Extracto
La invasión tumoral y metástasis representan una compleja serie de eventos moleculares que augura un mal pronóstico. La contribución de las vías inflamatorias que median este proceso no se entiende bien. receptores Nod-como (NLRs) de la función de la inmunidad innata como sensores intracelulares de motivos de patógenos y moléculas peligro. Proponemos un papel de NLRs en la vigilancia del tumor y en los linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) de programación. En este estudio, hemos examinado la corriente abajo serina /treonina y tirosina quinasa Rip2 en un modelo murino de cáncer de vejiga. En ratones C57BL6 Rip2 deficientes, los tumores más grandes MB49 ortotópico desarrollan con más numerosos y mayor incidencia de metástasis en comparación con los controles de tipo salvaje. Como tal aumento de la infiltración, tumor de CD11b
+ Gr1
hi se observaron células supresoras de origen mieloide (MDSCs) con disminución concomitante en las células T y las células NK en animales tumorales Rip2 deficientes teniendo utilizando modelos de tumor ortotópico y subcutánea. RIP2 tumores deficientes mostraron una mayor epitelio-mesenquimal transición, con elevada expresión de
ZEB1
,
ZEB2
,
giro, y
Hoteles en caracol el microambiente tumoral. Se encontró que la ausencia de Rip2 juega un papel intrínseco en fomentar el desarrollo de MDSCs granulocítica por un efecto paracrino y autocrino de granulocitos factor estimulante de colonias de expresión (G-CSF). Nuestros hallazgos sugieren que las vías de NLR puede ser una nueva modalidad para programar los TIL y metástasis tumorales influencia
Visto:. Zhang H, Chin AI (2014) Papel de Rip2 en el desarrollo de un tumor infiltrante-MDSCs y cáncer de vejiga metástasis. PLoS ONE 9 (4): e94793. doi: 10.1371 /journal.pone.0094793
Editor: Rajeev Samant, Universidad de Alabama en Birmingham, Estados Unidos de América
Recibido: 19 Noviembre 2013; Aceptado: March 20, 2014; Publicado: 14 de abril 2014
Derechos de Autor © 2014 Zhang, Chin. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Asociación Americana Premio desarrollo de la carrera de Investigación del cáncer de 10.20.14, Broad Stem Cell Research Center eruditos en el Programa de Medicina traslacional, Premio al Desarrollo de impedir que el cáncer Carrera del Investigador, Becton Dickinson Biosciences Beca de Investigación (AI Chin) & amp; Fundación Perkins. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el contexto del microambiente del tumor inmune puede ser predictivo de la etapa del tumor, la supervivencia específica del cáncer, así como la respuesta a la quimioterapia [1] - [3]. En ciertas enfermedades malignas, la presencia de infiltración de CD8
+ linfocitos T se correlaciona con la mejora de los resultados, mientras que la infiltración de células B, CD4
+ linfocitos T, y los reguladores negativos que incluyen células de origen mieloide de supresión (MDSCs) y células T reguladoras ( Tregs) se correlaciona negativamente con la supervivencia [4]. Estas observaciones ponen de relieve la importancia en la definición de las vías esenciales para la programación de la composición de los linfocitos infiltrantes de tumor (TIL), como la modulación selectiva del microambiente del tumor inmune representa una modalidad terapéutica emergente.
receptores de reconocimiento de patrones, como el Toll prototípico como receptor de la familia (TLR) e intracelulares motivos de nucleótidos vinculante dominio de oligomerización (NOD) -al igual que los receptores (NLR) de la familia reconocen conserva en los patógenos, así como moléculas endógenas liberadas por las células dañadas [5]. La activación de estas vías de señalización inicia respuestas inmunes innata y adaptativa, y puede promover la reparación y regeneración de tejidos. Nosotros previamente implicados TLR3 en un modelo murino de la vigilancia del tumor de cáncer de próstata crítico en la programación de la infiltración de linfocitos T y células NK, mientras que la supresión de la expansión de Treg [6]. En el cáncer de vejiga, la eficacia de la modulación inmune se pone de relieve por el uso de Bacillus Calmette Guerin intravesical, que promueve una afluencia de macrófagos y neutrófilos en el microambiente tumoral mediada en parte por TLR2 y 4 [7], [8].
