Extracto
RUNX3 (transcripción relacionados runt factor-3) se ha informado para suprimir la tumorigénesis y metástasis tumoral en diferentes cánceres humanos. En este estudio, hemos utilizado microarrays de tejidos (TMA) para determinar la significación de RUNX3 en progession cáncer de próstata. Nuestros resultados mostraron la expresión ectópica de RUNX3 en tejidos de cáncer de próstata en comparación con los tejidos normales de la próstata tumorales adyacente, y la reducción de la tinción de RUNX3 se correlacionó significativamente con el estadio TNM. Por otra parte, hemos demostrado que la sobreexpresión de RUNX3 inhibe la migración de células de cáncer de próstata y la invasión resultante de la regulación positiva elevada de inhibidor tisular de la metaloproteinasa de matriz 2 (TIMP-2), que inhibe la metaloproteinasa-2 (MMP-2) expresión y la actividad posteriormente in vitro. Golpear abajo de la expresión de RUNX3 rompió el equilibrio de TIMP-2 /MMP-2, mientras que el silencio de TIMP-2 dio como resultado la inhibición de la MMP-2 expresión en células de la próstata. También demostramos que la restauración de RUNX3 disminución de la secreción vascular factor de crecimiento endotelial (VEGF) y suprimió el crecimiento de células endoteliales y formación del tubo. Sorprendentemente, se demostró RUNX3 para inhibir la metástasis tumoral y la angiogénesis in vivo. En conjunto, nuestros resultados apoyan el papel supresor tumoral de RUNX3 en el cáncer de próstata humano, y proporciona una visión de desarrollo de la terapia dirigida para esta enfermedad
Visto:. Chen M, Wang M, Bai J, Liu Q, Y Xi , Li W, et al. (2014) El papel de RUNX3 en la supresión tumoral y la angiogénesis del cáncer de próstata humano. PLoS ONE 9 (1): e86917. doi: 10.1371 /journal.pone.0086917
Editor: Jindan Yu, de la Northwestern University, Estados Unidos de América
Recibido: 14 Agosto, 2013; Aceptado: 16 de diciembre de 2013; Publicado: 24 Enero 2014
Derechos de Autor © 2014 Chen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este proyecto con el apoyo de una beca de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81302207). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es la segunda causa principal de muerte por cáncer entre los hombres en los EE.UU. [1]. La intervención quirúrgica sigue siendo el tratamiento más eficaz para el cáncer de próstata primario, aunque alrededor de 30% de los pacientes de próstata ocurren recaída y /o metástasis de la enfermedad después de las terapias iniciales, lo que resulta en el período de supervivencia relativamente corto (12-15 meses) [2]. La metástasis es un proceso extraordinariamente complejo, incluyendo las células cancerosas migran fuera de los tumores primarios y invaden los tejidos vecinos, intravasate en la sangre o la circulación linfática, sobrevivir en el torrente sanguíneo, y los órganos objetivo específicos para iniciar la extensión metastásica [3]. Es de importancia para comprender mejor la base mecanicista de la metástasis tumoral mediante la identificación de las moléculas clave que participan en este proceso, que proporcionarán conocimientos sobre el desarrollo de las estrategias más eficaces para prevenir la progresión tumoral.
Dominio de la familia
Runt, que consiste en RUNX1, RUNX2 y RUNX3, son reguladores maestros de la expresión génica en la proliferación celular y la diferenciación. proteínas de la familia RUNX contienen el dominio bien conservado con 128 región de aminoácidos (dominio Runt) y forman un complejo estable con PEBP2b /CBFb para ejercer su capacidad de transactivación [4]. Los tres miembros de la familia RUNX desempeñan papeles importantes en los procesos de desarrollo normal y tumotigenesis [5]. proteínas RUNX regulan la expresión de genes celulares mediante su unión a los promotores o potenciadores de genes diana relacionadas con las decisiones del destino celular, que se convierten trastornado en células de cáncer [6].
