Extracto
6 de proteína tirosina quinasa (PTK6) es un no-receptor de tipo tirosina quinasa que puede estar implicado en algunos cánceres. Sin embargo, el papel y la expresión estado biológico de PTK6 en el cáncer pancreático es desconocida. Por lo tanto, en este estudio, se evaluó el papel funcional de PTK6 en la invasión del cáncer de páncreas. Cinco líneas celulares de cáncer de páncreas expresaron PTK6 a diferentes niveles. expresión PTK6 también se observó en adenocarcinomas pancreáticos humanos. PTK6 supresión por siRNA redujo significativamente tanto la migración celular y la invasión (0,59 /0,49 veces para BxPC3, 0,61 /0,62 para Panc1, 0,42 /0,39 para MiaPaca2, respectivamente,
p & lt; 0,05
para cada uno). Por el contrario, la sobreexpresión de PTK6 forzada por transfección de un vector de expresión PTK6 en las células Panc1 y MIAPaCa2 aumento de la migración celular y la invasión (1,57 /1,67 veces para Panc1, 1,44 /1,57 para MiaPaca2, respectivamente,
p & lt; 0,05
) . Silenciando PTK6 reduce la activación de ERK1 /2, pero no AKT o la activación de STAT3, mientras que la sobreexpresión PTK6 aumento de la activación de ERK1 /2. U0126, un inhibidor específico de ERK1 /2, abolió por completo el efecto de la sobreexpresión PTK6 sobre la migración celular y la invasión. Estos resultados sugieren que PTK6 regula la migración celular y la invasión en el cáncer pancreático a través de la señalización de ERK. PTK6 puede ser una nueva diana terapéutica para el cáncer de páncreas
Visto:. Ono H, Basson MD, Ito H (2014) PTK6 promueve la migración y la invasión del cáncer en células de cáncer de páncreas dependientes de señalización de ERK. PLoS ONE 9 (5): e96060. doi: 10.1371 /journal.pone.0096060
Editor: Noriko Gotoh, Instituto de Ciencias Médicas, Universidad de Tokio, Japón
Recibido: 22 Noviembre 2013; Aceptado: April 2, 2014; Publicado: May 1, 2014
Derechos de Autor © 2014 Ono et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por el fondo de investigación del departamento interno de los autores. El donante (Departamento de Cirugía, Universidad del Estado de Michigan) no tuvo ningún papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no hay intereses en competencia existe.
Introducción
el cáncer de páncreas es la cuarta causa de mortalidad por cáncer en los Estados Unidos. [1] El pronóstico de los pacientes con cáncer de páncreas ha sido desalentadores con una tasa de supervivencia a los 5 años del 5%. [2] La letalidad de cáncer de páncreas se debe a sus comportamientos biológicos agresivos, incluyendo un gran potencial para la invasión y la metástasis, y la resistencia a agentes contra el cáncer actualmente disponibles. Los mecanismos moleculares responsables de estas características es en gran parte desconocida, y deben ser entendidos para mejorar los resultados del tratamiento de los pacientes con cáncer de páncreas.
La proteína tirosina quinasa 6 (PTK6), o de mama relacionados con la quinasa del tumor (BRK) es una no receptor de tipo tirosina quinasa. Está relacionada con la familia de las quinasas c-Src, que poseen dominios SH2 y SH3. [3] PTK6 promueve la diferenciación celular en las células epiteliales normales y apenas se expresa en las células epiteliales maduras en el tracto gastrointestinal, de mama o de piel. [3] - [5] Aunque la sobreexpresión aberrante de PTK6 se ha identificado en varios cánceres epiteliales, incluyendo los cánceres de mama, pulmón, melanoma, próstata, colon y ovario, las funciones de PTK6 en la biología del cáncer no se han caracterizado completamente. [3], [6] - [12].
En este estudio, se evaluó el papel de PTK6 en la invasión de células de cáncer de páncreas y exploraron las señales descendentes que podrían mediar tal efecto. Nuestros hallazgos sugieren que PTK6 regula la invasividad mediante la activación de ERK y plantea la posibilidad de que PTK6 puede ser una nueva diana molecular importante para mejorar la eficacia de la terapia para el cáncer de páncreas.