proteína del receptor de interacción 2 (Rip2), una serina-treonina y tirosina quinasa aguas abajo y común a Nod1 y Nod2, activa los factores de transcripción tales como NF-kappa B y MAP quinasas a través de su actividad de quinasa, así como a través del reclutamiento de E3 ubiquitina ligasa [9] - [14]. RIP2 vías dependientes han surgido como crítica en la detección de diversos patógenos que van desde
Listeria monocytogenes
,
Staphylococcus aureus
, y
Legionella pneumophila
a
Escherichia coli
así como en la mediación de trastornos inflamatorios tales como la encefalomielitis autoinmune [15] - [17]. Además, los polimorfismos de Nod2 se han relacionado con la susceptibilidad a la enfermedad de Crohn, mientras que los polimorfismos de Rip2 se han relacionado con el lupus eritematoso sistémico [18], [19]. La capacidad de NLRs para mediar vigilancia tumor no se ha investigado hasta la fecha. Aquí, postulamos que Rip2 puede mediar la vigilancia del cáncer de vejiga y explorar su papel utilizando un modelo de cáncer de vejiga ortotópico murino y subcutánea. Se demuestra que los ratones portadores de tumores sesgos Rip2 con deficiencia de diferenciación mieloide hacia el linaje MDSC y desempeña un papel intrínseco en el desarrollo de la CD11b
+ Ly6G
+ Ly6C
lo granulocítica población MDSC. Nuestros resultados son los primeros en implicar a Rip2 y NLRs en la vigilancia del tumor y su importancia en la programación del microambiente del tumor inmune. La vía NLR puede representar una oportunidad terapéutica en la modulación de la inmunidad del cáncer para evitar la invasión tumoral y la metástasis.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Todo el trabajo con animales se ha llevado a cabo de conformidad con la política de Servicio de Salud Pública del cuidado humano y uso de Animales de laboratorio y Reglamento de la Ley de Bienestar Animal del USDA a través de un UCLA Institucional Cuidado de Animales y el empleo del protocolo#2010-023-11C aprobado.
Ratones
ratones deficientes en RIP2 backcrossed a un /6 antecedentes C57Bl durante 10 generaciones se genotipo como se describe anteriormente [10]. C57BL /6 ratones emparejados por edad (Jackson Laboratories) se utilizaron como controles. De seis a viejos ratones hembra de 8 semanas fueron utilizados para los experimentos. Los animales fueron alojados en condiciones libres de patógenos de acuerdo con los protocolos del Comité de Investigación Animal de la UCLA.
Cultivo de células
MB49 líneas celulares (regalo de Tim Ratliff) se derivaron de los carcinomas de células uroteliales inducidos por carcinógenos en C57Bl6 ratones y se mantuvo a 37 ° C con 5% de CO
2 en DMEM (Cellgro), suplementado con 10% FBS (Omega Scientific) y 1% de penicilina y estreptomicina [20].
modelos de tumores
para la implantación del tumor intravesical, se sedaron los ratones hembra, sondaje con un catéter de calibre 24 (BD Biosciences), y infundido con 10 g de poli-L-lisina (Sigma) en 100 l durante 30 minutos antes del drenaje y de la instilación de 2 × 10
6 MB49 células en 100 l durante 60 minutos [21], [22]. Los ratones fueron sacrificados 12 días después de la inoculación del tumor, y la vejiga y los órganos internos se examinaron. Vejiga, pulmones y los riñones fueron fijadas en formalina o embebidos en OCT para la tinción de H & amp; E o inmunofluorescencia [23]. Las metástasis pulmonares y renales se determinaron groseramente y por microscopía de luz de H & amp; E secciones en una sola sección transversal coronal representativa. Por retos de tumores subcutáneos, 5 × 10
5 MB49 células fueron implantadas subcutáneamente en los flancos de ratones con el crecimiento del tumor monitoreados cada dos días. Tras el sacrificio de los ratones 14 días después de la inoculación del tumor, se recogieron los tumores, se pesaron, y se disociaron para el análisis.
