Extracto
Antecedentes
La nestina está asociada con la transformación neoplásica, pero los mecanismos por los cuales nestina contribuye a la invasión y la malignidad del cáncer de pulmón siguen siendo desconocidos. Teniendo en cuenta que la proliferación es necesario para un comportamiento maligno, se investigó el mecanismo de acción nestina en asociación con las propiedades proliferativas de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC).
Métodos
nestin expresión se examinó en muestras de NSCLC y líneas celulares. Asociaciones con las características clínico-patológicas, incluyendo marcadores de pronóstico y proliferativas, se evaluaron. Efectos de la caída nestina sobre la proliferación y las vías de señalización implicadas se investigaron más.
Resultados
La nestina se expresó en la mayoría de los especímenes de cáncer y todas las líneas de células tumorales analizadas. Alta expresión de nestina en tejido maligno se asocia con altos niveles de Ki-67 o PCNA y los malos resultados de los pacientes. Por el contrario, desmontables de expresión nestin condujo a una inhibición significativa de la proliferación de células tumorales, la disminución de colonia capacidad de formación, y la detención del ciclo celular G1. Además, desmontables nestin como resultado la inhibición de la activación de Akt y GSK3.
Conclusiones
Nuestros datos demuestran que la expresión de nestina en las células de NSCLC se asocia con un mal pronóstico de los pacientes y vía de proliferación de células tumorales. Regulación a la baja de nestina inhibe eficazmente la proliferación de células de cáncer de pulmón, que puede ser a través de que afecta a la detención del ciclo celular y vía de señalización Akt-GSK3-Rb
Visto:. Chen Z, Wang J, Cai L, Zhong B, Luo H, Hao Y, et al. (2014) El papel de la célula de vástago asociada a filamentos intermedios nestina en proliferación maligna de células no pequeñas de cáncer de pulmón. PLoS ONE 9 (2): e85584. doi: 10.1371 /journal.pone.0085584
Editor: Vladimir V. Kalinichenko, Centro Médico Hospital Infantil de Cincinnati, Estados Unidos de América
Recibido: 29 de mayo de 2013; Aceptado: 29 Noviembre 2013; Publicado: 3 Febrero 2014
Derechos de Autor © 2014 Chen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyada por las subvenciones del Programa Nacional de Investigación básica de China (nº 2009CB522100 y 2010CB945400), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (nº 30971675, 30900729, 31171398 y), y los proyectos científicos y tecnológicos clave de la provincia de Guangdong (n . 2007A032100003). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo. En el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), que representa el 80% de todos los casos de cáncer de pulmón, metástasis a distancia se desarrollan en hasta el 70% de los pacientes con enfermedad en estadio temprano [1], [2]. A pesar de la introducción de nuevos agentes quimioterapéuticos y la mejora de las técnicas quirúrgicas, NSCLC sigue siendo un gran reto terapéutico. La tasa de supervivencia es actualmente pobre, con la supervivencia del paciente sólo el 15% a los 5 años después del diagnóstico [3]. características malignas de NSCLC implican varios eventos importantes, incluyendo la proliferación e invasión del tumor primario, la angiogénesis sostenida, y la evasión de la apoptosis. Proliferación de tumor primario es una parte integral de la patogénesis molecular y celular, el desarrollo, y la metástasis de cáncer de pulmón [4].
nestina, un miembro de la filamentos intermedios (IF) de la familia, ha sido identificado como un potencial indicador proliferativa y multipotencia en varias células progenitoras [5] - [10]. Informes recientes apoyan una relación entre la nestina y características malignas [11] - [19], y sugieren que la expresión abundante nestina se correlaciona con una mayor malignidad y peor pronóstico en diferentes tipos de cáncer [11], [18] - [21]. Sin embargo, la función específica de nestin en el comportamiento invasivo y metastásico de las células de cáncer de pulmón sigue siendo poco clara. Los hallazgos que desmontables nestin reduce neuroblastoma cultivadas y el crecimiento celular astrocitoma mientras que su sobreexpresión tiene un efecto citoprotector contra H
2O
2 lesión sugieren un papel en la promoción de la supervivencia y la proliferación [22] de células - [24]. Por el contrario, otro estudio demostró que la regulación negativa nestina no altera el
in vitro
o
in vivo
características de crecimiento de dos líneas celulares de cáncer de páncreas distintas [25]. Por lo tanto, nestin no puede simplemente actuar como una proteína estructural, pero puede participar activamente en el control de los procesos celulares importantes. Sin embargo, los mecanismos de acción precisos nestina en la proliferación requieren una aclaración adicional.
