Extracto
A pesar del hecho de que los nuevos regímenes de tratamiento han mejorado la supervivencia global de los pacientes con problemas de cáncer colorrectal (CCR), el pronóstico de la situación metastásico sigue siendo limitado. La familia Bcl-2 de proteínas ha sido identificado como objetivo prometedor contra el cáncer de drogas. A pesar de que las pequeñas moléculas dirigidas a proteínas Bcl-2 están en ensayos clínicos, poco se sabe acerca de sus efectos sobre la Convención. El objetivo de este estudio fue investigar el valor de los estudios preclínicos ABT-737 y Obatoclax como medicamentos contra el cáncer para el tratamiento del CCR. Los efectos de los BH3-miméticos ABT-737 y Obatoclax sobre las células de CRC se evaluaron utilizando ensayos de viabilidad y la apoptosis. Se aplicaron la migración cicatrización de heridas y ensayos de cámara de Boyden invasión. Se utilizaron cultivos de células de 3 dimensiones para la evaluación a largo plazo de la invasión y proliferación. Clínicamente concentraciones relevantes de pan-Bcl-2 inhibidor Obatoclax no indujo la muerte celular. En contraste, el BH3 mimético de ABT-737 indujo apoptosis de una manera dependiente de la dosis. Obatoclax provocó una desaceleración específica línea celular del crecimiento celular CRC. Por otra parte, Obatoclax, pero no ABT-737, se recuperó la expresión de E-cadherina y llevado a la migración alterada y la invasión de células de CRC. La capacidad de proliferación y la invasividad de las células CRC fue sorprendentemente inhibidos por dosis bajas de Obatoclax en cultivos de células de 3 dimensiones a largo plazo. Obatoclax, pero no ABT-737, causó una detención de la fase G1 acompañada de una regulación a la baja de la ciclina D1 y la regulación positiva de p27 y p21. La sobreexpresión de MCL-1, Bcl-x
L o Bcl-2 invierte el efecto inhibidor de Obatoclax sobre la migración, pero no pudo restaurar la capacidad proliferativa de las células de CRC tratados con Obatoclax. Los datos presentados indican efectos amplios y multifacéticos antitumorales de la pan-inhibidor de Bcl-2 en las células Obatoclax CRC. En contraste con ABT-737, Obatoclax inhibió la migración, invasión y proliferación en dosis subletales. En resumen, este estudio recomienda pan-Bcl-2 inhibición como un enfoque prometedor para los ensayos clínicos en el CCR
Visto:. Koehler AC, AL Scherr, Lorenz S, Elssner C, N Kautz, Welte S, et al . (2014) Pan-Bcl-2 Inhibidor Obatoclax Retrasa la progresión del ciclo celular y bloquea la migración de células de cáncer colorrectal. PLoS ONE 9 (9): e106571. doi: 10.1371 /journal.pone.0106571
Editor: Andrei L. Gartel, Universidad de Illinois en Chicago, Estados Unidos de América
Recibido: 23 Marzo, 2014; Aceptado: July 30, 2014; Publicado: 5 Septiembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Koehler et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos se incluyen dentro del papel
Financiación:. Este estudio fue apoyado por una beca de postdoctorado-concedida a BCC de la Facultad de Medicina de la Universidad de Heidelberg, Alemania (http: //www.medizinische-fakultaet- hd.uni-heidelberg.de), y concede a HSB de la Fundación alemana de Investigación (Deutsche Forschungsgemeinschaft, http://www.dfg.de/, DFG SCHU 1443 /4-1). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el carcinoma colorrectal (CCR) representa la cuarta causa común de muerte por cáncer [1]. La incidencia está aumentando en todo el mundo y el 40% de todos los pacientes tienen metástasis órgano distante en el momento del primer diagnóstico. enfoques de terapia sistémica y la cirugía han mejorado la supervivencia global, pero el pronóstico en la UICC en estadio IV es aún pobre. La familia de proteínas Bcl-2 comprende los principales reguladores de la apoptosis que actúa en la superficie mitocondrial. antiapoptóticas miembros de la familia actúan mediante la unión de sus familiares pro-apoptóticos, protegiendo así la celda de la muerte. Las proteínas anti-apoptóticas Mcl-1, Bcl-2 y Bcl-x
L han demostrado ser upregulated en varias entidades de cáncer sólidos y hematológicos incluyendo CRC [2] - [4]. Estas observaciones llevaron a la investigación de varios compuestos dirigidos directamente antiapoptóticas Bcl-2 de proteínas. Los llamados BH3-miméticos actúan mediante la unión a la hendidura BH3 de las proteínas antiapoptóticas [5]. Esta interacción conduce a la liberación de pro-apoptóticos de Bcl-2 de proteínas, finalmente, la promoción de la muerte celular. Los ensayos clínicos han demostrado la seguridad y eficacia de los miméticos BH3 en diversos tumores malignos sólidos y hematológicos pocos [6]. A pesar de las investigaciones clínicas, los datos preclínicos válidos sobre la potencia de los miméticos BH3 como una opción de tratamiento para el CCR son limitadas. En este estudio, se determinó la actividad antitumoral del Obatoclax y ABT-737 en las células CRC. Ambos son inhibidores de molécula pequeña de antiapoptóticas Bcl-2 de proteínas. Se diferencian en su perfil de inhibición, ya que ABT-737 no inhibe MCL-1 mientras que Obatoclax es un inhibidor de pan-Bcl-2. Nuestro estudio muestra que ABT-737 induce la muerte celular en diversas líneas celulares de CRC. Por el contrario, la capacidad de inducir la muerte celular Obatoclax es limitada y varía entre las líneas celulares de CRC.