Materiales y Métodos
Materiales
Los medios de cultivo, suero fetal bovino (FBS) y se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) de penicilina /estreptomicina (P /S). El anticuerpo anti-PTK6 se obtuvo de Santa Cruz Bioquímica (Santa Cruz, CA), anti-p44 /42 ERK1 /2, anti-fosfo-p44 /42 ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), anti-p38 MAPK, anti-fosfo -p38 MAPK (Thr180 /Tyr182), anti-STAT3, y anti-fosfo-STAT3 (Tyr705) anticuerpos se obtuvieron de Cell Signaling Technology (Danvers, MA), y el anticuerpo anti-β-actina se obtuvo de Sigma-Aldrich. El selectivo de ERK1 /2 U0126 inhibidor se obtuvo de Sigma-Aldrich.
tejidos humanos
pancreáticos diapositivas de tejido de cáncer se obtuvieron a partir Departamento de Patología del Hospital Sparrow, Lansing MI. El uso de las muestras archivadas de este estudio fue aprobado por la Universidad del Estado de Michigan (MSU) y el Hospital Juntas de Revisión Institucional (IRB) Sparrow. Nuestro comité IRB renunciado a la necesidad de consentimiento. Nueve pacientes que fueron sometidos a resección pancreática para el adenocarcinoma ductal pancreático entre 2002 y 2012, aunque fueron seleccionados y fueron incluidos en este estudio. Los especímenes, incluidas en parafina fijadas con formalina se seccionaron archivados en un micrótomo rotatorio a 4 de micras. Enzyme inducida recuperación del epítopo se realizó por 0,03% de proteasa E durante 10 minutos a 37 ° C. El anticuerpo anti-PTK6 se diluyó en 1/100 con normal Antibody Diluent (NAD) (Scytek - Logan, UT) y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. reacciones antígeno-anticuerpo se visualizaron con el sistema complejo avidina-biotina-peroxidasa (Vectastain Elite ABC R.T.U. de reactivos; Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE.UU.). Las diapositivas fueron revisados y expresión PTK6 se clasifican de acuerdo a la intensidad de la tinción citoplasmática de la siguiente manera; negativo, sin manchas o intensidad de la tinción débil en menos de 5% de las células; débil a moderada positiva, débil a moderada intensitiy; fuerte, fuerte intensidad positiva.
Cultivos Celulares
líneas celulares de cáncer de páncreas humano de BxPC3, Capan1, Hs766T, Panc1, y MIA PaCa2 se obtuvieron de la American Type Culture Collection. BxPC3 se mantuvo en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS y 1% P /S en un humidificado (37 ° C, 5% de CO
2) de cámara. Las otras líneas celulares se mantuvieron en medio DMEM que contiene 10% de FBS y 1% P /S.
análisis de transferencia Western
Las células se lisaron en tampón de lisis celular (Cell Signaling Technology) con 1 mM El fluoruro de fenilmetanosulfonilo (Cell Signaling Technology). La concentración de proteínas de cada lisado celular se estimó por el ensayo de BCA (Pierce Chemical). Los lisados celulares que contienen total de 20 g de proteína se aplicaron a 10% SDS-PAGE y se transfirieron a difluoruro de polivinilideno (PVDF) membranas (Invitrogen, Grand Island, NY). Después de ser bloqueados con solución salina tamponada con Tris con 0,2% de Tween-20 (TBST) que contiene 5% de BSA o leche descremada durante 4 horas a temperatura ambiente, las membranas se incubaron con anticuerpos en una dilución apropiada a 4 ° C. Rábano picante burro conjugado con peroxidasa IgG anti-conejo o de oveja anti-IgG de ratón (GE Healthcare, Piscataway, NJ) se utilizaron como anticuerpos secundarios y se incubaron con las membranas en una dilución de 1/3000 durante 1 hora. β-actina se utilizó como un marcador de control de carga para la normalización de cada carril.
