Extracto
La esfingosina-1-fosfato (S1P) transportador Spns2 regula la migración precursor de infarto en el pez cebra y el tráfico de linfocitos en ratones. Sin embargo, su función en el cáncer no se ha investigado. Mostramos aquí que la expresión ectópica Spns2 apoptosis y su caída mejorado la migración de células en células de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) inducida. Metabólicamente, la expresión Spns2 aumentó el nivel de S1P extracelular mientras que su caída al intracelular. La inhibición farmacológica de la síntesis de S1P abolió la migración celular aumentada mediada por Spns2 caída, lo que indica que S1P intracelular juega un papel clave en este proceso. Los estudios de señalización celular indicaron que la expresión alterada Spns2 GSK-3β y STAT3 mediada vías pro-supervivencia. Por el contrario, estas vías fueron activadas por Spns2 desmontables, lo que explica el aumento de la migración de las células, ya que también son cruciales para la migración. No se encontraron alteraciones de Spns2 afectar varias enzimas implicadas en el metabolismo de S1P, incluyendo esfingosina quinasas, fosfatasas, y S1P liasa S1P 1. genéticamente, se encontró que el nivel de ARNm Spns2 a reducirse en el cáncer de pulmón avanzado (LC) de los pacientes que se cuantificó mediante el uso de una pequeña escalar matriz qPCR. Estos datos demuestran por primera vez que Spns2 juega un papel clave en la regulación de las funciones celulares en las células NSCLC, y que su baja regulación es un factor de riesgo potencial para la CL
Visto:. Bradley E, S Dasgupta, Jiang X, Zhao X, Zhu G, Él Q, et al. (2014) El papel crítico de Spns2, un Transportador esfingosina-1-fosfato, en el cáncer pulmonar de células de supervivencia y migración. PLoS ONE 9 (10): e110119. doi: 10.1371 /journal.pone.0110119
Editor: Junming Yue, la Universidad de Tennessee Health Science Center, Estados Unidos de América
Recibido: 17 Junio, 2014; Aceptado: September 8, 2014; Publicado: 20 Octubre 2014
Derechos de Autor © 2014 Bradley et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes están en el cuerpo y soporte de archivos de información del documento
Financiación:. Este proyecto es apoyado por una beca intramural de la Universidad de Regentes de Georgia y un premio SDG de American Heart Association (GW). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón (LC) es la causa principal de muerte relacionada con el cáncer en los Estados Unidos y en todo el mundo [1], [2]. En el año 2012, hay más de 220.000 nuevos casos y más de 160.000 muertes en los Estados Unidos solamente [1], [3], [4]. LC es una enfermedad muy heterogénea. Sus dos formas principales son células no pequeñas LC (NSCLC) y LC pequeña celda, entre los cuales NSCLC es la forma más común que representa alrededor del 85% de los nuevos casos diagnosticados [1], [4].
Las anomalías genéticas han relacionado múltiples genes y vías de señalización a NSCLC, incluyendo el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), transductor de señal y activador de la transcripción 3 (STAT3), y fosfoinosítido 3-quinasa
-
Akt-mTOR vías [ ,,,0],1], [2], [4]. Estos descubrimientos han llevado a dirigido únicamente terapias con inhibidor específico de drogas tales como erlotinib y gefitinib para las mutaciones en EGFR [5] o crizotinib para la translocación de genes que resulta en el oncogén EML4-ALK [6]. variaciones epigenéticas también están relacionados con NSCLC [7], [8]. A pesar de su diagnóstico y tratamiento está evolucionando rápidamente, mejoras significativas en los resultados para la mayoría de los pacientes con CPNM son todavía difícil de alcanzar [1], [3]. tumores metastásicos más agresivos Muchos pacientes de recaída y formar [9]. Por lo tanto se necesita urgentemente una comprensión más profunda de los orígenes y los mecanismos moleculares de la metástasis de la enfermedad con el fin de mejorar la prevención y el tratamiento.