La capacidad de migrar e invadir tejidos extraños es una característica común de las células cancerosas que contribuyen de manera espectacular a la malignidad de la enfermedad. Nuestro grupo ha demostrado recientemente que la regulación a la baja de MCL-1, Bcl-x
L o Bcl-2 conduce a un deterioro notable de la migración y la invasión de las células CRC [7]. En este caso, se investiga la relevancia de los BH3-miméticos Obatoclax y ABT-737 para esas características malignas. En contraste con ABT-737, dosis subletales de la migración bloque Obatoclax y la invasión de las células CRC de una manera dependiente de la proteína Bcl-2.
Además, este estudio tiene como objetivo evaluar la capacidad proliferativa de las células tratadas con CRC y Obatoclax ABT-737. Dosis bajas de Obatoclax, pero no ABT-737, tiene efectos inhibitorios impresionantes sobre la progresión y la proliferación del ciclo celular. A continuación, describimos los efectos antiproliferativos de Obatoclax independientes de proteínas Bcl-2.
En conclusión, nuestros datos revelaron que pan-Bcl-2 inhibidor Obatoclax ejerce diversas actividades antitumorales independientes de la inducción de la muerte celular, recomendando pan-Bcl 2 inhibición para un mayor desarrollo clínico en el cáncer colorrectal.
Resultados
ABT-737, pero no mesilato Obatoclax induce la apoptosis en las células CRC
para evaluar la muerte celular después del tratamiento de las células CRC con Obatoclax y ABT-737 durante 48 h, se analizó la fragmentación del ADN por citometría de flujo. ABT-737 causó la muerte celular en todas las líneas celulares investigadas en una manera dependiente de la dosis. Se observó el efecto más notable en las células Colo205 (más de 90% de células apoptóticas después del tratamiento 48 h con 10 mM ABT-737, Fig. 1A). Por el contrario, concentraciones crecientes de Obatoclax la muerte celular inducida sólo ligeramente en las células SW480, Colo205 y CaCo2
(A y B) Análisis de citometría de flujo para la fragmentación del ADN como un indicador de la muerte apoptótica en cuatro líneas celulares de CRC.; tratamiento 48 h con ABT-737 o Obatoclax. (C) ensayo de MTT de las células HT29 después de 72 h de tratamiento Obatoclax y ABT-737. (P-valores: Oba 0,25 M: 0.003; Oba 0,05 M: 0,004; ABT-737 5 M: 0.589) (D) Western blot Representante de PARP escindido después de 24 h de tratamiento Obatoclax. Tubulina sirvió como control de carga. 2 M tratamiento con estaurosporina durante 24 h sirvió como control positivo para la inducción de la muerte celular. Los ensayos se realizaron por triplicado. Las barras representan la media ± SD. Los ensayos son representativos de al menos tres experimentos independientes. Oba = Obatoclax, STS = Staurosporine.
Células
HT29 no mostró la fragmentación del ADN de apoptosis (Fig. 1B).
Además, verificó nuestros hallazgos por Western blot para la PARP escindida. En línea con los datos de citometría de flujo, no hubo PARP escindido detectable en todas las líneas celulares de CRC, como se muestra a modo de ejemplo para HT29 y SW480 en la Fig. 1D.
Con el fin de investigar los efectos de Obatoclax sobre la proliferación, que siguió el crecimiento celular de las células HT29 con el tiempo (72 h). El crecimiento celular se inhibió incluso en dosis bajas Obatoclax, mientras que las células tratadas y no tratadas ABT-737 continuaron proliferando. Este resultado es indicativo de un fuerte efecto de Obatoclax en la capacidad proliferativa (Figura 1C).