Entre los tres miembros de la familia RUNX, RUNX3 fue originalmente clonado como AML2 y está localizado en el cromosoma 1p36.1. RUNX3 se informó primero que se correlaciona con la génesis y progresión del cáncer gástrico humano como un supresor de tumores [7]. Además de cáncer gástrico, se ha informado de que se observó la expresión ectópica de RUNX3 en diversos tipos de cáncer incluyendo cáncer de mama, glioma [8], [9]. Análisis de muestras de tejidos clínicos de metástasis peritoneales derivados de los cánceres gástricos proporciona evidencia de que la expresión de RUNX3 disminuyó significativamente en el tejido metastásico, en comparación con la mucosa gástrica normal o tumores principales primarios. ([10]) Es importante destacar que la disminución de la expresión de la proteína RUNX3 es significativamente asociada con una mala supervivencia de cáncer y pacientes de melanoma gástrico [11], [12]. En nuestro estudio anterior, hemos demostrado que RUNX3 puede funcionar como un supresor de tumores mediante la regulación de la migración celular, la invasión y la angiogénesis en el carcinoma de células renales [13]. Estos estudios sugieren un papel central de RUNX3 en la tumorigénesis y progresión. Sin embargo, la función de RUNX3 en cáncer de próstata aún no ha sido bien estudiado.
En este estudio, hemos examinado la expresión de RUNX3 en relación con las características clínico-patológicas utilizando microarrays de tejidos de cáncer de próstata. Se encontró que la pérdida de expresión de RUNX3 correlaciona directamente con el estadio TNM del cáncer de próstata. Además, la restauración de la expresión de RUNX3 condujo a la represión de MMP-2 y la inducción de TIMP-2, que representan, al menos en parte, la supresión de tumopr progresión y la metástasis. Estos resultados son consistentes con el papel de RUNX3 en la regulación de TIMP-2 /MMP-2 en las células normales de la próstata. Además, hemos demostrado que la disminución de la secreción de VEGF inducida por reintroducción RUNX3 inhibe la angiogénesis del cáncer de próstata. Nuestros datos clínicos y mecanicistas indicaron que RUNX3 puede ser un supresor de tumores implicados en la progresión del cáncer de próstata y la orientación de la vía de RUNX3 constituido una modalidad de tratamiento potencial para el cáncer de próstata humano.
Materiales y Métodos
Declaración de ética
Este estudio de microarrays de tejidos se realizó bajo un protocolo aprobado por las Juntas de Revisión Institucional del hospital Afiliado de la universidad médica de Xuzhou y todos los exámenes se realizaron después de obtener su consentimiento informado por escrito.
todos los animales los experimentos se realizaron usando ratones desnudos macho (6-7 semanas de edad). Los ratones fueron adquiridos de Laboratorio Animal SLAC Ltd., Co. (Shanghai, China) y se cuidan de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Todos los animales protocolo experimental fue aprobado por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión de Xuzhou Medical College (IACUC Nº 1201).
Pacientes y muestras
Un cáncer de próstata TMA fue adquirido de Shanghai Xinchao Biotecnología ( Shanghai, China). Los tumores se clasifican de acuerdo a la 2013, revisada sistema TNM de la siguiente manera [14]: 139 casos en estadios I-II y 79 casos con estadios III-IV. Además, incluye 52 casos de tejido de próstata normal adyacente tumor. La matriz de puntos diámetro era de 1,5 mm, y cada punto representa un punto de tejido a partir de una muestra individual que fue seleccionado y patológicamente confirmado.
La inmunohistoquímica
La inmunohistoquímica se realizó tinción como se describe anteriormente [13]. El anticuerpo primario de conejo anti-RUNX3 (1:200) (Médica y Biológica Laboratories, Nagoya, Japón), anti-VIII (1:100), anti-PAP (1:100) (Santa Cruz, CA, EE.UU.) y la se utilizaron biotina anti-ratón IgG (1:200) (Boster Biotech, Wuhan, china). Para la evaluación de tinción TMA, la inmunorreactividad se evaluó a ciegas por dos observadores independientes utilizando microscopía de luz (Olympus BX-51 microscopio de luz), y la imagen se recogió mediante Camedia Maestro cámara digital C-3040. La expresión de RUNX3 se calificó como positivo cuando el 10% de las células tumorales mostró immunopositivity. Las biopsias con células tumorales 10% que muestran la inmunotinción se consideraron negativos [15].
Líneas celulares y transfección
cáncer de próstata humano líneas celulares PC3, DU145 y células de la próstata RWPE-1 se adquirieron de Shanghai Instituto de Bioquímica y Biología celular, Academia de Ciencias de china (Shanghai, china). HUVECs se obtiene a partir de Nanjing Kaiji Biotech. células DU145 se cultivaron en medio F12 suplementado con suero de ternera fetal 10% (FCS). células RWPE-1 se mantuvieron en K-SFM mediun con 10% de FCS. células PC3 y HUVECs se cultivaron en medio RPMI1640 suplementado con 10% FCS. Las células fueron en un incubador humidificado 37 ° C con 95% de aire, 5% de CO
2. La expresión de control de PFLAG y PFLAG-RUNX3 plásmidos se obtuvieron del Dr. Pei-Jung Lu (Universidad Nacional Cheng-Kung, Tainan, Taiwán).