La esfingosina 1-fosfato (S1P) es una molécula de señalización bioactivo potente que juega un papel vital en diversos procesos fisiológicos y patológicos, como la inmunidad y el cáncer [10], [11], [12], [13]. Se promueve el cáncer mediante la regulación de la proliferación celular /supervivencia, la migración, la angiogénesis y la linfangiogénesis [10], [14], [15]. Una de las enzimas que genera S1P, esfingosina quinasa 1 (SphK1) (Fig. 1A), se considera como una enzima oncogénico, cuya actividad puede ser estimulada por una amplia gama de agonistas, por ejemplo, hormonas y factores de crecimiento [16], [17]. Por el contrario, la enzima que degrada S1P, S1P liasa 1 (SGPL1) (Fig. 1A), es regulada hacia abajo en el cáncer de próstata [17]. El silenciamiento de SGPL1 mejora la supervivencia de las células; y la expresión forzada SGPL1 sensibiliza las células a la radiación o la quimioterapia [17]. Además, muchos aspectos de las vías de señales de S1P están estrechamente relacionados con la tumorigénesis (Fig. 1A) [10], [18]. S1P extracelular ejerce la mayor parte de su función a través de cinco de la superficie celular acoplados a la proteína G-receptores S1P1 S1P5-[10]. Estimula diferentes vías de transducción de señales en diferentes tipos de células, así como dentro de la misma célula, en función de los receptores expresados. Por ejemplo, S1P1 se acopla exclusivamente
a través de
proteína Gi para activar Ras, proteína activada por mitógeno quinasa (MAPK), PI3K /Akt, y fosfolipasa C vías [10], [19]. La S1P intracelular, por otra parte, promueve la progresión del cáncer de una manera independiente del receptor [11], [12], ya sea por mediación de la liberación de calcio desde el retículo endoplásmico, o mediante la interacción con sus dianas intracelulares, tales como HDAC y TNF receptor- factor asociado 2 (TRAF2) [20]. Más importante aún, S1P elevación ha sido implicado como un factor de riesgo de LC en un estudio epidemiológico [21]
(A), la representación esquemática del metabolismo S1P y función, SGPP, S1P fosfatasa.; SphK, esfingosina quinasa; SGPL, S1P liasa; guisante, fosfoetanolamina. (B), análisis de transferencia de Western de la expresión Spns2-EGFP detectado por un anticuerpo anti-GFP. β-actina (actina) se utilizó como control de carga. Las células A549 se transfectaron con Spns2-EGFP y lisados de células después de 48 horas. El peso molecular de Spns2-GFP es de alrededor de 84 kD (58 + 26; flecha). (C), la expresión Spns2 aumentó el nivel extracelular de S1P, esfingosina (SPH), y dihidroesfingosina (dhSph). Las células se cambiaron a medios de comunicación con sin lípidos FBS 24 horas después de la transfección. Otras 24 horas después, se recogieron los medios y se centrifugaron, y el sobrenadante se analizaron por lipidomics. (D), Lapso de tiempo en imágenes de las células Spns2 positivos. A549 células fueron transfectadas con EGFP-Spns2 como en A. 12-16 horas más tarde, las células se colocaron en una cámara ambiental que mantiene 37 ° C y 5% de CO
2 y las imágenes de lapso de tiempo tomadas en puntos de tiempo indicados. La barra de escala es de 10 micras. (E), confocal de barrido láser de imágenes de células inmuno-manchada con activa la caspasa (eliminado) 3 (Casp3). Las células A549 se transfectaron transitoriamente, se fijaron y se tiñeron con un anticuerpo contra escindido Casp3. La barra de escala es de 20 micras.
S1P se genera de forma intracelular por SphKs y su nivel celular se mantiene por un equilibrio ajustado entre la generación, la conversión, la degradación y la exportación (fig. 1A). S1P se exporta fuera de las células por las proteínas de transporte (Fig. 1A). Se han propuesto varias casete de unión a ATP-(ABC) miembros de la familia, tales como ABCA1, ABCC1, y ABCG1 para el transporte de S1P basado en observaciones de que su caída o la inhibición farmacológica de liberación disminución S1P [22], [23], [24], [ ,,,0],25], [26]. Sin embargo, esta idea sigue siendo controvertida, ya que S1P exportación no se altera cuando estas proteínas se expresan de forma exógena en células o eliminados en ratones [18], [27], [28]. Recientemente, la solterona homólogo 2 (Spns2), un miembro de la superfamilia importante facilitador de los transportadores no dependientes de ATP, se ha demostrado que el transporte de S1P tanto
in vitro
y
in vivo
[27 ], [29], [30], [31], [32], [33], [34]. Más interesante, a pesar de la reducción en el plasma, los niveles de S1P se incrementan en algunos tejidos incluyendo pulmón en ratones deficientes Spns2 [33], que es coherente con un informe anterior que muestra que Spns2 se expresa más abundantemente en el pulmón humano [18].
Estos resultados nos llevaron a la hipótesis anteriores que Spns2 está implicado en el desarrollo de LC. Hemos llevado a cabo con ganancia de función y experimentos de pérdida de función en las células de NSCLC. También hemos detectado nivel de expresión de Spns2 en muestras de pacientes de LC.