Nuestro estudio anterior confirmó la expresión de nestina en muestras de tejido de NSCLC, que parece correlacionarse con el conducto linfático recién nacido inducida por las células tumorales [21]. Por otro lado, Ryuge S había descrito la expresión de nestina es un indicador pronóstico más pobre de la probabilidad de supervivencia para los pacientes con NSCLC resecado [26]. Sin embargo, la relación entre la expresión de nestina y el comportamiento proliferativo de células de NSCLC no se ha investigado directamente hasta la fecha. Teniendo en cuenta los datos disponibles limitados sobre el papel fisiopatológico de nestina en las células NSCLC [21], [26], que no sólo han confirmado que la expresión de nestina en las muestras de NSCLC parece correlacionarse con las medidas clínicas de malignidad del tumor, sino también examinado la asociación de la expresión de nestina con propiedades proliferativas de las células del cáncer de pulmón y su papel funcional en la proliferación de células tumorales en el estudio actual.
Materiales y Métodos
muestras de tejido
Un total de 71 CPNM muestras y tejidos adyacentes al tumor (borde más alejado de la resección del tumor) fueron seleccionados al azar de nuestra base de datos de tejidos. Las muestras fueron obtenidas de pacientes tratados en el Departamento de Cirugía de Tórax del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Sun Yat-sen, entre mayo de 2003 y julio de 2004. Ninguno de los pacientes había recibido quimioterapia neoadyuvante o radioterapia. La información clínica se obtuvo mediante la revisión de los registros médicos preoperatorios y perioperatorios o por teléfono o correspondencia escrita. Los casos se llevaron a cabo sobre la base de la clasificación tumor-nódulo-metástasis (TNM) de la Unión Internacional Contra el Cáncer, revisada en 2002 [27], [28]. El uso de materiales humanos fue aprobado por el Comité Ético de Medicina de la Primer Hospital Afiliado, Universidad de Sun Yat-sen (Nombre completo de la junta /comité:. El Comité de Ética Médica de la Primer Hospital Afiliado, Universidad de Sun Yat-sen No. 2008-7). Confirmamos que el consentimiento informado por escrito del donante o de los familiares se obtuvo para el uso de esta muestra en la investigación. Características clínicas de los pacientes se muestran en la Tabla 1.
Líneas Celulares
no pequeñas líneas celulares de cáncer de pulmón de células, A549, H1299 y H460, se obtuvieron del Banco de Células de la Academia de Ciencias de china (Shanghai, china), y se cultivaron de acuerdo con el protocolo específico banco de células.
tinción inmunohistoquímica
el procedimiento inmunohistoquímico fue similar a los protocolos de informes anteriores [21], [29] . Anti-nestina (AB5922; Millipore, Temecula, CA; 1:500 dilución) y anti-Ki-67 (sc-15402, Santa Cruz, CA, EE.UU.; 1:200 dilución). Se utilizaron como los anticuerpos primarios
Los plásmidos
Para desmontables expresión de nestina, vectores de retrovirus (pSM2) que codifica ARN corto horquilla (shRNAs), designado shRNA1 (5'-TGC TGT TGA TGA CAG GCG AGG CAG ACA TCA TTG GTG GTG TTA ATA AAG CCA CAG ATG TAA TAT CAC CAA TGA TGT CTG CCC TGC CTA CTG CCT CGG A-3 ') y shRNA2 (5'-TGC TGT TGA CAG TGA CGG GCG CTA GTC CCT GCC TGA ATA ATA GTG AAG CCA CAG ATG TAT TAT TCA GGC AGG GAC TAG CCA TGC CTA CTG CCT CGG A-3 '), fueron adquiridos de Applied abierto (Huntsville, AL, EE.UU.). Estos retrovirus o un constructo que contiene una secuencia shRNA revueltos (control shRNA, Open Biosystems) fueron transducidas de forma estable en las células tumorales a través de la selección de antibióticos.
Inmunofluorescencia La tinción
Las células se incubaron con anti-nestina primaria ( AB5922; Millipore, Temecula, CA; 1:500 dilución), anti-Ki-67 (Santa Cruz; 1:200 dilución) o anticuerpo anti-PCNA (2586; Cell Signaling Tech, Beverly, MA; 1:2000 dilución). Las muestras fueron montadas con Vectashield que contiene Hoechst 33342, y se observaron con un microscopio de fluorescencia
Análisis de RT-PCR
El ARN total se extrajo, y las siguientes secuencias de cebadores empleados:. Nestina, 5-GAG GAC CAG AGT ATT GTG AGA C-3 y el 5-CAC AGT GGT GCT TGA GTT TC-3 (368 pb) y β-actina (control interno), 5-GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA-3 y el 5-CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3 (540 pb).