Para la transfección transitoria, transfección del control de PFLAG y PFLAG-RUNX3 plásmidos en células PC3 y DU145 se llevaron a cabo utilizando Lipofectamine 2000 reactivo de transfección (Invitrogen, Shanghai, china) siguiendo el protocolo del fabricante. La transfección de la si-RUNX3, si-TIMP-2 y el control de ARNsi en RWPE-1 células fueron realizadas utilizando el reactivo siLentFect de lípidos (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.). Para la transfección estable, la expresión lentiviral vectores LV5-RUNX3 y LV5-control se obtuvieron a partir de genes de Shanghai Pharma Company (China). Los lentivirus se mezclaron con polibreno (5 mg /ml) y se añadieron a las células DU145 de infección. Los clones positivos se seleccionaron en puromicina (5 mg /ml). Los transfectantes estables RUNX3 se aislaron después de 2 semanas durante la selección.
migración y la invasión de ensayo
La migración celular y la invasión de ensayo se determinaron utilizando un ensayo de migración de cámara de dos modificado con un tamaño de poro de 8 micras . Para el ensayo de la migración, las células 1 × 10
6 PC3 y DU145 se sembraron en medio libre de suero en la cámara superior. Después de 12 h de incubación a 37 ° C, las células en la cámara superior se retiraron cuidadosamente con un hisopo de algodón y las células que habían atravesado la membrana fueron fijadas en metanol, se tiñeron con hematoxilina y se cuentan. Para el ensayo de invasión, las células se sembraron en medio libre de suero en la cámara superior. Después de 24 h de incubación a 37 ° C, las células fueron retirados noinvasive suavemente de la parte superior de la matrigel con un hisopo de algodón. las células invasoras en la parte inferior del Matrigel se fijaron en metanol y se tiñeron con violeta leucocrystal. Para la cuantificación, las células fueron contados bajo un microscopio en cinco campos (arriba, abajo, la mediana, izquierda, derecha. × 200).
Crecimiento y HUVEC Tubo de Ensayo de Formación
transfectadas las células PC3 y DU145 se cultivaron en placa de 6 pocillos con medio completo fresco durante 24 h, se recogió el medio y se centrifugó para eliminar los residuos de células antes de su uso como un medio acondicionado. Para el ensayo de crecimiento celular, 2 × 10
4 HUVECs en suspensión en 100 l de medio condicionado y se sembraron a una densidad de 2 × 10
4 en una placa de cultivo de 96 pocillos y se incubaron durante 24 h. Entonces, la proliferación celular se detectó utilizando recuento de células kit-8 (CCK-8) comprado a Beyotime Instituto de Biotecnología (Shanghai, China). Para el ensayo de formación de tubo, placa de 48 pocillos se recubrió con Matrigel (BD Biosciences, NJ, EE.UU.) y se mantuvo en 37 ° C durante 0,5 h. Luego, 2 × 10
4 HUVECs se suspendieron en 100 l de medio condicionado y aplicados a la placa de 48 pocillos pre-revestido. Después de incubación a 37 ° C durante otras 24 h, se contó y se fotografió el número de tubos similares a capilares a partir de tres campos elegidos al azar bajo un microscopio invertido Nikon (Nikon, Japón).
ELISA para VEGF
células PC3 y DU145 se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos a una densidad de 1 × 10
6 células por pocillo. Luego, las células fueron transfectadas con PFLAG-control y PFLAG-RUNX3 con la privación de suero. Los sobrenadantes se recogieron 24 h después de la transfección. la concentración de VEGF se determinó usando kits Quantikine ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante (AMP R y; D Systems, MN, EE.UU.).