A continuación, se intentó evaluar la potencia de Obatoclax junto con agentes quimioterapéuticos aprobados para el tratamiento del CCR. Hemos observado que la citotoxicidad de oxaliplatino se incrementó cuando se combina con Obatoclax. Los efectos se muestran para un período de tratamiento de 48 h en cultivo celular convencional y más validados para un período de tratamiento de 7 días en cultivo celular 3D (Fig. S3). Ni Obatoclax ni oxaliplatino solo fueron capaces de inducir la muerte celular en las células SW480 (porcentaje de células positivas de PARP escindido: 1,3% [sin tratar], 1,7 [0,25 M Obatoclax] y 1,6% [20 mM Oxaliplatino]). En contraste, el 22,7% de las células se sometieron a la apoptosis como se indica por la tinción de PARP escindido cuando Obatoclax y oxaliplatino se combinaron (Fig. S3C). Es importante destacar que no hubo ningún efecto sensibilizante para la combinación de Obatoclax con 5-FU (datos no mostrados). Tomados en conjunto, nuestras observaciones indican un dependiente de la inducción de muerte celular por dosis ABT-737 y un efecto dependiente de la dosis y el tipo de células en proliferación de Obatoclax. La combinación de inhibidores de Bcl-2 con la quimioterapia, por ejemplo oxaliplatino, debe ser analizada como un enfoque de tratamiento potencial en estudios futuros.
Obatoclax recupera E-cadherina en células CRC, pero deja anti-apoptóticas Bcl-2 niveles de proteína sin cambios
Recientemente hemos demostrado que siRNA regulación a la baja de anti-apoptóticas mediada por proteínas Bcl-2 afecta la migración y la invasión de las células CRC [7]. E-cadherina es una proteína unida a la membrana sobre todo con una función clave para uniones de adherencia y Wnt-señalización. Se ha demostrado que se pierde durante la transformación maligna [8]. Sorprendentemente, encontramos una recuperación importante de E-cadherina en todas las líneas celulares, a excepción de las células SW480, después del tratamiento Obatoclax (Fig. 2A). Es de destacar que la N-cadherina, que ha sido reportado como un promotor de la migración, no era detectable en las cuatro líneas celulares investigadas (datos no mostrados) [9].
(A) Western Blot para la E-cadherina en cuatro líneas celulares de CRC después de 24 h de tratamiento con Obatoclax en dosis crecientes (izquierda). Correspondiente análisis densitométrico relación con los controles no tratados y ajustado a la tubulina como control de carga. (B) de Western blot para MCL-1, Bcl-2 y Bcl-x
L en células HT29 (izquierda) y células SW480 (derecha) después de 24 h de tratamiento con Obatoclax. Tubulina sirve como control de carga. Las transferencias Western son representativos de al menos tres experimentos independientes de borrones. reportaron
Otros que antiapoptóticas Bcl-2 de proteínas, por ejemplo, MCL-1, fueron rápida y completamente degradada en las células cancerosas tratadas con Obatoclax [10]. En agudo contraste, nuestros datos muestran ninguna disminución de MCL-1, Bcl-2 o Bcl-x
niveles L. Muy al contrario, toda la inmunotransferencia de proteínas de células reveló un mayor nivel de Bcl-x
L y un ligero aumento de Bcl-2 niveles en las células HT29 para todas las concentraciones Obatoclax aplicado (Fig. 2B, izquierda). En las células SW480, Bcl-2 y Bcl-x
L niveles aumentaron a baja dosis Obatoclax, pero mostraron niveles similares a las células no tratadas bajo las dosis más altas Obatoclax (Fig. 2B, derecha). niveles MCL-1 mostró un aumento más prominente en tratamiento Obatoclax comparación con Bcl-2 y Bcl-x
L en las células HT29 (Fig. 2B, izquierda). No se detectaron cambios notables en los niveles MCL-1 de las células SW480 (Fig. 2B, derecha).
Baja dosis Obatoclax perjudica notablemente la migración y la invasión de las células CRC
Con el fin de investigar más a fondo el impacto de Obatoclax en las células de CRC, se realizó cicatrización de heridas ensayos de migración. Incluso dosis subletales fueron capaces de afectar enormemente la capacidad migratoria de las células HT29 con el tiempo. Después de 48 h, la reducción de distancias medida fue de 650 micras de control de las células en comparación con 263 micras en las células tratadas Obatoclax (Fig 3A y B, p & lt;. 0.001). Además, las células CaCo2 migran significativamente menos en tratamiento con 0,25 M Obatoclax. reducción de distancias fue 901 frente a 744 micras (Figura 3C, p. & lt; 0,05). De nota, ABT-737 no inhibir la migración, incluso en una dosis de 5 M como se muestra en la Fig. S1
.