inmunofluorescencia e inmunohistoquímica
inmunofluorescencia se realizó en secciones de tejido congelado incrustados-OCT. Las secciones se bloquearon con 10% de suero de cabra y 10% de BSA en PBS durante 1 hora a RT, se incubaron con el anticuerpo primario durante la noche a 4 ° C, después se lavaron y se incubaron con Al-448 o Al-466 de cabra anti-rata anticuerpo secundario (Invitrogen ) a una dilución 1:800. La inmunohistoquímica se realizó en secciones de tumores incluidas en parafina fijadas con formalina. Las secciones fueron sujetos a antígeno climatizada solución desenmascaramiento durante 30 minutos, se inactivó en 0,3% de dióxido de hidrógeno en PBS durante 15 minutos, se bloquearon con 10% de suero de cabra y 10% de BSA en PBS durante 1 hora a RT, a continuación se incubaron con el anticuerpo primario durante la noche a 4 ° C, se incubaron con biotina de cabra anti-rata de anticuerpo secundario a una dilución 1:800 durante 30 minutos a RT, y se desarrolló usando el kit ABC (vector Labs). Las diapositivas se counterstained con hematoxilina. Las secciones fueron montadas con Vectorshield y analizadas por fluorescencia o microscopía de luz (Zeiss). Los anticuerpos incluyen CD11b (M1 /70, R & amp; D Systems), CD4 (RM4-5, Biolegend), CD8 (53,6-7, R & amp; D Systems), CD49b (DX-5, Biolegend), Foxp3 (fjk-16, eBioscience), Ly6G (RB6-BC5, eBioscience), Ly6C (AL-21, BD Biosciences), e-cadherina (MAB7481, R & amp; D Systems), N-cadherina (H-63, Santa Cruz de Biotecnología), y fosfo I? B? (Ser 32/36,#9246, Cell Signaling).
array de citoquinas
se realizó una serie de citoquinas inflamatorias comparación de suero de tipo salvaje y ratones deficientes en Rip2 implantados con células MB49 intravesical como se describe (ARY006, R & amp; D Systems).
citometría de flujo análisis
sola célula suspensiones preparadas a partir de bazos, disociaron las células tumorales, o células de médula ósea diferenciados fueron analizadas por citometría de flujo. Los anticuerpos, incluyendo CD4 (RM-4), CD8 (53 a 67), NK1.1 (pk-136), B220 (RA3-6B2), CD11b (M1 /70), CD45.2 (104), Gr1 (RB6- 8C5), Ly-6G (1A8), y Ly-6C (AL21) se obtuvieron de BD Biosciences. La adquisición de datos se realizó en un FACS LSRII (BD Biosciences) y se analizó usando FlowJo.
médula ósea derivada de la diferenciación mieloide
células derivadas-BM fueron obtenidos por el lavado de fémures y tibia de ratones C57BL /6 de tipo salvaje y RIP2
- /- ratones. Después de la lisis de las células rojas de la sangre con tampón ACK, las células restantes se cultivaron en DMEM suplementado con FBS 10% y 20% L929 medio condicionado por células. Después de la incubación durante 24 horas, se recogieron y se colocaron en placas a células no adherentes 2 × 10
5 células /ml en DMEM suplementado con suero de ternera fetal al 10%, 50 mM 2-mercaptoetanol, HEPES 10 mM, piruvato de sodio 1 mM, 1% de penicilina y estreptomicina, y se completará en utilizar el 20% de L929 con 40 ng /ml de G-CSF (Biolegend), 40 ng /ml de GM-CSF (Invitrogen), o en combinación. Los cultivos se incubaron a 37 ° C con 5% de CO
2 durante 3 días. En el día 3, se añadió medio fresco con citoquinas apropiadas. En el día se cosecharon 4 células cultivadas por FACS.
El aislamiento de las células inmunes infiltrantes de tumor
El tejido tumoral se picó en PBS con tijeras estériles en pedazos de aproximadamente 1 mm y se digiere en el 0,25% de colagenasa IV en DMEM suplementado con 10% FBS a 37 ° C con 5% de CO
2 durante 3 horas [24]. Las suspensiones celulares se filtran a través de un filtro de 70 micras de células, se sometieron a tampón ACK durante 5 minutos en hielo, y después se filtró a través de un filtro de células de 20 mM para citometría de flujo. Las células clasificadas utilizando un Aria FACS (BD Biosciences) en CD45
+ CD11b
+ Gr1
hola, CD45
+ CD11b
+ GR1
Lo y CD45
- fracciones fueron recogidos por qPCR.