Análisis de inmunotransferencia
Las proteínas fueron separadas, electrotransferred, se bloquearon con una solución de TBS /0,1% de Tween-20, se incubaron con anticuerpos anti-ratón anticuerpo nestina (AB5922; Millipore, Temecula, CA; 1:500 dilución) durante la noche, y se detecta con una de rábano picante anti-ratón anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa (Cell Signaling Tech, Beverly, MA, EE.UU.). Se utilizó como control interno y la imagen-Pro Express (MediaCybernrtics, EE.UU.) se utilizó el sistema
Formación de Colonias y CCK-8 Ensayos de proliferación celular
formación de colonias de células se determinó mediante tinción con cristal violeta. La proliferación celular se ensayó con el Kit de Recuento celular (CCK) -8 (Dojindo, Kumamoto, Japón), y se determinó midiendo la absorbancia a 450 nm.
Evaluación de la síntesis de ADN a través de EdU Incorporación
Las células se marcaron con 5-etinil-2 'desoxiuridina (EDU). incorporación Nuclear se ensayó por detección de Alexa Fluor 488 usando el kit de Click-iT EdU Imaging (Invitrogen).
Citometría de Flujo
Tras el lavado con PBS, se analizaron cincuenta mil células utilizando un FACS Calibur instrumento (BD Biosciences, San Jose, CA) equipado con el software CellQuest 3.3. Se empleó ModFit LT software de análisis de ciclo celular 3.1 de prueba para determinar los porcentajes de células en diferentes fases del ciclo celular
Expresión de proteínas del ciclo celular
Para la inmunotransferencia, los siguientes anticuerpos utilizados:. conejo anti-Akt (# 9272), anti-GSK3 (# 9332), anti-fosfato (Ser21 /9) -GSK3β (# 9331), anti-fosfo (Ser780) -rb (# 9307), anti-fosfo (Ser795) -rb (# 9301), anti-fosfo (Ser870 /811) -rb (# 9308), ratón anti-fosfo (Ser473) -Akt (# 4051) y anti-retinoblastoma (Rb) proteína (# 9309), así como anticuerpo secundario conjugado con HRP anti-conejo. Todos los anticuerpos fueron adquiridos de Señalización Celular Tecnología (Beverly, MA, EE.UU.). Para los análisis cuantitativos, todos los datos se normalizaron a GAPDH expresión.
Análisis estadístico
Todos los cálculos se realizaron con SPSS v.14.0 software estadístico (Chicago, IL, EE.UU.). coeficiente de correlación de Spearman de, prueba de Chi-cuadrado y ANOVA se aplicarán, según proceda. La supervivencia global (OS) se calculó a partir de la fecha de la cirugía hasta la fecha de la última visita de seguimiento, y la asociación de la expresión de nestina con OS presenta como gráficos de Kaplan-Meier. Los análisis univariados y multivariados se realizaron mediante regresión de Cox de riesgos proporcionales para determinar los efectos de pronóstico de la expresión de nestina y las variables clínicas potenciales en el sistema operativo.
Resultados
La información clínica básica y los estudios de seguimiento
en total, 51 de 20 pacientes de sexo femenino con NSCLC sometidos a resección curativa quirúrgica masculina y se inscribieron en el estudio. La edad media de los pacientes fue de 57,6 ± 9,8 años (rango, 35 a 77 años). Examinamos 35 adenocarcinoma de pulmón, carcinoma de células escamosas 34 y dos casos de carcinoma de células grandes. Los casos fueron clasificados como estadio I (n = 32), en estadio II (n = 17), en estadio III (n = 15) y estadio IV (n = 7).
27, 28 en estadio IV casos incluyen T
1-2 N
0 y resecado metástasis cerebral solitaria. Los datos del paciente se analizaron después de 5 años de seguimiento, y la información obtenida que para el 95,8% (68 de 71) de los pacientes. La mediana de supervivencia global fue de 25,2 ± 1,9 meses (IC del 95%: 21.4-29.0 meses) y la media de supervivencia global fue de 24,0 ± 2,3 meses (IC del 95%: 19.4-28.6 meses).