Materiales y Métodos
Materiales
Los anticuerpos contra fosfato GSK-3β (Ser 9), GSK-3β, fosfo-STAT3, STAT3, se escindió de la caspasa 3, y survivina eran de Tecnologías de señalización celular (Danvers, MA). Los anticuerpos contra la FIA y β-actina eran de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). El anticuerpo contra LC3B fue de Abcam (Cambridge, MA). El anticuerpo contra SphK2 era de Exalpha Biológicos (Dublin, OH). El marcaje fluorescente de los inhibidores de caspasas kit (FLICA) era de inmunoquímica Technologies (Bloomington, MN). SphK inhibidor de esquí-1 era de Biovision (Milpitas, CA). El pan inhibidor de caspasa Z-VAD era de Promega (Madison, WI). El inhibidor de PI3K LY294002 era de Cayman (Ann Arbor, MI). Y el inhibidor de Jak Jaki era de Millipore (Billerica, MA). en tiempo real matrices LC humanos PCR eran de Origene (Rockville, MD).
Métodos
plásmido de clonación.
SPNS2 humano se amplificó por PCR a partir de una BAC utilizando cebadores hSpns2forward: AAG CTT ATG CTG TGC TGC GAA CCG TCG, y hSPns2reverse: GGT ACC AA GAC CAC TTT AGA TGC GGG CGG; y se subclonó en pGEM Teasy vector (Promega, Madison, WI). El fragmento se digirió con las enzimas HindIII y KpnI y se clonó en pEGFP-N1 vector (Clontech, Mountain View, CA), resultando en la pSPNS2-EGFP construir. Por HA etiquetada Spns2, cebadores que contienen la etiqueta HA fueron diseñados. El producto de PCR fue clonado en pcDNA3.1 (Life Tech., Carlsbad, CA, EE.UU.), similar a pSPNS2-EGFP.
Cultivo celular y tratamiento.
El NSCLC humano líneas celulares A549 y H1299 (ATCC, Manassas, VA) fueron donaciones generosas de Dr. Zhonglin Hao, Centro de cáncer de la Universidad de Georgia Regents. Las células epiteliales braquial humanos primarios (HBEpC) eran de ATCC (Manassas, VA). Las células A549 y células H1299 se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (Cellgro, Herndon, VA, EE.UU.) que contiene 10% de FBS (Hyclone, Thermo Fisher Scientific, Austin, TX), y penicilina /estreptomicina (Life Tech.). HBEpC se mantuvieron según las instrucciones del fabricante. La transfección de siRNAs Spns2 se llevó a cabo por cualquiera de Lipofectamine 2000, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Life Tech.) O electroporación utilizando un Nucleofactor (Lonza, Allendale, NJ).
Tiempo de células vivas lapse de imágenes, inmunocitoquímica y láser confocal microscopía.
imágenes de células vivas se realizó siguiendo los procedimientos publicados anteriores [35], [36], [37], [38]. Brevemente, las células fueron transfectadas con Spns2-GFP. Dieciséis horas después, el cultivo se puso en una cámara de imágenes de células vivas y contraste de fase micrografías tomadas cada 30-60 minutos con una Nikon Eclipse TE300 (Nikon Instruments, Inc., Melville, NY, EE.UU.. Para la inmunocitoquímica y el láser microscopía confocal, la células fijadas se inmunotiñeron con anticuerpos enumerados y las imágenes tomadas con un láser confocal de barrido microscopio Zeiss LSM510 equipado con un láser de argón de dos fotones a 488 nm (Cy2), 543 nm (Cy3) y 633 nm (Cy5, Alexa Fluor 647), respectivamente . software LSM 510 Meta 3.2 se utilizó para la adquisición de imágenes. Adobe Photoshop CS4 se utilizó para la reducción de fondo y la edición. las imágenes obtenidas con el anticuerpo secundario solamente se utilizaron como controles negativos que representan la intensidad de fondo en un canal de láser particular. se cuantificó la inmunotinción antígeno-específica contando las células que mostraban señales de dos veces o más por encima de la fluorescencia de fondo.
extracción de ARN, RT-PCR, y qPCR.