(A) Representante imágenes de los ensayos de cero cicatrización de heridas de vehículo (superior) y células Obatoclax (inferiores) tratados HT29. La barra de escala se aplica para todas las imágenes. (B) de reducción de distancias de las células HT29 después del tratamiento 48 h con Obatoclax. cierre (C) Gap de células CaCo2 tratada 48 h con Obatoclax. Los ensayos se realizaron por triplicado. Las barras representan la media ± SD. Los ensayos son representativos de al menos tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05, *** p & lt; 0,001. Oba = Obatoclax.
sistemas de cultivo celular tridimensional reflejan un mejor crecimiento fisiológico celular, así como la morfología y las interacciones célula-célula de acogida [11]. Además, un sistema de tres dimensiones plantea la posibilidad de llevar a cabo experimentos de cultivo celular a largo tiempo incluyendo la exposición al fármaco obtener más información que el cultivo celular convencional. Por lo tanto, hemos utilizado andamios de poliestireno para 7 días de tratamiento Obatoclax seguido de evaluación de la invasión, proliferación y apoptosis. células HT29 no mostraron inducción de la apoptosis después del tratamiento con Obatoclax (Fig. 1B y D). Sorprendentemente, había un bloqueo de la invasión masiva en cultivo celular a largo plazo en 3D (Fig. 4A y B). Además, Colo205 mostró una migración profundamente alterada en cultivo celular a largo plazo como se indica por una disminución de la profundidad de la invasión (Fig. S2). No se observó la inducción de apoptosis pero un deterioro de la proliferación, como se indica por una reducción de Ki67 positividad, (Fig. S2). Esta observación subraya aún más la amplia eficacia antitumoral de Obatoclax con respecto a un fenotipo inhibidor de la migración en combinación con un efecto antiproliferativo, independiente de la inducción de la muerte celular.
(A) las imágenes representativas de las células HT29 en andamios después del tratamiento de 7 días con Obatoclax (hematoxilina y eosina. La barra de escala se aplica tanto para fotos) (B) análisis de la profundidad de la invasión de los andamios correspondiente. Los ensayos se realizaron por triplicado. Las barras representan la media ± SD. Los ensayos son representativos de al menos tres experimentos independientes. *** P & lt; 0,001. Oba = Obatoclax.
A continuación, se investigó la capacidad de invasión de las células SW480 tratadas con dosis bajas de Obatoclax en un matrigel que contiene cámara de Boyden ensayo. Con el fin de probar de fijación apropiado de células en Obatoclax que contienen medio, las células se sembraron previamente en placas de poliestireno, seguido por el ensayo MTT después de 24 h. No había unión deterioro observado en presencia de Obatoclax (datos no mostrados). Invasion fue sorprendentemente inhibida en las células tratadas con 0,25 M Obatoclax (293 invadieron células de control vs. 89 células Obatoclax tratados invadido, p & lt;. 0,001, Fig 5) y se abrogó aún más en las células tratadas con 0,5 M Obatoclax (293 invadieron células de control vs. 59 células tratadas Obatoclax invadido, p & lt;.. 0,001, figura 5)
células SW480 se sembraron en la cámara superior de un transwell. 48 h después de la siembra, los núcleos en la superficie inferior se visualizaron mediante tinción con Hoechst. (A) Representante imágenes de la superficie inferior de inserción después de la tinción de Hoechst (barra de escala indican aumento para todos los paneles). (B) se contaron cinco campos de visión por plaquita. N = 5 por grupo. Los valores se expresan como media ± desviación estándar. Los ensayos son representativos de al menos tres experimentos independientes. *** P & lt; 0,001. Oba = Obatoclax, ctrl = control.