silenciamiento génico mediante ARN interferente pequeño
La pérdida de la función de análisis se ha realizado mediante siRNAs dirigidos PTK6 (s11487, Ambion , Grand Island, Nueva York: sentido 5'-CAUCCAUGGUUAAGUCAUAtt-3 ', 5'-antisentido UAUGACUUAACCAUGGAUGaa-3') y control negativo (Silenciador Seleccione control negativo#2 siRNA, Ambion). Otro par de siRNAs dirigidos PTK6 y control negativo se utilizaron (PTK6 y control negativo, Invitrogen, San Luis, MO: el sentido de la cautela RNAi-5'-PTK6HSS183907 CAGGCUGUGCGGCACUACAAGAUCU-3 ', 5'-antisentido AGAUCUUGUAGUGCCGCACAGCCUG-3' y la cautela RNAi Negativo control Medio GC Duplex, respectivamente). Cada siRNA (10 nmol /l) se transfectó en células de cáncer pancreático utilizando Lipofectamine RNA iMAX (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. La caída de un gen diana se confirmó a las 96 horas por el Western Blot
sobreexpresión de PTK6 por Transfección estable
Human PTK6 cDNA (cloneID: 5746034). Se adquirió de Abierto Biosystems (Pittsburg, PA ) y se amplificó por PCR usando cebadores (5'-CCCAAGCTTATGGTGTCCCGGGACCAGGC, y 3'-CGGGATCCTCAGGTCGGGTTCTCGTAGC). El producto de PCR se insertó en el vector de expresión pcDNA3.1-myc /His B (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El vector de expresión PTK6 establecido se sometió a análisis de secuenciación de ADN para confirmar el inserto correcto de longitudes completas de PTK6 cDNA. vector de expresión PTK6 o correspondiente vector vacío se transfectaron en células de cáncer pancreático usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Después de 72 horas de la transfección, las células se incubaron en medio de cultivo que contenía concentraciones apropiadas de G418. Por cultivo en medio de selección G418 containg más de 2 semanas, se seleccionaron las células transfectantes estables. La expresión de la proteína PTK6 fue confirmada posteriormente por el Western Blot.
Transwell migración y la invasión de ensayo
migración y la invasión Transwell ensayos se llevaron a cabo en 24 pocillos recubiertas previamente cámaras de Boyden modificadas con (invasión) o sin (migración) Matrigel (transwell cámaras, BD Biosciences, San Jose, CA,). células de cáncer pancreático (BxPC3 1 × 10
5 células, Panc1, 5 × 10
4 células, y MiaPaca2, 7,5 × 10
4 células por pocillo, respectivamente) en medio libre de suero fueron sembradas en el trans-membrana en la cámara superior con 10% de SFB en la cámara baja como un quimioatrayente. Después de una incubación de 24 horas, las células que habían migrado a través de la membrana se fijaron y se tiñeron con la tinción Diff-Quik (Siemens, Newark, DE). entonces ellos se contaron bajo un aumento en 5 campos de alta potencia seleccionados al azar. Cada ensayo se realizó por triplicado
Análisis estadístico
La comparación de los valores continuos se realizó mediante la prueba t de Student y 2 caras
p-valores
. & Lt; 0,05 se consideraron significativo.
resultados
Estado Expresión PTK6 en el cáncer pancreático
Se han comparado los niveles PTK6 en cinco líneas pancreáticos humanos establecidos celulares de cáncer (BxPC3, Capan1, Hs766T, MIAPaCa2, y Panc1 ) y los tejidos de cáncer de páncreas toman directamente de 9 pacientes que fueron sometidos a resección quirúrgica. transferencias Western demostraron que las 5 líneas celulares pancreáticas expresaron PTK6 a varios niveles; BxPC3 y Capan1 expresaron PTK6 robusta, mientras que MiaPaca2 expresa un nivel mucho más bajo de PTK6 (Figura 1A). La inmunotinción para PTK6 en tejidos de cáncer de páncreas a partir de 9 pacientes demostraron que PTK6 fue altamente expresado en 4 pacientes (44%), de ligera a moderadamente expresados en 2 pacientes (22%), y no se expresa en absoluto en 3 pacientes (33%). En el epitelio del conducto pancreático normal adyacente, inmunorreactiva PTK6 no era detectable en ninguna de las muestras que hemos examinado (Figura 1B).
A
, la expresión endógena de PTK6 en líneas celulares de cáncer de páncreas humano. PTK6 expresión se confirmó en 5 líneas celulares de cáncer de páncreas, BxPC3, Capan1, Hs766T, MIAPaCa2, y Panc1 en los distintos niveles a través de Western Blot-.