ARN se extrajo usando el reactivo Trizol (Invitrogen). Primer capítulo cDNA fue generada por el kit de síntesis de ADNc iScript (BioRad, Hercules, CA, EE.UU.). tiempo real qPCR se realizó utilizando SYBR verde /mezcla maestra Rox qPCR en un PTC-200 Gradiente Cycler equipado con un detector fluorescente continua chromo 4 (BioRad). Los cebadores para la PCR cuantitativa fueron: hSpns2 humana hacia adelante: TTA CTG GCT CCA GCG TGA, hSpns2 inversa: TGA TCA TGC CCA GGA CAG; hPOLR2A hacia adelante: GGGTGGCATCAAATACCCAGA; hPOLR2A inversa: AGACAC AGCGCAAAACTTTCA; hSphK1 hacia adelante: GGC TGC TGT CAC CCA TGA A, hSphK1reverse: TCA CTC TCT AGG TCC ACA TCA G; hSphK2 hacia adelante: AGC GTG GTA GCC ACT TCA G, hSphK2 inversa: GAG CAG TGT ACC GAT GCC A; hSGPP1 hacia adelante: ATC ATC ATC GGG CTT CAT TTA GC, hSGPP1reverse: GTG GTG CAG CTC TCA AGA GT; hSGPP2 hacia adelante, TCA C CG CAC TCC TCA TCG T, hSGPP2 inversa: CCG GGT TGG GCT GTA GTA ATC; hSGPL1 hacia adelante: CCT AGC ACA GAC CTG CTT ATG T, hSGPL1 inversa: ACT CCA TGC AAT TAG CTG CCA; hABCA1 hacia adelante: TTA AAC GCC CTC CAC AAA GAC, hABCA1reverse: AAA AGC CGC CAT ACC TAA ACT; hABCC1 hacia adelante: TTA CTC ATT CAG CTC GTC TTG TC, hABCC1reverse: CAG GGA TTA GGG TCG TGG AT; hABCG1 hacia adelante: ACT GCA GCA TCG TGT ACT GGA, hABCG1reverse: CGT CTC GTC GTC GAT ACA GTG; hABCG2 hacia adelante: TGA GCC TAC AAC TGG CTT AGA, hABCG2 inversa:. CCC TGC TTA GAC ATC CTT TTC AG
ensayos
viabilidad celular y la muerte celular
Los ensayos de proliferación y apoptosis se realizaron con el A549. y H1299 células transfectadas con EGFP o hSPNS2-HA-Spns2 como se describe anteriormente [39], [40], [41]. El número de células vivas fue medido por un lector de microplacas usando el Cell Counting Kit-8 (CCK8) (Dojindo Molecular Technologies, Inc, que se basa en la actividad deshidrogenasa en células viables). Brevemente, se añadió la solución CCK8 al cultivo de células tratadas, se incubaron durante 2-4 horas, y su absorción a la longitud de onda 450 nm leído por un lector de microplacas. La absorción a 450 nm se correlaciona con el número de células vivas presentes en el pozo. El ensayo se realizó con FLICA células A549 plásmido transfectadas Spns2-EGFP usando cetona fluorometil inhibidor de péptido marcado con sulforrodamina (rojo) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, 48 horas después de la transfección con los plásmidos Spns2-EGFP, se añadió el reactivo FLICA al medio y las células se incubaron durante 1 hora a 37 ° C bajo 5% de CO
2. Las células se lavaron una vez con solución de lavado y después se fijaron con 4%
p
-formaldehyde en tampón fosfato salino para su posterior análisis por microscopía.
Citometría de flujo análisis.
Spns2 GFP transfectadas se recogieron las células A549, se fijaron en 4% de paraformaldehído, y marcadas con inmuno con la caspasa 3 de anticuerpos seguido de Alexa Fluor 555 anticuerpo secundario. Las células marcadas se analizaron mediante un Becton Dickinson FACSCalibur analizadores de 4 colores, equipadas con 4 láseres (BD Biosciences, San Jose, CA).
ensayos de migración celular.
La migración celular se midió por la herida Los ensayos de curación según lo publicado anteriormente [42]. Brevemente, las células fueron transfectadas con siRNAs Spns2 o revueltos de control por lipofectamina 2000. Las células se cultivaron durante 72 horas momento en el cual se habían hecho confluentes. Un espacio de aproximadamente 400 micras se generó por una punta de pipeta. El ancho de la brecha se midió a diferentes puntos de tiempo. Para el tratamiento de esquí-I, 10 mM de esquí-I se complementó 24 horas después de la transfección de siRNA. Las células se cultivaron durante otras 48 horas y luego ensayo realizado.
esfingolípidos y S1P medición.
