diagnóstico del Cáncer repositorio de tumor del NCI. El panel incluye líneas celulares derivadas de una variedad de tipos de tumores, incluyendo la leucemia, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de colon, melanoma, cáncer de ovario, carcinoma renal, cáncer de próstata, cáncer de mama, y cáncer del sistema nervioso central. Debido a que las líneas de células han sido ampliamente caracterizada por el NCI para la sensibilidad a la CPT y otros fármacos quimioterapéuticos experimentales y establecidas, que proporcionan un recurso altamente estandarizado con el que se correlaciona un biomarcador potencial con quimiosensibilidad [28].
Los lisados celulares de se evaluaron los sedimentos celulares congelados para la expresión PS506 por SDS-PAGE /Western de la misma manera que las muestras de tejido. Las bandas se cuantificaron digitalmente y se verificaron los niveles de PS506 en relación con el valor de control H358 en un segundo experimento independiente y se promediaron. Para las líneas celulares de 42 para los que se disponía de datos de sensibilidad de CPT, se encontró que los niveles de PS506 fueron distribuidos en un amplio intervalo, como se observó para las muestras de tejido tumoral. El nivel medio de PS506 en todas las 42 líneas celulares fue 0,37 con respecto al control común H358; un valor considerablemente más alto que el valor medio de 0,24 observadas en los tumores no malignos de tejido emparejado o benignos (Fig 2). A continuación comparó los valores PS506 relativas de las 42 líneas celulares con su sensibilidad a la CPT utilizando los valores de crecimiento% Programa de Terapéutica NCI /Developmental (DTP) establecidos con un ensayo CPT sola dosis alta (10 mM) [29]. En este ensayo, un valor porcentaje de crecimiento negativo indica la pérdida de masa celular de partida debido a la muerte celular, mientras que un valor positivo indica el porcentaje de crecimiento de las células sin tratar, como se describe en el sitio web DTP [28].
Hemos observado una correlación entre la expresión de PS506 y la sensibilidad de CPT en una agrupación de 20 no microcítico de pulmón de células, colon y líneas celulares de cáncer de ovario, lo que representa tres tipos de cáncer para los que son aprobados por la FDA terapias basadas en CPT ya sea (colon, ovario) o están siendo evaluados en los ensayos clínicos en curso (cáncer de pulmón de células no pequeñas) [30, 31]. Tabla 3 se enumeran estas líneas de células, el nivel medio PS506 de los dos experimentos (con respecto a células H358), y los datos de sensibilidad CPT disponibles en el sitio NCI /DTP web [28]. La figura 3 muestra un gráfico de dispersión de los valores PS506 relativas para los tres subgrupos definidos por su sensibilidad CPT: la 8 más sensible (40%), la 8 más resistente (40%), y el restante 4 con sensibilidad intermedia (20%) . El nivel PS506 relativa disminuyó según la CPT sensibilidad de 0,39 (más sensible) a 0,21 (sensibilidad intermedia) a 0,18 (resistente). Una prueba t de dos colas no apareada reveló una diferencia significativa (
p = 0,028
) en el nivel medio entre el PS506 las líneas celulares más resistentes y más sensible, consistente con nuestros estudios anteriores con una muestra pequeña de líneas de células [1]. Estos datos sugieren que para pulmón, colon, y cáncer de ovario, la expresión de PS506 es un determinante de la sensibilidad a los medicamentos a base de CPT. Es importante destacar que la mitad de las líneas celulares designado como sensible a la CPT, pero ninguno de aquellos con CPT sensibilidad intermedia o CPT-PS506 resistencia se expresa en un nivel superior a la media de 0,37 para todas las 42 líneas celulares.
Diagrama de dispersión de la relación niveles PS506 en líneas celulares que representan el 40% más CPT sensible, el 40% más resistente CPT, y el 20% con sensibilidad intermedia entre el conjunto de cáncer de ovario, cáncer de colon, y las líneas celulares de NSCLC. La línea punteada roja en 0.37 muestra el nivel medio PS506 en las líneas celulares de los que se disponía de datos de sensibilidad de CPT. El valor de p fue calculado por una prueba t no pareada
niveles PS506 también en comparación con CPT sensibilidad para el grupo mayor de 42 líneas de células que representan una gama más amplia de tipos de cáncer (ver.: Tabla S3. CPT niveles de sensibilidad y PS506 en líneas celulares de NCI panel de la línea celular 60). Aquí, también, se observó una asociación positiva entre los niveles de PS506 y CPT sensibilidad, con las líneas de células más resistentes que expresan niveles PS506 bajas (40% de las líneas, el nivel PS506 media = 0,34) y las líneas celulares más sensibles que expresan niveles PS506 más altas (40 % de las líneas, el nivel medio del PS506 = 0,41), coherente con un modelo en el que PS506 contribuye a CPT sensibilidad. En el análisis de este grupo más grande, las diferencias en los valores medios no alcanzaron significación estadística, sin embargo (
p = 0,43
), posiblemente debido a la contribución de los factores celulares independientes de guía I, tales como la absorción de la CPT, metabolismo intracelular CPT y distribución, y la respuesta celular al daño del ADN, todos los cuales pueden afectar el resultado de tratamientos CPT [32]. Sin embargo, los resultados de esta prueba de detección apoyan la noción de que los niveles de PS506 se pueden utilizar para la selección de la terapia para ciertos tipos de cáncer.