B Opiniones, inmunohistoquímica staning para PTK6 en el páncreas normal adyacente y el tejido de cáncer de páncreas. Si bien no hubo expresión detectable PTK en el epitelio ductal pancreático normal adyacente (superior izquierda), PTK6 se expresó en varios niveles (de negativo a través fuertemente positiva) en el cáncer de páncreas.
Expresión PTK6 afecta a la migración celular y La invasión de líneas celulares de cáncer de páncreas
Varios estudios han sugerido que influye PTK6 maquinaria celular que media la migración y la invasión. [13] - [15] Por lo tanto, la hipótesis de que PTK6 es un regulador clave de la migración y la invasión del cáncer pancreático y se evaluó el efecto de disminución de la expresión PTK6 en estos comportamientos celulares. Después de la expresión PTK6 fue suprimida por silenciamiento de genes usando siRNA (de Ambion) en 3 líneas celulares de cáncer de páncreas (Figura 2a), el potencial migratorio de las células de cáncer de páncreas se analizaron utilizando una cámara de Boyden. Como se muestra en la Figura 2B, el silenciamiento de genes de PTK6 migración reducida de manera significativa en las 3 líneas celulares de cáncer pancreático (0,59 veces disminución en BxPC3, 0,61 en Panc1, 0,42 en MiaPaca2, respectivamente,
p
& lt; 0,05 para cada uno) . potencial invasivo celular se ensayó de manera similar utilizando cámaras de Boyden recubiertos con Matrigel, y la invasión se redujo significativamente por el silenciamiento de genes de PTK6 en las 3 líneas celulares de cáncer de páncreas, como se muestra en la Figura 2C (disminución 0,49 veces en BxPC3, 0,62 en Panc1, 0,39 en MiaPaca2, respectivamente,
p Hotel & lt; 0,05 para cada uno). Estos efectos inhibitorios de PTK6 silenciamiento de los genes sobre la migración celular y la invasión fueron confirmadas por los experimentos similares utilizando otros siRNA dirigidos a diferentes secuencias de PTK6 (de Invitrogen) (Figura S2).
Un
, PTK6 el silenciamiento de genes. Las células fueron transfectadas con PTK6-siRNA (siRNA-PTK6) o negativo de control-siRNA (siRNA-NC) durante 96 horas. Desmontables expresión PTK6 se comfirmed por Western Blot-. Los números en la parte inferior indican la intensidad relativa de las bandas para PTK6 a correspondientes controles (normalizados por β-actina).
B Opiniones,
C
, el efecto de silenciamiento génico PTK6 en la motilidad celular (B) y la invasión (C). Las células se trataron con PTK6-siRNA o negativo de control-siRNA durante 48 horas, después se sometió a la migración o invasión de ensayo utilizando cámaras de Boyden sin o con Matrigel. El silenciamiento génico de PTK6 reduce la migración celular en las 3 líneas celulares de cáncer de páncreas (0,59 veces disminución en BxPC3, 0,61 en Panc1, 0,42 en MiaPaca2, respectivamente, *
p
& lt; 0,05 mediante la prueba t). Del mismo modo, el silenciamiento de genes de PTK6 reduce la invasión celular en las 3 líneas celulares de cáncer pancreático (0,49 veces mayor disminución en BxPC3, 0,62 veces en Panc1, 0,39 veces en MiaPaca2, respectivamente, *
p Hotel & lt; 0,05 por t-test). Cada ensayo se realizó por triplicado.
A la inversa, el próximo evaluó el efecto de la sobreexpresión PTK6 sobre la migración y la invasión. Un vector de expresión que codifica longitud completa PTK6 cDNA se transfectó en células Panc1 y MIAPaCa2 y transfectantes estables que sobreexpresan PTK6 fueron establecidas para cada línea celular (Figura 3A). En contraste con el efecto de PTK6 el silenciamiento de genes, PTK6 sobreexpresión aumento de la migración celular y la invasión en comparación con los controles. (Aumento de 1,6 /1,7 veces en Panc1, y 1,4 /1,6 en MiaPaca2, por el potencial migratorio e invasivo, respectivamente,
p Hotel & lt; 0,05) (Figura 3B, 3C) Estos hallazgos sugieren que la expresión PTK6 de páncreas el cáncer se asocia con su potencial migratorio e invasivo celular.