RT-PCR cuantitativa
El ARN total extraído de células clasificadas y tumor de vejiga fresco congelado como se describe (RNeasy Mini Kit, Qiagen) fue utilizado para sintetizar cDNA utilizando ADNc de alta capacidad Kits de transcripción reversa (Applied Biosystems). la expresión génica relativa se determinó utilizando SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). A Bio-Rad iCycler se utilizó para analizar las muestras, mientras que se utilizó el método de ciclo umbral comparativo para calcular la expresión de genes normalizado a GAPDH como una referencia de genes. Se utilizaron los cebadores juegos para los siguientes genes: Arginase-1, 5'-AGAGATACTTCCAACTGCCAGACT, 3'-ACCTGGCCTTTGTTGATGTCCCTA; iNOS, 5'-GCTGGAAGCCACTGACACTTCG, 3'-CGAGATGGTCAGGGTCCCCT; IL-4, 5'-GTCATCCTGCTCTTCTTTC, 3 'ATGGCGTCCCTTCTCCTGT; IL-10, 5'-GCTCTTACTGACTGGCATGAG, 3'-CGCAGCTCTAGGAGCATGTG; IL-12 p40, 5'-TGGTTTGCCATCGTTTTGCTG, 3'- ACAGGTGAGGTTCACTGTTT; IFN, 5'-GGATGCATTCATGAGTATTGC, 3'- CCTTTTCCGCTTCCTGAGG; M-CSF, 5'-AGGACCTGTTGGAGTTCCCTC, 3'- TTTCGCCCTCACACTTGATGA; G-CSF, 5'-CTCAACTTTCTGCCCAGAGG, 3'- AGCTGGCTTAGGCACTGTGT; GM-CSF, 5'-GCCATCAAAGAAGCCCTGAA, 3'- GCGGGTCTGCACACATGTTA; ZEB1, 5'-AACGGAGATTTGTCTCCCAGT, 3'-CTGTCCAGCTTGCATCTTTTC; Zeb2, 5'-TAGCCGGTCCAGAAGAAATG, 3'-GGCCATCTCTTTCCTCCAGT; Caracol, 5'-GCGGAAGATCTTCAACTGCAAATATTGTAAC, 3'-GCAGTGGGAGCAGGAGAATGGCTTCTCAC; Twist, 5'-CGGGTCATGGCTAACGTG, 3'-CAGCTTGCCATCTTGGAGTC; y GAPDH, 5'-GACCCCTTCATTGACCTCAAC, 3'-CTTCTCCATGGTGGTGAAGA.
Resultados
Para investigar el papel de Rip2 en la vigilancia tumoral, desafiamos de tipo salvaje y ratones deficientes en Rip2 con células singénicas MB49 en un modelo ortotópico de cáncer de vejiga. Se observó un aumento de casi dos veces en el peso del tumor en ausencia de Rip2 (Fig 1A). Los tumores recogidos de ratones de ambos genotipos demostraron evidencia de invasión en el músculo detrusor por H & amp; E tinción con microscopía de luz con tumores más grandes vistos en Rip2 con deficiencia de los animales (Figura 1B). El examen macroscópico e histológico de los órganos internos reveló un mayor número de metástasis en los pulmones y riñones de los ratones deficientes en Rip2 en una de aproximadamente tres veces y dos veces mayor incidencia, respectivamente, sobre los controles de tipo salvaje (Fig 1C-D). No se observaron otras metástasis brutos incluidos en el hígado
Rip2
+ /+ y Rip2
-. /- ratones por vía intravesical implantados con células MB49 y sacrificados a los 12 días fueron evaluados para tumor de vejiga (A ) de peso, (B) la histología con H & amp; e tinción de x5 y x20 aumentos. C, Los pulmones fueron examinados para la metástasis al número de lesiones metastásicas por sección transversal coronal% de incidencia, histología con H & amp; E tinción en x10 y x40 aumentos, y el examen macroscópico. D, los riñones fueron examinados para la metástasis al número de lesiones metastásicas por sección coronal cruz,% de incidencia, y la histología con H & amp; E tinción y magnificación al x5 x20. se muestran ejemplos representativos. Columnas, con una media de 33 Rip2
+ /+ y 19 Rip2
- /- ratones reunidos a partir de 5 experimentos independientes; bares, SEM. Todos los
p valores
se determinaron por
t
de Student de dos colas, con significación estadística se define como P & lt; 0,05
Hemos implicado previamente Rip2 en el desarrollo. de Th1 y células NK [10], mientras que otros informaron de un papel en la infiltración de células dendríticas [17]. Para investigar el papel de Rip2 en el contexto de la tumorigénesis, tumor de vejiga TIL se examinaron por inmunofluorescencia e inmunohistoquímica. Esto puso de manifiesto disminución de la infiltración de células CD8
+ linfocitos T, CD4
+ linfocitos T, y células NK en ausencia de Rip2 como se predijo. El examen de Foxp3
+ células representante de las células T reguladoras, mostró una tendencia creciente en los ratones deficientes en Rip2 comparación con los ratones de tipo salvaje, aunque no alcanzó significación estadística. Curiosamente, los tumores mostraron aumento de la infiltración de CD11b
+ células mieloides en Rip2 deficientes en comparación con los ratones de tipo salvaje, mientras que la caracterización adicional de esta población mieloide mostró un aumento previsto de los macrófagos marcador F4 /80 y en el subtipo Gr-1 Ly6G, pero no el subtipo Ly6C en los tumores de los ratones deficientes en Rip2 (Fig 2).