Gelatina Zymography
Dos millones de células fueron sembradas en placa de 100 mm para 24 marido. Se recogieron las proteínas en el medio acondicionado, colocado en 10% de SDS-PAGE que contiene 0,1% de gelatina (Sigma, Shanghai, China). Después de la electroforesis, el gel se incubó en Triton X-100 intercambio de tampón (20 mM Tris-HCl [pH 8,0], NaCl 150 mM, CaCl 5 y 2,5% de Triton X-100) durante 30 min seguido de 10 lavado min con tampón de incubación (mismo tampón sin Triton X-100) durante 3 veces. Gel se incubó en tampón de incubación durante la noche a 37 ° C. Después de la incubación, el gel se tiñó por 0,5% Coomassie Blue R-250 (Sigma, Shanghai, China) durante 1 h, luego teñidas des en 30% de metanol y ácido acético glacial al 10% durante 1 h. Los geles fueron fotografiados y luego quantitatedively medidos por densitometría de barrido.
Cuantitativo PCR en tiempo real
ARNm se purificó a partir de células utilizando el kit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA), y la síntesis de ADNc se realizó con iScript Select cDNA Synthesis Kit (BioRad, Hercules, CA). En tiempo real la amplificación por PCR de TIMP-2, MMP-2 y GAPDH se llevó a cabo durante 20 s a 95 ° C, seguido de 50 ciclos a 95 ° C durante 3 s y recocido a 60 ° C durante 30 s utilizando un ABI PRISM 7500 Sistema de Detección de secuencia (Nueva York, EE.UU.). Los resultados se normalizaron a los de la limpieza gen GAPDH y se expresan como una proporción del porcentaje de genes individuales para el control GAPDH. Las secuencias de cebadores específicos para cada gen son las siguientes: TIMP2 hacia adelante, TCTGGAAACGACATTTATGG; GTTGGAGGCCTGCTTATGGG-3 inversa; TIMP2 hacia adelante, ACTGTTGGTGGGAACTCAGAAG; CAAGGTCAAT GTCAGGAGAGG y GAPDH hacia delante, TGAA GGTCGGAGTCAACGGATT; revertir, CCTGGAAGATGGTGATGGGATT.
Western Blot Analysis
célula o tejido extractos fueron separados en un gel de SDS-poliacrilamida al 10%. Las proteínas se transfirieron a membrana de nitrocelulosa y se incubaron durante la noche a 4 ° C con los siguientes anticuerpos: ratón anti-RUNX3, conejo anti-MMP-9, MMP-2, TIMP-1 y TIMP-2 (Cell Signaling Technology, MA, EE.UU.) y el ratón anti-β-actina (Santa Cruz, CA, EE.UU.). a continuación, las membranas se lavaron y se incubaron con anticuerpo secundario (de cabra anti-conejo y de cabra anti-IgG de ratón) durante 2 h, teñido de fluido coloración que contiene tampón de 10 ml de fosfatasa alcalina y se desarrollaron usando sustrato /color de BCIP NBT (Promega, Madison, EE.UU. ).
en vivo metástasis experimentales Modelos
Dos grupos de 8 ratones desnudos masculinos fueron alojados en las instalaciones de barrera SPF bajo un ciclo de 12 h de luz /oscuridad. Los ratones fueron inyectados a través de la vena de la cola con RUNX3 transfectadas establemente células DU145 (1 × 10
6 células por flanco) en 100 l de PBS. Una aguja de insulina se utilizó para las inyecciones de la vena de la cola. La viabilidad celular se determinó por exclusión con azul de tripano y sólo una sola célula suspensiones & gt; se utilizó el 95% viables. Los ratones fueron sacrificados a las 8 semanas después de la implantación, los pulmones fueron fijadas en 10% dehído formal y hematoxilina y eosina (HE) se tiñeron de nódulos metastásicos.
subcutáneos en experimentos in vivo
Para evaluar tubo formación, se inyectaron dos grupos de 8 ratones desnudos macho con RUNX3 transfectadas establemente células DU145 (1 × 10
6 células por flanco) en 100 l de PBS /Matrigel (50:50) por vía subcutánea. Los animales se controlaron diariamente. El peso corporal de cada ratón se registró y se determinó el volumen del tumor por el calibrador vernier cada día, siguiendo la fórmula de A × B
2 × 0,52, donde A es el diámetro más largo del tumor y B es el diámetro más corto. Los ratones se sacrificaron a las 8 semanas después de la implantación, y los tumores se retiraron quirúrgicamente y se fijaron en 10% dehído formal para histología. Todos los procedimientos experimentales con animales se realizaron de acuerdo con los requisitos éticos institucionales y aprobados por el Comité de Xuzhou Medical College para el Uso y Cuidado de los Animales.