Un
, la sobreexpresión de PTK6. Las células fueron transfectadas con pcDNA3.1-Mock (vector vacío) o pcDNA3.1-PTK6. La sobreexpresión de PTK6 en trasfectant estable fue confirmado por Western Blot en las células Panc1 y MIAPaCa2, respectivamente. Los números en la parte inferior indican la intensidad relativa de la banda por PTK6 a los controles correspondientes (normalizados por β-actina).
B Opiniones,
C
, el efecto de la sobreexpresión PTK6 sobre la migración celular (B) y la invasión (C). Se evaluaron las células transfectantes establecidos con los ensayos de migración y la invasión. la sobreexpresión forzada de PTK6 aumento de la migración celular en células de cáncer de páncreas Panc1 y MiaPaca2 (aumento de 1,6 veces para Panc1, y 1,4 veces para MiaPaca2, respectivamente, *
p
& lt; 0,05 mediante la prueba t). Del mismo modo, la sobreexpresión forzada de PTK6 aumento de la invasión celular en estas 2 líneas celulares (aumento de 1,7 veces para Panc1, y 1,6 veces para MiaPaca2, respectivamente, *
p
& lt; 0,05 mediante la prueba t). Cada ensayo se realizó por triplicado.
MAPK /ERK señalización es un mediador crítico en la célula relacionada con PTK6 Motilidad
Para dilucidar el mecanismo en el que PTK6 regula la migración celular y la invasión, nos explorado las vías descendentes de PTK6 señalización. Varias moléculas de señalización han sido previamente informado de que aguas abajo de PTK6, incluyendo STAT3 [16], Akt [17], [18], ERK5 [15], [19], p38 MAPK [19], y ERK1 /2 [20] (revisado en Ostrander 2010). Cuando la expresión PTK6 fue manipulada mediante siRNA, la fosforilación de STAT3, Akt y MAPK p38 no fueron alteradas constantemente entre 3 líneas celulares analizadas (Figura S1). La activación de ERK5 no era detectable en nuestros estudios (datos no mostrados) Por el contrario, activado (phospholylated) ERK1 /2 se redujo significativamente en todas las células de cáncer de páncreas PTK6-genes silenciados en comparación con sus células de control correspondientes, mientras que la sobreexpresión forzada de PTK6 inducida la activación de ERK1 /2 en las células Panc1 y MIAPaCa2 (Figura 4A.B). ERK1 /2 por lo tanto, surgió como el candidato para el mediador de la motilidad celular regulada por-PTK6 en cáncer de páncreas y en consecuencia hemos tratado de determinar si los efectos de PTK6 sobre la migración celular y la invasión dependen de la actividad de ERK1 /2. Se utilizó el inhibidor selectivo de ERK1 /2, U0126 para inhibir la actividad de ERK1 /2. Como se muestra en la Figura 5A, PTK6 inducida por la activación de ERK /medio fueron completamente bloqueado por U0126 a 10 mM. Cuando ensayamos la migración celular y la invasión de 2 células Panc1 y MiaPaCa en presencia de U0126, U0126 reduce la migración celular y la invasión basal y abolió la capacidad de PTK6 sobre-expresión para estimular ellos (Figura 5B). Esto sugiere que PTK6 regula la migración celular y la invasión a través de ERK1 /2.
Un
, Efecto de PTK6 silenciamiento de genes en el total de ERK1 /2 y activada (fosforilada) ERK1 /2. El silenciamiento génico de PTK6 redujo el nivel de ERK1 fosforilados /2 en las 3 líneas celulares de cáncer de páncreas. Los números en la parte inferior indican la intensidad relativa banda para pERK1 /2 a los controles correspondientes (normalizado por el total de ERK1 /2).
B Opiniones, Efecto de la sobreexpresión PTK6 sobre el total de ERK1 /2 y ERK1 activado /2. Forzado sobreexpresión PTK6 inducida por la activación de ERK1 /2 en las células Panc1 y MiaPaca2. Los números en la parte inferior indican la intensidad de la banda relativa para pERK1 /2 con los controles correspondientes (normalizaron por el total de ERK1 /2).
Un
, las células fueron tratadas con la ERK1 específica /2 inhibidor, U0126 en 10 mM durante 24 horas. ERK1 /2 fosforilación se inhibió y la activación de ERK1 /2 inducida por PTK6 ya no se detectó en las células Panc1 o MIAPaCa2.