La infiltración de CD8, CD4, NK, CD11b, F4 /80, Ly6G, y Ly6C células que expresan tal como se indica, se examinaron por inmunofluorescencia, y Foxp3 por inmunohistoquímica en tumores de vejiga de Rip2
+ /+ y Rip2
- /- ratones por vía intravesical implantados con las células MB49 y se sacrificaron a los 12 días. paneles de la izquierda muestran la tinción de anticuerpos específicos, panel central muestra la tinción DAPI, el panel derecho muestra la fusión de anticuerpo y las manchas DAPI. Los ejemplos representativos de cada grupo de cuatro a seis ratones en 4 experimentos independientes se muestran con una ampliación x40. Los gráficos de barras enumeran número medio de células por campo x40 de 3 secciones representativas de los grupos de cuatro ratones; bares, Dakota del Sur. Todos los
p valores
se determinaron por
t
de Student de dos colas, con significación estadística se define como p. & Lt; 0,05
A fin de examinar la función de la poblaciones infiltrantes de tumor, se implantaron por vía subcutánea las células MB49 para generar tumores más grandes para facilitar la selección posterior de las células. De manera similar a los tumores ortotópico, tumores subcutáneos desarrollados en ratones con deficiencia de Rip2 eran de aumento de tamaño en comparación con sus homólogos de tipo salvaje (Fig 3A). tumores disociadas ordenados para CD45
+ NK1.1
+ células NK mostraron una disminución en el número Rip2 deficientes en comparación con los ratones de tipo salvaje como se esperaba (Figura 3B). Los números de la infiltración de células CD4 y CD8 fueron demasiado pequeños para cuantificar por citometría de flujo (datos no mostrados). En consonancia con los tumores ortotópico anteriores, disociado tumores subcutáneos ordenados por marcadores de superficie CD11b
+ y Gr1
+ mostraron números enriquecidos de CD11b
+ Gr1
células HI desde Rip2 deficientes en comparación con los ratones de tipo salvaje (figura 3C). Para examinar más a fondo las características funcionales de la CD11b
+ Gr1
hi células, se analizó un panel de genes que representan una firma de MDSCs y subpoblaciones mieloides. Arginase-1 y iNOS median los efectos supresores de T MDSCs [25]. IFN apoya la diferenciación hacia células M1, que se distinguen a su vez por la secreción de IL-12. IL-4 polariza precursores mieloides hacia un fenotipo M2, que está fuertemente asociado con MDSCs asociados a tumores y expresan IL-10 para mediar sus efectos supresores inmunes [26]. Se demuestra que Rip2 deficientes CD11b
+ Gr1
hi células expresaron niveles más altos de la arginasa-1 en comparación con células de ratones de tipo salvaje, con una tendencia similar en la expresión de la iNOS (Figura 3D). Consistentemente, el aumento de IL-10 expresión en Rip2 deficientes CD11b
+ se observaron Gr1
células hi en comparación con células de controles de tipo salvaje, mientras que no se observaron diferencias significativas en la expresión de IFN e IL-12, indicativo de polarización M2 (Fig 3D). Los niveles de IL-4 fueron indetectables en el CD11b
+ Gr1
hi células (datos no mostrados)
Rip2
+ /+ y RIP2