La sobreexpresión de anti-apoptóticas Bcl-2 proteínas restaura la migración de las células tratadas Obatoclax CRC
A continuación, como objetivo buscar el compromiso de antiapoptótico Bcl-2 proteínas con el fenotipo inhibidor de la migración causada por Obatoclax. Encontramos una impresionante recuperación de la migración en las células HT29 tratadas con 0,25 M Obatoclax pero que sobreexpresan anti-apoptóticas Bcl-2 de proteínas. Este efecto se observó fenotipo revertir para MCL-1 (p & lt; 0,05), Bcl-x
L (p & lt; 0,001) y Bcl-2 (p & lt; 0,001), con el efecto más pronunciado para Bcl-2 (Fig. 6A-D). La sobreexpresión de las proteínas anti-apoptóticas bloqueado constantemente la inhibición de la migración en tratamiento Obatoclax durante 72 h. Es de gran importancia en este contexto para asegurar que una restauración de la migración hay ninguna característica secundaria de una proliferación aumentada debido a una sobreexpresión de antiapoptóticas Bcl-2 de proteínas. Por lo tanto, se determinó la proliferación de células que sobreexpresan MCL-1, Bcl-2 o Bcl-x
L. Hemos observado ningún efecto sobre la proliferación de cualquiera de las proteínas investigadas como se muestra en detalle en la Fig. S4. (A-D).
(A-D) de reducción de distancias de curación de los ensayos de migración de las células HT29 tratadas con Obatoclax herida. (A) Vector y MCL-1 células transfectadas vector (B) y Bcl-xL células transfectadas y (D) vector y Bcl-2 células transfectadas. (C) las imágenes representativas de la cicatrización de heridas de vectores y MCL-1 en las células transfectadas tratadas con Obatoclax. Los valores se expresan como media ± desviación estándar. Los ensayos son representativos de al menos tres experimentos independientes. *** P & lt; 0,001. Vec = vector.
Baja dosis Obatoclax inhibe la proliferación a través de la fase G1 arrestar acompañada de una regulación al alza de p27 y p21, así como regulación a la baja de la ciclina D1
Dado que las células de CRC en los andamios 3D mostró un deterioro de la proliferación en tratamiento a largo plazo con Obatoclax, decidimos diseccionar la regulación del ciclo celular. La tinción de ADN contenido en tratamiento Obatoclax reveló un cambio masivo de la G2- en la fase G1 del ciclo celular que es indicativo de la detención de la fase G1 o una transición de fase G1 alterado. La proporción de células en la fase G2 se redujo de 37% en las células de control a 13% en las células HT29 tratadas con 0,25 M Obatoclax (Fig 7A y B, p & lt;. 0.001).
(A) de flujo de Representante análisis cytomeric para el contenido de ADN en las células HT29 tratadas con 0,25 M Obatoclax. 2n = células diploides en la fase G1, 4N = células tetraploides en G2-fase. (B) El análisis gráfico de la distribución de fase del ciclo celular que corresponde a (A). Los valores se expresan como media ± desviación estándar. *** P & lt; 0,001. (C) Rel. los niveles de mRNA de la ciclina D1, p21 y p27 en células HT29 2 y CaCo después del tratamiento 24 h con Obatoclax. los niveles de mRNA fueron cuantificados por qRT-PCR y se normalizaron a GAPDH como gen de mantenimiento. Los ensayos son representativos de al menos tres experimentos independientes. (D) transferencias de Western representativas para ciclina D1, p21, y p27 en las células HT29 y CaCo2 tratados con Obatoclax para 24 h. Tubulina sirve como control de carga. Oba = Obatoclax, ctrl = control.
Además, el objetivo fue cuantificar las proteínas reguladoras del ciclo celular central bajo tratamiento Obatoclax. Ciclina D1 (CD1) representa la clave de ciclina para la transición G1-fase [12]. CD1 fue marcadamente downregulated bajo tratamiento Obatoclax tanto en el nivel de ARNm y de proteína en HT29 (0,5 veces el cambio) y las células CaCo2 (más de 0,5 veces el cambio, Fig. 7C y D). p27 es un inhibidor de quinasa dependiente de ciclina (CDKI) y su regulación positiva indica la detención del ciclo celular [13]. Hemos observado una regulación al alza de p27 en ARNm y los niveles de proteína en las células HT29 y CaCo2 tratados con Obatoclax (Fig. 7C y D). Además, se observó un aumento dependiente de la dosis y notable de la ciclina quinasa dependiente de p21 inhibidor de ARNm y los niveles de proteína en las células HT29 y CaCo2 (Fig. 7C y D). Tomados en conjunto, estos datos son indicativos de la regulación del ciclo celular por Obatoclax a través de proteínas reguladoras clave de la transición del ciclo celular, como la ciclina D1, p27 y p21.