Análisis estadístico
Los datos numéricos se expresan como medias ± SD Se evaluaron las diferencias estadísticas entre las medias para los diferentes grupos con Instat 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA) usando análisis unidireccional de la varianza (ANOVA). Para TMA, análisis estadístico se realizó con el software SPSS 11.5 (SPSS). La asociación entre la tinción RUNX3 y los parámetros clínico de los pacientes con cáncer de próstata, incluyendo la edad, el tamaño del tumor, grado del tumor y el estadio TNM, se evaluó mediante χ
2 test. La importancia de los datos in vivo se determinó mediante la prueba de Mann-Whitney de dos colas. Las diferencias se consideraron estadísticamente diferentes a
P Hotel & lt; 0,05
Resultados
Expresión RUNX3 se reduce en cáncer de próstata humano
En primer lugar, se determinó la expresión de RUNX3 si. se cambia en el cáncer de próstata humano. tinción inmunohistoquímica se realizó en diapositiva TMA contiene tejidos de la próstata tumorales adyacentes normales y tejidos de cáncer de próstata. Las imágenes presentativos se presentan en la Fig. 1A. Nuestros resultados mostraron que había un nivel significativamente inferior de expresión de RUNX3 en los tumores que en el tumor tejidos de la próstata normales adyacentes (
P
& lt; 0,01, Fig 1B.). Estos sugirieron que RUNX3 se expresa comúnmente en el tejido normal de la próstata humana, pero disminuyó o ausente en el tejido de cáncer de próstata.
A inmunohistoquímicos fotografías representativas fueron tomadas a diferentes aumentos en tumores adyacentes normales de tejido de la próstata y de próstata cáncer de los tejidos (Top × paneles 100, panel inferior × 400). B En comparación con la del tejido normal de la próstata tumor adyacente, el nivel de expresión general de RUNX3 en los tejidos de cáncer de próstata fue significativamente menor (
P
& lt; 0,01, χ
2 test). C disminución de la expresión de RUNX3 se correlacionó con el estadio TNM (
P Hotel & lt; 0,01, χ
2 test, comparando I-II frente III-IV).
Pérdida de RUNX3 la expresión en el cáncer de próstata se asocia con tumor en estadio
en los 218 pacientes con cáncer de próstata, la relación entre la expresión de RUNX3 y características patológicas y clínicas se muestra en la Tabla 1. la edad media (dE) de los pacientes fue de 58,7 años ( mediana, 66,5 años; rango, 37-87 años). Debido a que el estadio TNM es un marcador pronóstico importante para los pacientes con cáncer de próstata, se detectó la expresión de RUNX3 en 139 categorías de tejidos de cáncer de próstata en estadio inicial (I-II) y en el 79 de la última etapa (III-IV). Encontramos tinción RUNX3 se redujo dramáticamente en las últimas etapas en comparación con las primeras etapas I-II (
P
. & Lt; 0,01, Fig 1C). Sin embargo, no hemos encontrado una correlación significativa entre la expresión de RUNX3 con otras variables clínico-patológicas, incluyendo la edad, el tamaño del tumor y el grado tumoral.
Restauración de Expresión RUNX3 inhibido células del cáncer de próstata migración y la invasión in vitro
Dado que la expresión de RUNX3 está relacionada con el estadio TNM con cáncer de próstata, RUNX3 puede jugar un papel importante en una o más etapas de la metástasis del cáncer de próstata. En primer lugar, examinamos el efecto de la reintroducción de RUNX3 en la migración de células de cáncer de próstata y la invasión. Estamos transfectadas transitoriamente células PC3 y DU145 con PFLAG-control y plásmidos PFLAG-RUNX3. Veinticuatro horas después de la transfección, la proteína se sobreexpresa significativamente en células cancerosas (Fig. 2A y B). Las células transfectadas se sometieron a la celda ensayo de migración y la invasión de ensayo. En ensayo de migración de células, se encontró que la restauración RUNX3 en las células PC3 y DU145 disminución de la capacidad de migrar a través de la cámara de Boyden por 55% y 63%, respectivamente (Fig 2C y D). (
P
& lt; 0,05) . En ensayo de invasión de células, las células transfectadas mostraron RUNX3 potencia significativamente menor invasivo que el control, con las células invasoras en un 57% y un 82% en las células PC3 y DU145, respectivamente (Fig. 2E y F) (
P & lt
; 0,05). Sin embargo, la restauración de RUNX3 no tuvo efecto sobre la proliferación de células de cáncer de próstata (datos no mostrados)
.