B Opiniones, El efecto de la inhibición de ERK1 /2 sobre la migración celular (
la izquierda) y la invasión (
derecha) ERK1 2 /inhibición no sólo reduce la migración y la invasión basal en Panc1 y células MIAPaCa2, pero abolió el efecto de la sobreexpresión-PTK6 sobre la migración y la invasión. *
p Hotel & lt; 0,05 frente al control correspondiente con vehículo DMSO (por
t-test
). **
p Hotel & lt; 0,05 frente a células sobreexpresados-PTK6 con vehículo DMSO (por
t-test
). Cada ensayo se realizó por triplicado.
Discusión
A pesar de que hay una acumulación de pruebas de que PTK6 se expresa de manera aberrante en diversos cánceres epiteliales, la implicación de la expresión PTK6 y su papel en la biológica el comportamiento de los cánceres son controvertidos y mal definido. De hecho, el papel y la función de PTK6 se cree que depende en gran medida del contexto en el que se expresa PTK6. Por ejemplo, PTK6 ha sido ampliamente estudiado en los cánceres de mama por su
Pro Trial papeles -oncogenic incluyendo progresión del ciclo celular [21], la angiogénesis [22], anoikis resistencia [23] y la migración celular [13], mientras que PTK6 se ha demostrado que funciona
contra
-oncogenically en el cáncer de esófago [24]. Para nuestro conocimiento, este es el primer estudio que investiga la expresión y la función de PTK6 en las células de cáncer de páncreas.
Nuestro hallazgo clave de este estudio es que PTK6 sobreexpresión aumenta la migración celular y la invasión y que el silenciamiento de genes PTK6, en por el contrario, ellos disminuye en las células de cáncer de páncreas. Los efectos de PTK6 sobre la migración celular pueden variar entre los tipos de cacners. En los estudios de células de cáncer de mama, PTK6 ha informado para mejorar la migración celular inducida por EGF [13] - [15], [19], mientras que se informó de la sobreexpresión de PTK6 para aumentar el potencial invasivo celular mediante la inducción de traducción mesenquimal epitelial (EMT) en células de cáncer de próstata [25]. En contraste, Ma et al informaron de que PTK6 disminuye la migración de células de cáncer de esófago [24]. Estos informes aparentemente opuestas alrededor de la influencia de la biología del cáncer en PTK6 ponen de relieve la importancia de los estudios que investigan los efectos de las señales individuales en los distintos tipos de cánceres. Parece probable que los efectos de PTK6, al igual que muchas otras señales, dependen de la kinome general en el que se expresa la PTK6. La comprensión de las diferencias entre kinomic cánceres en los que PTK6 promueve la migración y aquellas en las que inhibe la migración puede ser un tema fructífero para el estudio futuro. Varias moléculas efectoras aguas abajo asociados con PTK6 previamente se han identificado en otros tipos de cáncer. Estos incluyen p190RhoGAP, Rho, RAS [14], Rac1, Paxilina [13], p38MAPK, y ERK5 [15], [19] en el cáncer de mama, y AKT, GSK3, y βCatenin [24] en el cáncer de esófago. En el estudio actual de múltiples líneas celulares de cáncer de páncreas, la mayoría de las moléculas que han informado previamente que se asocia con PTK6 de señalización en otros tipos de cáncer no cambio en la actividad por la manipulación de la expresión PTK6. Por lo tanto, es menos probable que estas moléculas juegan un papel en la mediación del efecto de PTK6 sobre la migración celular /invasión en el cáncer de páncreas. En su lugar, ERK1 /2 surgió como un mediador clave de aguas abajo de la señal asociada a PTK6 el que se regula la invasión del cáncer de páncreas. ERK1 /2 es un miembro de la familia mitogen-activated proteína quinasa (MAPK) y se sabe que influyen en la migración celular y la invasión en varios tipos de cáncer, incluyendo cáncer de páncreas [26], [27]. Los mecanismos por los cuales PTK6 sobreexpresión induce la activación de ERK1 /2 aún no se ha determinado y se desconoce si PTK6 interactúa directamente con ERK1 /2. Castro y Lange informaron de que en las células de cáncer de mama del complejo /ERK5 PTK6 es crítico para la migración del factor de crecimiento celular inducida, mientras que PTK6 todavía aumenta la migración celular mediante la activación de ERK1 /2 en los queratinocitos cuando ERK5 es derribado [15]. Especularon que ERK1 /2 podría servir como una vía alternativa para las señales PTK6 /ERK5 en algunos tipos de células que carecen de ERK5. Este modelo sería consistente con nuestras observaciones ya que no fuimos capaces de detectar la actividad ERK5 en las células de cáncer de páncreas, independientemente del estado de la expresión PTK6. Sin embargo, Xiang et al demostraron que PTK6 se une directamente a Erb B2 y activa ERK1 /2 en células de cáncer de mama. Erb B2 es bien sabido que se sobreexpresa frecuentemente en los cánceres de páncreas [28], [29] por lo que este podría ser un posible mecanismo por el cual forzada PTK6 sobreexpresión en células de cáncer de páncreas podía activa ERK1 /2 sin actividad ERK5.