Las células transfectadas con Spns2 o Spns2 siRNA se cultivaron durante 48 horas y luego se recogieron los dos sedimentos celulares y medios . Los sedimentos celulares se lavaron tres veces con PBS frío. Los medios de cultivo se centrifugaron durante 10 minutos a 4 ° C para eliminar las células flotantes y restos celulares. los niveles de S1P en las células y los medios de cultivo se midieron al lipidómica Núcleo de la Universidad Médica de Carolina del Sur (bajo la supervisión del Dr. Jacek Bielawski) de acuerdo con los protocolos publicados en un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo ThermoFisher TSQ Quantum, que opera en un sistema de Monitoreo de Reacción Múltiple (MRM) modo de ionización positiva, usando versión modificada [43]. Brevemente, los sedimentos celulares o medios de comunicación que corresponde a aproximadamente 2-3 x 10
6 células, fueron fortificadas con los estándares internos (ISS: C
17 base de D-eritro-esfingosina (17CSph), C
17 esfingosina -1-fosfato (17CSph-1P), N-palmitoil-D-eritro-C
13 esfingosina (13C16-Cer) y heptadecanoilo-D-eritro-esfingosina (C17-Cer)), y se extrajo con acetato de etilo /iso-propanol /agua (v 60/30/10 v /) sistema disolvente. Después de la evaporación y la reconstitución de 100 l de muestras de metanol se inyectaron en la /el sistema TSQ Quantum LC /MS y el gradiente HP1100 eluida de la BDS Hypersil C8, 150 x 3,2 mm, tamaño de la columna 3 micras de partículas, con 1,0 mM de formiato de amonio metanólico /2 sistema de fase móvil formiato de amonio acuoso mM. Picos correspondientes a los analitos y los patrones internos se recogieron y procesaron utilizando el sistema de software Xcalibur. El análisis cuantitativo se basa en las curvas de calibración generadas por clavar una matriz artificial con las cantidades conocidas de los patrones sintéticos de analito diana y una cantidad igual de las normas internas (ISS). El analito diana /ES relaciones de áreas de los picos se representaron frente a la concentración de analito. El analito diana /SE relaciones de área de pico de las muestras se normalizaron de manera similar a sus respectivos ISS y en comparación con las curvas de calibración, utilizando un modelo de regresión lineal. Otros esfingolípidos, tales como la ceramida y la esfingosina, también se analizaron.
Estadísticas.
Los medios y las desviaciones estándar se calcularon por Microsoft Excel. La significación estadística se calculó utilizando ANOVA de una vía y prueba post hoc de Tukey o de medidas repetidas ANOVA con GraphPad Prism. P & lt; 0,05 se consideraron significativos células
Resultados
La expresión ectópica Spns2 induce la muerte celular en las células NSCLC
Para estudiar la función de Spns2 en LC, se utilizó NSCLC.. En primer lugar, se intentó establecer una línea celular A549 estables que expresan EGFP-Spns2, pero no se obtuvo dicha línea (datos no mostrados). Por lo tanto, nos centramos en la expresión transitoria de Spns2. El análisis de transferencia de Western usando un anticuerpo anti-GFP indicó que Spns2 se expresó como una proteína de fusión ~84 kD (58 kD + 26 kD; flecha, Fig 1B.). Para asegurar que el ectópica expresó Spns2 era funcional, que mide si se transporta S1P. datos lipidomics mostraron que el nivel de S1P en el medio de cultivo se incrementó en 5,6 ± 0,55 veces (Fig. 1C), en consonancia con los informes anteriores [29], [31], [32], [33], [34] y confirmar que la Spns2 transfectadas era completamente funcional. Curiosamente, los niveles extracelulares de la esfingosina (SPH) y dihidroesfingosina (dhsph) también se incrementaron en 1,5 y 2,8 veces, respectivamente (Fig. 1C), lo que implica que Spns2 podría transportar estos dos esfingolípidos también. Se ensayaron diferentes especies de ceramida, pero ninguno mostró una diferencia significativa en comparación con el control (Fig. S1 A)
.
A continuación se investigó las funciones celulares de Spns2 en las células A549. imágenes de células vivas mostró que las células Spns2 pasaron por dramáticos cambios morfológicos y separadas de las placas de cultivo celular (flechas en la Fig. 1D), lo que sugiere la muerte celular por apoptosis. Así, inmuno marcado con las células con un anticuerpo de detección activado (escindido) caspasa 3 (Casp3) (Fig. 1E). análisis cuantitativo doble ciego indica que el 34,2 ± 9% de las células fueron positivas Spns2 Casp3 positivo (Fig. 1E y 2A). Esta inducción de Casp3 se confirmó por análisis de transferencia de Western y citometría de flujo; y bloqueada por un inhibidor de la caspasa pan Z-VAD (Figs. 2B, S1B, y S1C). La inducción de la Casp3 fue reproducido mediante la expresión de HA-Spns2 que tiene una etiqueta más pequeña (no mostrado). En línea con la activación Casp 3, el gen survivina anti-apoptosis se redujo significativamente (Fig. 2B) [36], [44]. Apoptosis factor de inducción (AIF) y LC3B escindido también se midieron, pero ninguno se incrementaron por la expresión Spns2 (Fig. 2B), lo que sugiere que Spns2 no induce apoptosis o la autofagia caspasa-independiente.