A y B Veinticuatro horas después de la transfección, la expresión de RUNX3 en células PC3 y DU145 se evaluó mediante Western mancha. β-actina se utilizó como control interno. ensayo de migración de la célula C y D. campos representativos de células migratorias en la membrana (aumentos, × 200). el número de células de migración promedio por campo. ensayos de invasión de células E y F Matrigel. Imágenes representativas muestran las células que invadieron a través de la Matrigel cuando se transfectaron con el plásmido RUNX3 o control. histograph Representante de las células tumorales invadidos se muestra y el número de células tumorales invadidos cuantificado. * Indica una diferencia significativa entre los controles (*
P Hotel & lt; 0,05, ANOVA) guía empresas
capacidad invasiva de las células cancerosas puede ser regulada por las MMP.. Para estudiar el posible papel de MMPs en la inhibición inducida por RUNX3 de la invasión de células, se realizó zimografía de gelatina para medir las MMP-2 y MMP-9 actividades. La actividad de la enzima MMP-2 se suprimió después de la expresión forzada de RUNX3 en células PC3 y DU145 (Fig. 3A). Western blot se utilizó para examinar las TIMP-1, TIMP-2, MMP-2 y MMP-9 expresiones en células de cáncer de próstata. Nuestros resultados muestran que la inhibición de MMP-2 nivel de proteína se debe a la mayor expresión de TIMP-2 después de la sobreexpresión de RUNX3 en ambas líneas celulares (Fig. 3B). Con el fin de confirmar el papel de RUNX3 en la regulación de TIMP-2 /MMP-2, se utilizó célula normal de la próstata RWPE-1 en nuestro estudio y nuestros datos muestran que derribo de expresión RUNX3 rompió el equilibrio de TIMP-2 /MMP -2 (Fig. 3C), mientras que el silencio de TIMP-2 dio como resultado la inhibición de la MMP-2 mRNA y expresión de proteínas en células de la próstata (Fig. 3D y e). Estos resultados demostraron que RUNX3 estaba involucrado en la regulación de TIMP-2 /MMP-2.
La actividad de MMP-2 y MMP-9 fueron evaluados por zimografía de gelatina. El análisis de transferencia Western B de los niveles de proteína relativos de MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2 y β-actina en RUNX3 re-expresión y el grupo de control tanto para las líneas celulares DU145 PC3 y. C Western blot para la expresión de la proteína de MMP-2, TIMP-2 y β-actina en el corte en lonchas RUNX3 y grupo de control para RWPE-1 línea celular. D Western blot para la MMP-2 y β-actina de expresión después de tumbar de TIMP-2. E PCR en tiempo real para la MMP-2 mRNA expresión después de tumbar de TIMP-2. Los datos se muestran como media ± S.D. *
P
. & Lt; 0,05
Restauración de Expresión RUNX3 reducido angiogénesis in vitro
A fin de determinar el efecto de la expresión de RUNX3 restaurado en el potencial angiogénico de próstata humana células de cáncer, los potenciales angiogénicos del sobrenadante de las células PC3 y DU145 transfectadas con PFLAG-control o PFLAG-RUNX3 se determinaron por el ensayo de proliferación de células endoteliales y ensayo de formación de tubo. En el ensayo de proliferación celular, se encontró que el medio acondicionado a partir de células PC3 y DU145 transfectadas con PFLAG-RUNX3 inhibió la proliferación de las células endoteliales en comparación con los de las células control (Fig. 4A y B). En el ensayo de formación de tubo, el grado de formación del tubo se evaluó como el porcentaje de área de la superficie de células frente a área de superficie total. Como se muestra en la Figura 4C y D, el número medio de estructuras tubulares completos formados por HUVECs se redujo significativamente en medio condicionado de RUNX3 sobre-expresión de las células PC3 y DU145 en comparación con los controles de vector (
P
& lt; 0,05).
a y B ensayo de proliferación celular CCK-8 se realizó para detectar la proliferación de HUVECs. C y D representativos fotos fueron tomadas in situ para la formación de tubos en el sobrenadante de las células PC3 y DU145 transducidas con PFLAG-control y PFLAG-RUNX3. Todos los experimentos se llevaron a cabo por triplicado. E ELISA para la secreción de VEGF en las células PC3 y DU145 transducidas con PFLAG-control y PFLAG-RUNX3. Los datos se muestran como media ± S.D. *
P
. & Lt; 0,05
El VEGF es un importante factor mitógeno y la supervivencia de las células endoteliales. En respuesta a la estimulación angiogénica, las células endoteliales entran en un estado de proliferación activa. Para evaluar el mecanismo de la angiogénesis RUNX3 regulación, ELISA se realizó para detectar VEGF secretada en el medio de cultivo acondicionado de células de cáncer de próstata. Como se muestra en la Fig. 4E, se observó una reducción significativa en la secreción de VEGF en el medio condicionado de células PC3 y DU145 transfectadas con PFLAG-RUNX3 en comparación con las células control (
P Hotel & lt; 0,05).