Discusión
Anitapoptotic miembros de la Bcl familia de proteínas -2 son frecuentemente sobreexpresado en los cánceres humanos incluyendo CRC [3]. Los altos niveles de proteínas anti-apoptóticas se ha demostrado que contribuyen a la mala respuesta al tratamiento y para promover la progresión tumoral. Por ejemplo, Bcl-x
L expresión se correlaciona con metástasis en los ganglios linfáticos, pobre diferenciación y superior etapa de Duke en el CCR [14]. Los patrones de expresión de MCL-1 son predictivos de la respuesta al tratamiento en pacientes diagnosticados con CRC metástasis [15]. Por lo tanto, grandes esfuerzos se han hecho con el fin de orientar anti-apoptóticas Bcl-2 de proteínas destinadas a cáncer de inducción de muerte celular [16]. Es importante destacar que, más profundos conocimientos mecánicos y estructurales condujeron al desarrollo de inhibidores de molécula pequeña de antiapoptóticas Bcl-2 de proteínas. Esta clase de moléculas pequeñas actúa mediante la unión a la hidrofóbica BH3-hendidura de antiapoptóticas Bcl-2 de proteínas que imitan de ese modo proapoptóticos proteínas Bcl-2 y la promoción de la muerte celular [17]. De seguridad y la dosis de ensayos para encontrar con Obatoclax han llevado a cabo en tumores malignos sólidos y linfoma [18], [19]. A pesar del hecho de que BH3-miméticos ya han entrado en ensayos clínicos tempranos, sólo unos pocos se sabe acerca de los efectos de la inhibición de proteínas Bcl-2, aparte de regulación de la muerte celular [18], [19]. Recientemente hemos demostrado que una caída de MCL-1, Bcl-2 o Bcl-x
L inhibe sorprendentemente la invasividad de las células de CRC. En este estudio anterior, una caída de una sola proteína Bcl-2 (MCL-1, Bcl-2 o Bcl-x
L) fue suficiente para bloquear la migración y la invasión [7].
Sobre la base de estos informes anteriores, nuestro estudio tuvo como objetivo investigar el potencial de Bcl-2 inhibición de pequeñas moléculas como fármacos candidatos para el tratamiento del CCR
in vitro
. En primer lugar, se comparó la eficacia de la Bcl-2 y Bcl-x
inhibidor L ABT-737 con el pan-Bcl-2-inhibidor Obatoclax. Una comparación directa de los dos inhibidores permite que los efectos distintivos de una amplia inhibición de todas Bcl-2 por Obatoclax de una manera más específica el uso de ABT-737. A pesar de que ambos inhibidores mostraron una toxicidad significativa en los ensayos clínicos, estos compuestos pueden ser utilizados como herramientas para preclínica
in vitro
-testing de Bcl-2 inhibición [19] - [22]. ABT-737 ha demostrado que la sinergia con oxaliplatino y celecoxib en la destrucción de células CRC [23], [24]. Hemos observado la inducción de apoptosis dependiente de la dosis causada por ABT-737 en todas las líneas celulares investigadas. Está bien documentado que una resistencia hacia ABT-737 puede ser impulsado por los altos niveles de MCL-1 a través de la inhibición de la proapoptótico NOXA [25]. Muy recientemente, se ha demostrado que las células cancerosas en condiciones de hipoxia se resensitized a ABT-737 por una pérdida de MCL-1 [26]. Puesto que los efectos de ABT-737 son claramente proapoptótico y los factores determinantes para la sensibilidad en el CCR están bien documentados, decidimos centrarnos más en los efectos antitumorales de Obatoclax.
En agudo contraste con ABT-737, Obatoclax no dio lugar a significativos la inducción de muerte celular en las células de CRC. En nuestro estudio, las dosis Obatoclax aplicadas fueron clínicamente relevantes, como se indica en ensayos de fase I, y no alcanzó el Compuesto IC
50 reportados para Obatoclax [19], [27] Curiosamente, el tratamiento Obatoclax resultó en niveles de expresión estables o en aumento de todas antiapoptóticas Bcl-2 de proteínas investigadas. Otro estudio mostró regulación a la baja de antiapoptóticas Bcl-2 de proteínas en tratamiento Obatoclax en células de linfoma [10]. Dado que este estudio demuestra la apoptosis de células de linfoma causadas por Obatoclax, disminución de los niveles de las proteínas antiapoptóticas pueden ser secundarios en el curso de la muerte celular en lugar de provocado por un efecto de la unión directa de Obatoclax.