-. /- Ratones implantaron subcutáneamente fueron evaluados con las células MB49 durante 14 días para (a) el peso del tumor, y ordenados por citometría de flujo para examinar (B) CD45
+ + NK1.1, y (C) CD45
+ CD11b
+ Gr1
hI y CD45
+ CD11b
+ Gr1
células LO. Columna, media de cuatro ratones; Barras SD. Los datos son representativos de dos experimentos independientes. D, Ordenada CD45
+ CD11b
+ Gr1
HI y CD45
+ CD11b
+ Gr1
células LO en Rip2
+ /+ y Rip2
- /- ratones fueron examinados para la expresión de la arginasa-1 e iNOS por qPCR, mientras que CD45
+ CD11b
+ Gr1
células hI de Rip2
+ /+ y RIP2
- /- ratones eran examinado para la expresión de IL10, IL-12, IFN y por qPCR. Columna, media de dos ratones; Barras SD. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. se muestran ejemplos representativos. Todos los
p valores
se determinaron por
t
de Student de dos colas, con significación estadística se define como p. & Lt; 0,05
Para examinar el Rip-2- señales sistémicas dependientes que pueden influir en el desarrollo del microambiente del tumor, los niveles de citoquinas se midieron usando una matriz de citoquinas inflamatorias comparación de suero de tipo salvaje y ratones deficientes en Rip2 implantados con tumores de vejiga ortotópico MB49. Los niveles de citoquinas siete desde el panel que comprende 40 citoquinas se encontraron elevada en ausencia de Rip2. La mayoría se asocia con la diferenciación y la quimiotaxis mieloide, incluyendo G-CSF, M-CSF, IL-16, MCP-1, TREM-1, TIMP-1, e IL-1α con niveles relativos muestran esquemáticamente [27] - [33 ] (Fig 4A). Se analizaron los esplenocitos de los ratones portadores de tumores para evaluar la influencia de estas alteraciones de citoquinas, que revela diferencias significativas en los números de CD4
+ y CD8
+ linfocitos T, B220
+ B linfocitos, y NK1.1
+ células, pero un mayor desarrollo de CD11b
+ Ly6G
hI de células Rip2 deficientes en comparación con los ratones de tipo salvaje, que representan a la población granulocítica MDSC (figura 4B). Para examinar más a fondo el microambiente del tumor de vejiga, se analizó un panel de citoquinas que influyen en la polarización funcional de los macrófagos, así como la diferenciación de MDSCs en los tumores de vejiga intravesical [34]. Se observaron niveles aumentados de IL-4, G-CSF, y GM-CSF en los tumores de vejiga de Rip2 deficientes en comparación con los ratones de tipo salvaje, mientras que no se detectaron diferencias en IFN y de expresión de M-CSF, consistente con un microambiente tumoral fomentar desarrollo de las MDSCs asociados a tumores (Fig 4C). Para discriminar entre la producción de citoquina producida por el tumor y el estroma que rodea a las poblaciones mieloides, se analizó la expresión de G-CSF en el CD45
- población que representa las células tumorales y estroma, y CD11b
+ Gr1
hi población que representa las células mieloides , mostrando un incremento de G-CSF en Rip2 deficientes en comparación con los de tipo salvaje CD11b
+ Gr1
hi células, lo que sugiere una regulación autocrina y paracrina de MDSCs en ausencia de Rip2 (figura 4D).