Restauración de Expresión RUNX3 inhibida la metástasis in vivo
Debido a que la expresión de RUNX3 disminuyó migración de células tumorales y la invasión in vitro, se utilizó un ensayo de metástasis vena de la cola para analizar los efectos in vivo de la expresión de RUNX3 de la potencia metastásico de las células DU145. En comparación con las células de control infectadas con el vector de virus vacío, HE tinción mostró que la inyección vena de la cola de células establemente infectadas con LV5-RUNX3 en ratones desnudos atímicos dio lugar a un número significativamente menor número de nódulos en el pulmón (Fig. 5A y B). Para confirmar aún más esta metástasis a distancia, se realizó inmunohistoquímica para detectar marcadores críticos de cáncer de próstata. antígeno prostático específico (PSA) y fosfatasa ácida prostática (PAP) se consideran marcadores críticos para el diagnóstico de cáncer de próstata [16]. Sin embargo, PSA no se expresa en las células DU145 [17]. Por lo tanto, hemos utilizado PAP en nuestro estudio para investigar el origen de los nodos de tumor en el pulmón. Como se muestra en la Fig. 5C, PAP positivo en el tejido pulmonar indicó que la metástasis a distancia en el modelo animal fue de las células DU145, que fueron inyectados desde el recipiente de cola. Estos resultados mostraron los notables efectos inhibidores de RUNX3 en la metástasis pulmonar de las células de cáncer de próstata
.
A los ratones fueron inyectados con fueron inyectados vía vena de la cola con las células DU145 transfectadas con los plásmidos de expresión indicados. Grupos contenían 8 ratones. Ocho semanas después, los ratones fueron sacrificados y la metástasis pulmonar de las células DU145 se midió por macroscópica después de la autopsia. El análisis histológico de las lesiones metastásicas en las costillas de ratones desnudos se realizó mediante tinción con HE. B La cuantificación de los nódulos en el pulmón con niveles alterados RUNX3. El número de nódulos se evaluaron a ciegas en 5 campos al azar por cada implante a 200 aumentos. Los datos se muestran como media ± S.D. *
P Hotel & lt; 0,05. C Representante fotografías de inmunohistoquímica de la expresión de PAP en el tejido pulmonar (aumentos, × × 200 y 400). * El tejido tumoral.
Restauración de Expresión RUNX3 Suprimida Tumorigénesis in vivo
Para investigar el efecto del tratamiento RUNX3 en el crecimiento del tumor in vivo, se estableció un tumor subcutáneo en ratones desnudos. Higo. 6A mostró que la proteína RUNX3 estaba sobreexpresado de forma estable después de infectarse con LV5-RUNX3. Los tumores en los ratones infectados de forma estable con LV5-RUNX3 habían sufrido una detención del crecimiento significativo en comparación con los controles (
P Hotel & lt; 0,05). Una fotografía representativo que muestra el crecimiento tumoral en el control y RUNX3 expresó ratones (Fig. 6B).
A ratones desnudos fueron inyectados por vía subcutánea con células DU145 expresan de forma estable LV5-RUNX3 o LV5-Control. Western blot se utilizó para examinar el nivel de proteína RUNX3. B Los tumores fueron monitoreados durante un total de ocho semanas. diámetro del tumor se midió con un calibrador cada semana, y el volumen del tumor se calculó según la fórmula de A × B
2 × 0,52, donde A es el diámetro más largo del tumor y B es el diámetro más corto. El volumen del tumor fue significativamente mayor a las 8 semanas en los ratones que recibieron los lentivirus de control en comparación con los lentivirus RUNX3 dadas (*
P Hotel & lt; 0,05). C ratones portadores de tumores representativos tratados con el grupo de control en comparación con el grupo de RUNX3. D Los niveles de expresión de RUNX3 y VIII se analizaron en los tejidos tumorales mediante inmunohistoquímica con imágenes representativas mostraron (aumentos, × 400). E La cuantificación de la formación de microvasos en los tumores con niveles alterados RUNX3. MVD se evaluó a través de recuento buque. El número de microvasos manchadas fueron evaluados a ciegas en 5 campos al azar por implante en 200 × aumentos. * Indica una diferencia significativa entre los controles (
P Hotel & lt; 0,05).