Desmontables o sobreexpresión de MCL-1 , Bcl-2 o Bcl-x
L no retrasó la progresión del ciclo celular y la proliferación en las células de CRC [7]. Por el contrario, la baja dosis de tratamiento Obatoclax provocó la proliferación de retraso en nuestro estudio. Descubrimos una detención de la fase G1 acompañada de pérdida de la expresión de ciclina D1 y la regulación positiva de p21 y p27. Ciclina D1 (CD1) es la fase G1 más prominente Ciclina y ha sido reportado como un controlador oncogénica en células cancerosas. expresión CD1 se asocia con la transformación neoplásica y el aumento de la malignidad en el cáncer [12]. La transición /fase S G1 está estrechamente regulada por CDKIs tales como p21 y p27 a través de la inactivación de las quinasas dependientes de ciclina G1-ciclina (CDK) complejos de [13], [28]. Tomados en conjunto, nuestros datos revelan una propiedad novedosa regulación del ciclo celular a través de Obatoclax detención de la fase G1. Este efecto no fue antagonizado por la sobreexpresión de antiapoptóticas Bcl-2 de proteínas. Además, ni la sobreexpresión de antiapoptóticas Bcl-2 de proteínas ni ABT-737 progresión del ciclo celular afectado. El retraso del ciclo celular y perjudicar el crecimiento incontrolado de células de CRC es aparentemente una proteína Bcl-2 efecto independiente de Obatoclax. Incluso si los mecanismos exactos subyacentes y los objetivos pertinentes siendo difícil de alcanzar, podría ser posible que la señalización de mTOR desempeña un papel en este contexto. Una actividad de unión de Obatoclax de mTOR, así como la inhibición de la autofagia fase tardía se han reportado recientemente y podrían desempeñar un papel causal de los efectos antiproliferativos descritos [29], [30]. Otros análisis moleculares decentes están garantizados para diseccionar Obatoclax impacto relevante en la regulación del ciclo celular. Por ejemplo, las CDK puede investigarse como posibles objetivos de Obatoclax en futuros estudios.
quimioterapéuticos convencionales son más eficaces en la reproducción de las células cancerosas. Incluso si se demuestra claramente que Obatoclax reduce las propiedades proliferativas de células CRC, nuestros datos demuestra la capacidad Obatoclax para superar la resistencia hacia la muerte celular en las células SW480 oxaliplatino. El potencial terapéutico de la combinación de regímenes de quimioterapia basados en platino con Obatoclax con el fin de superar la resistencia a la apoptosis ya ha sido reportado y se destaca además por nuestros datos [31], [32]. En células de carcinoma de esófago, Obatoclax tenía actividades sinérgicas junto con 5-FU [32]. En nuestro estudio, los efectos sinérgicos de Obatoclax estaban restringidos a oxaliplatino que señala en un efecto dependiente tipo de célula cancerosa. efectos fuertes de Obatoclax en la autofagia se han demostrado en varios estudios recientes [32] - [34]. Sin embargo, la relevancia de la señalización de la autofagia inducida por Obatoclax sigue siendo difícil de alcanzar para CRC
La migración y la invasión son requisitos previos de la propagación de las células cancerosas, lo que lleva a la invasión local y metástasis distante de órganos [35] -. [37]. Nuestro grupo ha demostrado recientemente las funciones de regulación de anti-apoptóticas Bcl-2 de proteínas sobre la migración y la invasión de las células CRC independientes de la muerte y la proliferación celular [7]. A la luz del hecho de que no podía Obatoclax suficientemente inducir la muerte de las células del CRC, se investigó la migración y la invasión de las células CRC bajo tratamiento Obatoclax. Sorprendentemente, la baja dosis Obatoclax bloqueó la migración y la invasión en todas las líneas celulares investigadas. A largo plazo el cultivo de células en 3D de células CRC bajo tratamiento Obatoclax confirmó este bloqueo de la migración a pesar de la falta de inducción de muerte celular. Es importante destacar que la migración fue bloqueado por Obatoclax en líneas celulares resistentes como Colo205 y CaCo2. Las cadherinas son importantes reguladores de la unión celular y están implicados en las redes principales de señalización como Wnt. Se ha demostrado que un golpe de gracia específica intestinal condicional de E-cadherina causó un aumento de la migración y proliferación en el intestino [38]. Por otro lado, la expresión de E-cadherina se redujo la migración y la proliferación en las criptas intestinales [39]. En la carcinogénesis colorrectal, la eliminación funcional de E-cadherinas representa un paso clave en la adquisición de la capacidad de invasión [40]. Nosotros, por lo tanto, tenía por objeto analizar los cambios en la expresión de E-cadherina. Se demuestra una profunda restauración de E-cadherina en las células de CRC en tratamiento con Obatoclax. Sin embargo, E-cadherina upregulation puede representar el interruptor molecular de nuevo a un fenotipo menos invasivo de las células CRC causadas por Obatoclax.