Discusión
Este estudio demuestra que la expresión de PS506 es la malignidad-específica, y que los más altos niveles de expresión PS506 en líneas celulares de cáncer de pulmón, colon, y el origen del cáncer ovárico se correlacionan con un aumento de la sensibilidad a la CPT. niveles PS506 estaban elevados en los 21 especímenes malignos de cáncer de pulmón de células no pequeñas en comparación con tejido no maligno emparejado y 8 muestras de tumor de pulmón benignas. En la mayoría de los pares de muestras, el aumento de la expresión PS506 en maligno frente a tejido no maligno varió de 2 veces a & gt; 6 veces. Los dos grupos no malignas de las muestras (21 tejidos no malignos y 8 tejidos tumorales benignas), no fueron significativamente diferentes en la expresión PS506. Mientras que los niveles absolutos de expresión PS506 en muestras de tumores malignos fue variable, el 71% de los tumores malignos muestra niveles PS506 por encima de la media de la población (todas las muestras combinadas, es decir, malignas + no maligno), mientras que sólo el 7% de las muestras no malignas expresó PS506 por encima de la media de la población.
Cuando evaluamos el panel NCI-60 línea celular, también se encontró que el nivel de expresión PS506 promedio a través de las líneas celulares fue mayor que la de las muestras de tejido no maligno (0,37 pulg líneas celulares frente a 0,24 en las muestras no malignas). Se analizó la correlación entre la expresión PS506 con la sensibilidad celular a la guía I-dirigidos CPT drogas, utilizando los datos de sensibilidad CPT disponibles en el sitio web del NCI /DTP. En el pulmón, colon y líneas celulares de cáncer de ovario, lo que representa tres tipos de cáncer para los que los fármacos quimioterapéuticos CPT-derivados son aprobados o están en fase de prueba clínica, se encontró que los 40% de la mayoría de las líneas celulares de CPT-sensibles expresan niveles significativamente más altos de PS506 que hizo el 40% líneas de células más resistentes, en consonancia con nuestras observaciones anteriores en una muestra más pequeña de las líneas celulares disponibles [1]. Se observaron niveles intermedios de expresión PS506 en el 20% de las líneas de células con sensibilidad intermedia CPT. Estos resultados sugieren que PS506 puede servir, en combinación con otros factores clínicos, para facilitar la toma de decisiones para el tratamiento de pacientes con los fármacos CPT derivado, irinotecán y topotecán. La correcta elección del fármaco es crucial para el éxito de la terapia. Esto es particularmente cierto de la terapia de segunda línea, como un tratamiento no puede resultar en una condición física decreciente del paciente y aumenta la probabilidad de que otros tratamientos tendrán éxito. Actualmente no existen pruebas de predicción fiables para la sensibilidad a los medicamentos derivados de la CPT. La aplicación de PS506 como una ayuda para la selección de la terapia constituiría un paso fundamental hacia el logro de los regímenes de tratamiento más individualizadas
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El desarrollo de ensayos basados en la sangre para PS506 potencialmente podría proporcionar un ensayo de diagnóstico para la detección o la vigilancia de pulmón en estadio precoz cáncer u otros tipos de cáncer. Varios marcadores de proteínas circulantes están actualmente en uso clínico para ciertos tipos de cáncer, principalmente para el seguimiento. Estos incluyen CA125 del cáncer de ovario, CA 19-9 para el cáncer pancreático, el CEA para el cáncer de colon y de próstata PSA para el cáncer (revisado en [33]). CYFRA21-1, un marcador citoqueratina para las células epiteliales en el plasma o la sangre, se ha asociado con el cáncer de pulmón de células no pequeñas y otros cánceres epiteliales, pero tiene sensibilidad muy variable o especificidad de malignidad. Un informe reciente describe un ensayo ELISA para la timidina quinasa en muestras de sangre para la detección de cáncer de pulmón, [34]. Dado que Topo I es uno de los 10 a 25% más abundante de las proteínas celulares en las células y en el plasma [35], es probable que sea viable y sensible una prueba similar para PS506. En el caso de cáncer de pulmón, un ensayo basado en el esputo también puede ser posible, como las células cancerosas están presentes en el esputo de pacientes con cáncer de pulmón. Varios otros marcadores candidatos han sido identificados [36, 37]. Sin embargo, ningún marcador biológico todavía no se ha demostrado que tiene la necesaria sensibilidad, especificidad y reproducibilidad de validarse para el uso clínico de rutina, y se necesitan biomarcadores adicionales.
La posibilidad de que PS506 puede ser causalmente relacionada con el cáncer aumenta enormemente su interés como un biomarcador. Debido guía I posee el mellado de ADN /actividad religación, su estricta regulación es fundamental para evitar cortes en el ADN aberrante que podría desestabilizar el genoma y promover la progresión maligna [38]. Ectópica overexpressed topo I es recombinogenic en la levadura y las bacterias y por lo tanto puede promover reordenamientos de ADN y otras formas de inestabilidad del genoma en células de mamífero así como [39, 40]. Esta posibilidad es apoyada por la evidencia de que el Topo I es esencial para la rotura de cromosomas en los sitios comunes frágiles (SFC), donde reordenamientos de ADN ocurren comúnmente en el cáncer [41, 42]. Uno SFC bien caracterizados, FRA3B, con frecuencia se reordenen de cáncer de pulmón [43].