(A), la cuantificación de células positivas Casp3 mostrados en D. Vehículo (pEGFP) se utilizaron células transfectadas como control (Con). N & gt; 100 células se cuentan a partir de tres experimentos separados. (B), análisis de transferencia Western para marcadores de muerte celular. Las células A549 se transfectaron transitoriamente como en A. Los lisados celulares se recogieron y se transfirieron con los anticuerpos indicados. Se han usado vehículos (pEGFP) las células transfectadas como control negativo y actina se utilizó como control de carga. (C), Imágenes representativas de FLICA tinción de las células Spns2 positivos. células A549 en directo se incubaron con FLICA durante 1 hora 48 horas después de la transfección. Las células fueron fijadas y las imágenes tomadas micrográficos. La barra de escala es de 10 micras. (D), la cuantificación de células positivas FLICA se muestran en C. N & gt; 100 células a partir de tres experimentos separados se contaron doble a ciegas. (E), la expresión Spns2 reduce el número de células viables en células A549. Las células fueron transfectadas como en A. 48 horas después, el número de células vivas relativa se midió mediante un kit de CCK-8 usando un lector de microplacas. N = 4., la expresión Spns2 reducido número de células (F) en células H1299. Vive número de células H1299 se midieron como en I. N = 4. En B, E, H, I, J, barras de error representan SD, *, p & lt; 0,05, **, p & lt; 0,01
a fin de validar que Spns2 indujo la apoptosis, se realizó FLICA (fluorescente inhibidor marcado de las caspasas pan) en ensayos de células vivas. La figura 2C muestra imágenes micrográficas típicos del ensayo. cuantificación doble ciego demostró que el 70 ± 15,9% de las células fueron positivas Spns2 FLICA positivo (Fig. 2D).
Un resultado final de muerte celular es la reducción en el número total de células viables. el recuento de células imparcial usando un lector de microplacas (CCK-8) indicó que la expresión Spns2 resultó en la reducción de 59 ± 1,2% de las células A549 viables en 48 horas (Fig. 2E). Estos resultados se reprodujeron en otra línea celular H1299 NSCLC (Fig. 2F).
En conjunto, los datos anteriores demuestran que la expresión ectópica Spns2 induce la apoptosis dependiente de caspasa en las células NSCLC.
expresión Spns2 modula el metabolismo S1P
Hemos demostrado que la expresión Spns2 transportado S1P exterior de las células (Fig. 1C). Curiosamente, los niveles celulares de S1P, esfingosina, y diferentes especies de ceramida no se alteraron significativamente mediante la expresión Spns2, excepto dhSph y ceramida de cadena larga C20:1were aumentaron aproximadamente 2,0, y 1,4 veces, respectivamente (Fig. 3A y no mostrados).
(A), la expresión Spns2 no alteró el nivel intracelular de S1P. Las células A549 se cambiaron en medios con FBS sin lípidos 24 horas después de la transfección. Otras 24 horas después, se recogieron las células, se lavaron y los niveles de lípidos analizados por lipidomics. (B), la expresión Spns2 condujo a un aumento agudo de la SphK1 en células A549. Las células fueron transfectadas, mRNA recogido, y en tiempo real QRT-PCR realiza para medir SphK1. (C), la expresión Spns2 condujo a un aumento agudo de la SphK2. Las células A549 se trataron como en B, excepto que QRT-PCR realiza para medir SphK2. (D), la expresión Spns2 condujo a la reducción de SGPP1 en células A549. Las células se trataron como en B, excepto que QRT-PCR realiza para medir SGPP1. (E), la expresión Spns2 reduce receptores S1P. Las células se trataron como en B, excepto que QRT-PCR realiza para medir S1P1, S1P2, S1P3 y. N = 3. Las barras de error representan SD. *, P & lt; 0,05, **, p & lt; 0,01. Los datos se normalizaron a GAPDH.