Es importante destacar que, y en contraste con la función inhibidora del crecimiento de Obatoclax, la migración se restauró completamente en las células de CRC sobreexpresan MCL-1, Bcl-2 o Bcl-x
L. En el contexto de la invasión, antiapoptóticas Bcl-2 de proteínas aparecen como los principales objetivos afectados. Esto está en línea con nuestro informe anterior que muestra una función reguladora de anti-apoptóticas Bcl-2 de proteínas en células de invasión CRC sin afectar a la proliferación o inducir la muerte celular [7]. Otros estudios apoyan la hipótesis de que la Bcl-2 de proteínas son relevantes para la metástasis [41] - [43]. Por el contrario, el tratamiento ABT-737 no es suficiente para bloquear la migración y la invasión de las células de CRC. En nuestro estudio, mostramos que Obatoclax es capaz de inhibir tanto, la migración y la invasión, incluso en dosis muy bajas. Este efecto de la Obatoclax es novedoso y considerablemente, incluso en las células principalmente resistentes. Desde ABT-737 no inhibe la migración, se propone una función de agente específico y único de Obatoclax dentro del grupo de compuestos dirigidos proteínas Bcl-2.
Conclusión
Sobre la base de los datos de nuestra estudio, se concluye que el inhibidor de Pan-Bcl-2 Obatoclax contrarresta diversos procesos biológicos relevantes para la progresión tumoral. La eficacia de Obatoclax sobre las células CRC es amplia e incluye una muerte celular independiente pero la proteína Bcl-2 adicto inhibición de la migración. El segundo efecto importante afecta a la progresión del ciclo celular y es independiente de la proteína Bcl-2 de orientación. Por lo tanto, cacerola Bcl-2-inhibición, incluyendo el desarrollo de inhibidores específicos y menos tóxicos, es un enfoque prometedor para el tratamiento de la CRC y debería seguir siendo analizado, por ejemplo, en combinación con la quimioterapia.
Material y Métodos
Reactivos y líneas celulares
CRC líneas celulares HT29, SW480, CaCo2 y Colo205 se adquirieron de ATCC. Las células se cultivaron en una atmósfera humidificada (37 ° C, 5% de CO
2) en RPMI + Glutamax (Gibco, Karlsruhe, Alemania) suplementado con 10% de FCS (PAA Laboratories, Cölbe, Alemania), 1% Pen /Strep (PAA Laboratories), 1% HEPES (Gibco) y 1% de aminoácidos no esenciales (NEAA, Gibco). Obatoclax y ABT-737 se adquirieron de Selleckchem (Múnich, Alemania), oxaliplatino de Sigma-Aldrich (Múnich, Alemania).
La viabilidad y el crecimiento de células de ensayo
Las células se sembraron en placas de 12 pocillos y 24 h después de la siembra transfectadas o someterse al tratamiento indicado. El crecimiento celular se determinó utilizando un ensayo colorimétrico 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, bromuro de 5-difeniltetrazolio (MTT) como se describe [7].
reacción cuantitativa en cadena de polimerasa en tiempo real (q-RT-PCR)
El aislamiento de ARN total y la síntesis de ADNc se realizó según lo descrito anteriormente [44]. Q-RT PCR se realizó usando kits de ensayo de cebadores (Qiagen, Hilden, Alemania). La adquisición de datos y la determinación de la expresión génica se realizó utilizando el paquete de software LightCycler (Roche, Mannheim, Alemania). Cada reacción de PCR se llevó a cabo por duplicado. la expresión de ARNm se normalizó a la expresión de la limpieza gen GAPDH.
Detección de la apoptosis y la distribución de fase del ciclo celular
En el primer día después de la transfección, las células se trataron como se indica para 48 h. El sobrenadante se transfirió a tubos FACS y las células luego se separaron suavemente usando Accutase. Después de la centrifugación, las células se resuspendieron en un tampón hipotónico que contiene 0,1% (w /v) de citrato de sodio, 0,1% (v /v) de Triton X-100 y 50 mg /ml de yoduro de propidio (Sigma-Aldrich). Después de 1 h de incubación a 4 ° C, el contenido de ADN total de las células se midió de acuerdo con el protocolo de Nicoletti
et al.
Mediante citometría de flujo [45]. Análisis del ciclo celular se realizó usando FACS Diva 6 (Becton Dickinson) y FlowJo 7.6.5. (Árbol Star Inc.). Las células que representan la fracción sub-G1 se representan como apoptosis.
La lisis celular, SDS-PAGE, Western Blot y densitometría
Las células se sembraron en placas de 6 pocillos, se cultivaron durante 24 h, y tratados como indicado. La lisis celular, SDS-PAGE y transferencia de Western se realizaron como se describe anteriormente [46].