Para examinar si la supresión del crecimiento del tumor se asocia con el efecto de RUNX3 inyectado células transfectadas de forma estable, la tumores se diseccionaron para examinar la expresión de RUNX3 mediante análisis inmunohistoquímico. Como se muestra en la Fig. 6C, la proteína RUNX3 se overexpressesed en xenoinjerto de RUNX3 de inyección en comparación con la expresión de RUNX3 bajo en el grupo de control. Estos resultados refuerzan aún más el efecto significativo de la supresión de RUNX3 en el crecimiento del cáncer de próstata.
Restauración de Expresión RUNX3 reducido angiogénesis in vivo
Desde RUNX3 no afectó a la proliferación de células tumorales in vitro, es probable que RUNX3 suprime la tumorigénesis in vivo a través de bloqueo de VEGF en las células endoteliales (angiogénesis). por tanto, hemos probado el efecto de RUNX3 en la angiogénesis. células DU145 expresan de forma estable vectores de RUNX3 o de control se mezclaron con Matrigel y se inyectan en ambos flancos de los ratones desnudos. Los ratones se sacrificaron 56 días después de la implantación. El número de microvasos VIII-positivos fue mucho menor en las secciones de xenoinjertos de células DU145 RUNX3 que expresan (Fig. 6C y D), lo que indica que RUNX3 atenúa la angiogénesis del cáncer de próstata de células que inducen. Los resultados sugieren que la alteración del crecimiento tumoral y metástasis mediante la expresión RUNX3 restaurado se correlacionó con la angiogénesis alterada.
Discusión
El papel de RUNX3 en la tumorigénesis se ha estudiado ampliamente en los últimos años. Los informes anteriores han demostrado que la expresión de RUNX3 se redujo en numerosos tipos de cánceres humanos, tales como cáncer de mama, cáncer colorrectal, carcinoma de células renales, melanoma [8], [11], [13], [18]. No ha habido pruebas de que la metilación de RUNX3 era especialmente frecuente en diferentes cohortes de los cánceres de próstata, pero no en mucosa normal de próstata [19], [20]. Estas observaciones sugieren un papel importante para RUNX3 en los cánceres humanos, incluyendo el cáncer de próstata. Sin embargo, la función de RUNX3 en el cáncer de próstata no se ha examinado. Para comprender mejor la función exacta de RUNX3 en el desarrollo del cáncer de próstata, se utilizó la tecnología TMA, modelo celular in vitro e in vivo en modelos animales para investigar el papel de RUNX3 en el cáncer de próstata. Nuestros resultados clínicos mostraron que RUNX3 se perdió en el cáncer de próstata y se correlacionó con el estadio TNM. Nuestros estudios in vitro revelaron que RUNX3 en células de cáncer de próstata reduce la migración celular, la invasión y la angiogénesis capacidades, que era consistente con la función de RUNX3 in vivo.
La resección quirúrgica es la estrategia más popularmente usado en el tratamiento con el primario cáncer de próstata [2]. Sin embargo, para los pacientes con las enfermedades avanzadas, la intervención quirúrgica puede mostrar menor benifits [21]. Por lo tanto, es esencial para predecir el riesgo de recurrencia para minimizar los efectos adversos y maximizar el efecto terapéutico del tratamiento del cáncer de próstata. Sin embargo, de los factores pronósticos disponibles para el cáncer de próstata, el más importante es la etapa de la Unión Internacional Contra el Cáncer TNM según lo determinado por la profundidad de la invasión, la implicación de los ganglios linfáticos y la presencia de metástasis a distancia [14]. En este estudio, se encontró que la expresión de RUNX3 se perdió en el tejido de cáncer de próstata. Por otra parte, la proteína RUNX3 se redujo significativamente en la fase crónica (Fig. 1). Nuestra evidencia clínica apoya claramente la noción de que la expresión alterada de RUNX3 contribuye al desarrollo del cáncer de próstata y metástasis. Se ha informado de que la expresión reducida de RUNX3 fue causada frecuentemente por la isla CpG hipermetilación [19]. Por otra parte, se observaron mutaciones puntuales de RUNX3 en los cánceres gástricos y de vejiga [22], [23].