Para delinear su mecanismo metabólico subyacente, se analizaron las enzimas clave en el metabolismo de los esfingolípidos por PCR en tiempo real cuantitativa (qPCR). Tanto SphK1 y mRNA SphK2 fueron significativamente elevados dentro de las 24 horas de la transfección Spns2, y volvieron a los niveles normales a las 48 horas (Figs. 3B y 3C). Aumento de la expresión SphK2 se confirmó mediante análisis de transferencia Western, excepto que su nivel de proteína se mantuvo en un nivel relativamente elevado incluso a las 48 horas después de la transfección Spns2 (Fig. S1D). Esto es razonable ya que las proteínas por lo general tardan más tiempo en degradarse que el ARNm. S1P fosfatasa 1 (SGPP1), la enzima que desfosforila S1P, se redujo drásticamente a 8,5% de nivel de control dentro de las 24 horas, y se mantuvo baja hasta 48 horas después de la transfección (Figs. 3D y S1e). SGPP2 y S1P liasa 1 (SGPL1) no se vieron afectados significativamente por la expresión Spns2 (Figs. S1E-S1F). Estos datos indican que las células alteran los niveles de expresión de múltiples enzimas clave para compensar S1P exportación mediada por la expresión Spns2, incluida la mejora de la generación (aumento de SphKs), así como la conversión de detención (reducción de SGPP1).
expresión Spns2 conduce a la reducción de los receptores de S1P y múltiples vías pro-supervivencia
Como se mencionó anteriormente, S1P es generalmente un factor a favor de la supervivencia. Para entender por qué se indujo la apoptosis cuando la S1P extracelular se incrementó después de Spns2 transfección, se han detectado los niveles de receptores de S1P y se encontró que los niveles de mRNA de los receptores S1P1, S1P2 y S1P3 fueron significativamente regulados hacia abajo después de la expresión Spns2 (Fig. 3E ).
a fin de confirmar esta observación, se determinó la vías descendentes de estos receptores S1P señalización celular. Spns2 expresión dio lugar a reducciones drásticas de fosfato GSK-3β (pGSK-3β, serina 9), tanto en las células A549 y H1299 (Figs. 4A y 4B). Para validar esta observación, que ensayaron activador ascendente de GSK-3β Akt [35], [45]. Las figuras 4A y 4B muestran que los niveles pAkt se redujeron por la expresión Spns2, lo que indica que Spns2 deteriora la vía PI3K /Akt. vía Jak /STAT3, otra vía de señalización corriente abajo de los receptores de S1P, juega un papel crucial en la supervivencia celular, la migración, y la respuesta inmune [46], [47]. Determinamos si Spns2 afecta a esta vía mediante la medición de la actividad de Stat3. Los análisis de transferencia de Western mostró que los (pSTAT3) los niveles de fosfo-STAT3 se redujeron en gran medida por la expresión Spns2 en ambas líneas celulares (Figs. 4A y 4B). Casp3 fue activado por Spns2 en células H1299 lo cual es coherente con los datos obtenidos a partir de células A549 (Fig. 4B). A continuación, inmuno-etiquetados Spns2-EGFP células transfectadas con anticuerpos contra pGSK-3β y pSTAT3 y encontramos que sus señales de fluorescencia se redujeron significativamente en todas las celdas de la misma cultura, ya sean Spns2 positivo o no, si se compara con las células control GFP transfectadas ( con) (Figs. 4C y 4D). Esto es probablemente debido a la acumulación extracelular de los esfingolípidos, tales como Sph. Más interesante, la señal fluorescente para pGSK-3β se redujo aún más en las células Spns2-GFP que las células no transfectadas (flechas en la Fig. 4C). Estos datos confirman que estas vías pro-supervivencia se vieron comprometidas cuando Spns2 se expresó ectópica.
(A), los análisis de Western blot en muestras de células A549. Las células A549 se transfectaron de forma transitoria y lisados recogieron 24 y 48 horas más tarde y se transfirieron con los anticuerpos indicados. pGSK, fosfato GSK-3β; tGSK, el total de GSK-3β; pAkt, fosfo-Akt; pSTAT3, fosfo-STAT3; tStat3, Stat3 totales; Actina se utilizó como control de carga. (B), análisis de Western blot en muestras de células H1299. células H1299 se transfectaron transitoriamente como se mencionó anteriormente. Los lisados celulares se recogieron 48 horas más tarde y se transfirieron con los anticuerpos indicados. (C), escaneo láser confocal de imágenes de células teñidas para pGSK-3β. Las células A549 se transfectaron con Spns2-GFP y cubreobjetos recogieron después de 48 horas. (D), confocal de barrido láser de imágenes de células A549 se tiñeron para pSTAT3. Las células se prepararon como en C.