a, la expresión de citoquinas inflamatorias en el suero de Rip2
+ /+ y Rip2
- /- ratones por vía intravesical implantados con células MB49 durante 12 días se evaluó mediante el análisis conjunto de citoquinas. Las citoquinas aumento en Rip2
- /- ratones se representan en el esquema como se muestra. (+) 2-5x, (++) 5-10x, (+++) & gt; 10 veces sobre la base de la cuantificación por ImageJ. Los resultados son de duplicados y representativos de dos experimentos independientes. B, esplenocitos de Rip2
+ /+ y Rip2
- /- ratones se examinaron para la expresión de CD4, CD8, B220, NK1.1, mientras CD11b
+ células se examinaron para la expresión de Ly6G y Ly6C por citometría de flujo como se indica. Columna, media de cuatro ratones; Barras SD. Los datos son representativos de dos experimentos independientes. C, tumor total de Rip2
+ /+ y Rip2
- /- ratones por vía intravesical implantaron las células MB49 y se sacrificaron a los 12 días fueron examinados para la expresión de IL-4, IFN, M-CSF, G-CSF, y GM -CSF por qPCR. Columna, media de tres ratones; Barras SD. D, tumores de Rip2
+ /+ y Rip2
- /- ratones implantados subcutáneamente con las células MB49 durante 14 días se fraccionaron para CD45
- y CD45
+ CD11b
+ Gr1
hi células y se examinaron para la expresión de G-CSF por qPCR. Columna, media de tres ratones; Barras SD. Todos los
p valores
se determinaron por
t
de Student de dos colas, con significación estadística se define como p. & Lt; 0,05
La población MDSC se compone de inmaduros células mieloides y células progenitoras mieloides que pueden diferenciarse en macrófagos maduros, granulocitos y células dendríticas. Se caracterizan por la capacidad de los linfocitos T supresores y la expresión de la arginasa-1 y iNOS [25]. En el ratón, pueden ser distinguen además en MDSCs granulocitos mediante la expresión de marcadores de superficie CD11b
+ Gr1
hi o CD11b
+ Ly6G
+ Ly6C
hete MDSCs monocıticas por la expresión de marcadores CD11b
+ Gr1
lo CD11b o
+ Ly6G
loLy6C
hi [35]. Para probar la función intrínseca de Rip2 en el desarrollo mieloide, médula ósea ingenuo de los ratones de tipo salvaje y Rip2 deficientes estaban sujetos a
in vitro
diferenciación mediante M-CSF, G-CSF, GM-CSF o G -CSF y GM-CSF durante 4 días y se examinaron para la expresión de CD11b, Ly6G, y Ly6C. En presencia de G-CSF, GM-CSF y G-CSF más GM-CSF, la ausencia de Rip2 dio lugar a un sesgo hacia el CD11b
+ Ly6G
+ Ly6C
lo población granulocítica MDSC ( Fig 5A). En MDSCs derivados-BM diferenciarse usando G-CSF o G-CSF y GM-CSF, el aumento de la arginasa-1 y la expresión de iNOS se observó de manera uniforme en Rip2 deficientes en comparación con las células de tipo salvaje, en consonancia con el aumento del desarrollo de MDSCs (figura 5B )
A, la médula ósea de ingenuo Rip2
+ /+ y Rip2
-. /- ratones se diferencian por M-CSF, G-CSF, GM-CSF y G-CSF más GM-CSF tal como se indica durante cuatro días antes de la citometría de flujo para examinar la expresión de Ly6G y Ly6C en CD11b
+ células (que van desde 70 hasta 90%, que no se muestra). CD11b
+ AVG
+ Ly6C
Lo y CD11b
+ AVG
loLy6C
poblaciones hi para cada grupo se muestran como recuentos de células totales por 10
5 a partir de células BM. B, La expresión de la arginasa-1 e iNOS por qPCR en el G-CSF y G-CSF más GM-CSF diferenciado de médula ósea de ingenuo Rip2
+ /+ y Rip2
- /- ratones. Columna, media de tres ratones; Barras SD. Los datos son representativos de dos experimentos independientes. se muestran ejemplos representativos. Todos los
p valores
se determinaron por
t
de Student de dos colas, con significación estadística se define como p. & Lt; 0,05
MDSCs han sido implicados en la promoción de la EMT , un proceso crítico en la facilitación de la invasión tumoral y posteriores metástasis tumorales [36]. Una característica distintiva de EMT es un interruptor en marcadores de adhesión de la superficie con la pérdida de E-cadherina y la expresión de N-cadherina [37]. Para investigar la influencia de Rip2 en el desarrollo de la EMT, se analizó la expresión de marcadores de adhesión en tumores intravesicales y observó disminución de la expresión de E-cadherina en todo el tumor con concomitante incremento en la expresión de N-cadherina en la periférica del tumor en Rip2 deficientes en relación con salvaje los ratones de tipo (figura 6A). la activación de NF-kappa B ha sido implicado en la promoción de EMT y por lo tanto hemos examinado su activación en ausencia de Rip2 [38]. En consonancia con la literatura anterior, se observó disminución de canónica la activación de NF-kB exhibida por disminución de la expresión de p-I? B en Rip2 con deficiencia de tumores (Fig 6B), lo que sugiere mecanismos independientes de NF-KB para dar cuenta de EMT [39]. Para investigar otros mecanismos de promoción de la EMT, un grupo de factores de transcripción implicados en la EMT incluyendo
Zeb-1