fue interesante observar que mientras que la expresión PTK6 era uniformemente indetectable en las células del conducto pancreático histológicamente normales adyacentes epiteliales, los niveles PTK6 variaron considerablemente entre los cánceres pancreáticos que estudiamos. la sobreexpresión de Abberant de PTK6 se ha descrito en otros tipos de cánceres y se ha sugerido previamente que PTK6 puede ser un biomarcador útil para predecir los resultados de pacientes con diversos tipos de cáncer incluyendo cáncer de mama, cabeza y cuello, de ovario y de cáncer de pulmón [6], [12 ], [30] - [33]. El valor pronóstico potencial de variación en PTK6 en el cáncer pancreático espera un mayor estudio.
En resumen, hemos demostrado que se expresa de manera aberrante PTK6 en el cáncer de páncreas. Además, nuestros resultados sugieren que PTK6 puede promover la migración celular y la invasión en el cáncer de páncreas mediante la activación de ERK1 /2. La investigación adicional de la vía de señalización dependiente de PTK6 que impulsa la invasión en el cáncer de páncreas puede poner de relieve la importancia potencial pronóstico y terapéutico de esta nueva señal en el cáncer de páncreas.
Apoyo a la Información
Figura S1.
Efecto de PTK6 silenciamiento génico sobre la actividad de diversas moléculas en las vías de señalización; p38, STAT3, y AKT se ensayaron como se informó anteriormente a estar asociado con PTK6. La actividad de estas moléculas no se vieron afectados constantemente por el silenciamiento de genes de PTK6 en 3 líneas celulares de cáncer de páncreas, BxPC3, Panc1 y MiaPaca2
doi:. 10.1371 /journal.pone.0096060.s001 gratis (TIF)
Figura S2.
Un
, los efectos de PTK6 silenciamiento de genes en el total de ERK1 /2 fosforilada y ERK1 /2 utilizando siRNA. De nota, el siRNA utilizada en este experimento tiene diferente secuencia de dirección PTK6 del siRNA utilizado en el experimento en Figuer 2 y 4. La ERK1 fosforilados /2 se redujeron en PTK6 el silenciamiento de genes en las células Panc1 y MIAPaCa2. Los números en la parte inferior indican la intensidad de la banda relativa para PTK6 y pERK1 /2 a correspondientes controles, respectivamente (normalizados por β-actina para PTK6 y el total de ERK1 /2 de pERK1 /2).
B Opiniones, El efecto de silenciamiento génico PTK6 sobre la migración celular (izquierda) y la invasión (a la derecha). El silenciamiento génico de PTK6 reduce la migración celular en las células Panc1 y MIAPaCa2 (disminución de 0,65 veces en Panc1, 0,72 en MiaPaca2, respectivamente, *
p Hotel & lt; 0,05 por t-test). Además, el silenciamiento de genes de PTK6 reduce la invasión celular en las células Panc1 y MIAPaCa2 (disminución 0,48 veces en Panc1, 0,78 veces en MiaPaca2, respectivamente, *
p
& lt; 0,05 mediante la prueba t). Cada ensayo se realizó por triplicado
doi:. 10.1371 /journal.pone.0096060.s002 gratis (TIF)
Reconocimientos
Agradecemos a William S. Spielman, Amy S. Porter, y Kathy A. Joseph para la asistencia técnica.
Presentado en parte, como un cartel en la Reunión anual de la Sociedad de Cirugía del Tracto alimentario 18 de mayo
th-21
º, 2013, Orlando, FL.