Spns2 desmontables aumenta el nivel intracelular de S1P
Los datos anteriores demuestran que regula el metabolismo Spns2 S1P y su expresión ectópica conduce a la apoptosis en las células NSCLC. Para diseccionar el papel de Spns2 en LC, derribaron Spns2 de siRNA. Las figuras 5A y 5B muestran que siRNA Spns2i-A nivel de ARNm Spns2 reducido significativamente en más de un 80%. Por lo tanto hemos utilizado Spns2i-A en nuestros estudios adicionales. ARN revueltos (SCR) y Spns2i-C (en adelante CPE), que no suprime la expresión Spns2, se utilizaron como controles negativos.
(A), (B), Caracterización de Spns2 siRNAs. 20 nM de ARNsi Spns2 A, B, y C se transfectaron individualmente en células A549. 48 horas más tarde se recogieron RNA total y RT-PCR (A) y QRT-PCR (B) lleva a cabo para medir Spns2. RNA revueltos (SCR) se utilizó como control negativo. (C), Spns2 caída por-A Spns2i aumentado significativamente el nivel de S1P intracelular. Las células A549 se transfectaron con ARNsi Spns2 como en A, 24 horas después de la transfección, los medios de cultivo de células se cambiaron en medios con FBS sin lípidos. Otras 24 horas después, se recogieron los sedimentos celulares y se analizaron por S1P lipidomics. N = 3. (D), Spns2 knockdown altera los niveles de SGPP1, SGPP2, y SGPL1. Las células A549 se trataron como en A, excepto QRT-PCR se realizó para medir SGPP1, SGPP2, y SGPL1. N = 4. qPCR datos se normalizaron a GAPDH.
Para caracterizar el efecto de la caída en Spns2 metabolismo de los esfingolípidos en las células NSCLC, a fin de determinar los niveles de los esfingolípidos y los de sus enzimas relacionadas. lipidomics datos muestran que Spns2 caída por Spns2i-A aumentó significativamente el nivel de S1P intracelular, mientras que el nivel Sph reducida, en las células A549 en comparación con SCR y SPC (figs. 5C y S2A). Los niveles de las diferentes especies de ceramida no fueron alterados por Spns2 desmontables (Fig. S2B). Esto es coherente con un informe anterior que la deficiencia de S1P en ratones conduce a un mayor nivel de S1P en el pulmón [33]. Con el fin de analizar el mecanismo de aumento de S1P celular, que mide los niveles de enzimas importantes en el metabolismo de S1P. La figura 5D muestra que los niveles de múltiples enzimas fueron alterados después Spns2 caída por Spns2i-A: SGPP1 se incrementó significativamente por 8 veces; SGPP2 se redujo ~ 50%; y SGPL1 se redujo en más de un 80%. Aumento de SGPP1 acelerará conversión S1P para reducir el nivel de S1P celular, que será contrarrestada por la reducción en SGPP2 y el aumento de SGPL1. Sin embargo, SGPL1 se expresó mucho más abundante que SGPP1 en células A549 (22 veces mayor) (Fig. 5D). Esto explica por qué S1P se incrementó después de Spns2 caída. Otras enzimas, tales como SphKs, no se vieron afectados significativamente por la caída Spns2 (Figs. S2C y S2D).
Spns2 caída refuerza el papel células NSCLC migración
Funcionalmente, que examinó por primera Spns2 de caída en la célula la supervivencia /proliferación ya la apoptosis inducida expresión Spns2 ectópico. ensayos de recuento de células vivas encontró que Spns2 caída con Spns2i-A no dio como resultado un aumento significativo en el número de células viables en cualquiera de las células H1299 (no mostrados) A549 o, lo que indica que Spns2 baja regulación no afecta a la supervivencia o la proliferación celular en células de NSCLC.
a continuación, se examinó el papel de Spns2 caída sobre la migración celular desde S1P intracelular es esencial para la migración celular y la motilidad de pulmón [48]. los ensayos de cero cicatrización de la herida se realizaron con células A549 y células H1299. Cuatrocientos micras lagunas se generaron en cultivos confluentes y las imágenes tomadas micrográficos a las 8 y 24 horas después de rascarse. La Figura 6A muestra imágenes típicas del ensayo en las células A549. análisis cuantitativos a doble ciego mostraron que las células de control A549 (SCR) migraron a una velocidad de 8,0 ± 1,5 m /h y 5,4 ± 0,8 m /h para el período de 8 y 24 horas, respectivamente (las células SPC tienen un resultado similar) (Fig. 6B). Sin embargo, desmontables células Spns2 migraron a una velocidad de 14,9 ± 3,1 micras /h y 10,0 ± 0,3 micras /h en el mismo período de tiempo, lo que representa un aumento de 1,86 veces y 1,85, respectivamente (Fig. 6B). Esta observación se repitió en las células H1299 (Fig. 6C).