Asociación de Expresión con nestina mal pronóstico en pacientes con CPNM
las características basales de la población de estudio en relación con el fenotipo nestina y los resultados de los análisis multivariados se presentan en las Tablas 1 y 2, respectivamente. Nestina se expresó en 88,7% (63/71) de los casos, con casi ninguna expresión en las células del epitelio alveolar y bronquial en los tejidos adyacentes tumorales (Figuras 1A, B). estado de nestina se correlaciona con el fenotipo pobremente diferenciado (
χ
2 = 17.776,
P = 0,006
), el tipo de tejido de cáncer histológico (
χ
2 = 8.215,
P = 0,002
), clasificación N (
χ
2 = 12.093,
P = 0,001
), y el estado vital (
χ
2 = 9.003,
P = 0,003
). Se observó una diferencia significativa en las estimaciones de supervivencia entre los pacientes con y sin fenotipo nestina (Figura 1D). nestin expresión elevada (utilizando un valor de corte basado en la histoscore nestina mediana) se asoció con la supervivencia acumulativa más corta (30,8 ± 3,3
vs
20,2 ± 1,7 meses, HR = 3,366;
P =
0,006).
tinción nestina fuerte fue evidente en el tejido NSCLC, mientras que la tinción del tumor en los tejidos adyacentes era débil (a, B). Nestina se detectó, además, en el adenocarcinoma pobremente diferenciado y tejido de carcinoma de células escamosas (C). Un gráfico de Kaplan-Meier que representa las diferencias en la supervivencia entre los grupos de alta y baja expresión de nestina, dicotomizaron basa en el valor de la mediana de la expresión de nestina en las lesiones tumorales (D). Barra de escala, 100 m; *
p Hotel & lt; 0,01; ANOVA.
Asociación de nestina con tumor de células proliferativas marcadores
nestin expresión se asoció significativamente con las de los marcadores de proliferación, Ki-67 (r = 0,795,
P
& lt; 0,001; Figura 2A, B, y C) y PCNA (r = 0,764,
P
& lt; 0,001; Figura S1A y B), indicativo de un papel en la proliferación de células tumorales.
La tinción de nestina y Ki-67 en muestras de NSCLC. tinción (A) IHC de nestina y Ki-67 en tejidos de NSCLC. (B) una correlación significativa de nestina y Ki-67 niveles (r = 0,795;
P Hotel & lt; 0,001). Cada punto representa una muestra de NSCLC. (C) Ki-67 histoscores fue elevado en adnocarcinoma (adeno) y el carcinoma de células escamosas (SCC) con una mayor expresión de nestina. Barra de escala, 100 m; *
p Hotel & lt; 0,01, ANOVA usando
nestin expresión en líneas celulares de NSCLC
Para aclarar el estado de la expresión de nestina en el CPNM, se analizó su expresión. patrones en el CPNM líneas celulares, A549 y H460. En particular, el ARNm y la proteína nestina se detectaron en todas las líneas celulares (Figura 3). La expresión de la proteína nestina entre las células tumorales y las células normales también se ha mostró utilizando láser captura microdissection (Figura S2).
expresión se detectó nestina en A549, las células H460 H1299and utilizando la tinción de inmunofluorescencia (A), RT-PCR (B) y análisis de inmunoblot (C). β-actina o GAPDH se utilizó como control de carga. Barra de escala, 100 micras.
Papel de nestina en la proliferación de células tumorales
Para evaluar si nestina juega un papel en la proliferación de células de cáncer de pulmón, que transfectadas establemente células A549 y H460 con plásmidos codifica shRNAs dirigidos a la transcripción nestina o con plásmidos de control shRNA revueltos, y midió los cambios en los atributos relacionados con la proliferación. La tinción de inmunofluorescencia y la inmunotransferencia mostraron que dos secuencias shRNA nestina (shRNA1 y shRNA2) redujo drásticamente la expresión de la proteína nestina (Figura 4A). Como se muestra en la Figura 4B, desmontables nestina en las células tumorales resultó en disminución importante en la capacidad de formación de colonias (de 23% a 11,8% y 12,3% para shRNA1 y shRNA2 en las células A549, y de 39,6% a 20,9% y 22,8% para shRNA1 y shRNA2 en las células A549, respectivamente). La tasa de proliferación también se redujo notablemente en cada uno de las células nestina desmontables en comparación con las células control de vector, medido como una disminución de las células viables (Figura 4C). Consistente con la relación entre la elevada expresión de nestina y Ki-67 o la expresión de PCNA en las muestras de tumor de NSCLC, desmontables nestina en las células tumorales dio como resultado una disminución significativa en el número de células Ki-67-positivas en comparación con el control de las células tumorales (Figura 4D). Además, la síntesis de ADN en las células tumorales desmontables nestina fue significativamente inhibido en comparación con la de las células tumorales de control (Figura 5A).
Se establecieron células A549 o H460 (A) de forma estable que expresan shRNA contra nestin (shRNA1, shRNA2) y knockdown nestin, en comparación con células A549 o H460 transfectadas con una secuencia shRNA codificados (vector de control), confirmado con la tinción de inmunofluorescencia (panel izquierdo) e inmunotransferencia (panel derecho). Las diferencias entre knockdown nestina y A549 de control o células H460 en términos de la formación de colonias de células se demostraron en micrografías representativas con tinción con violeta cristal (B, panel izquierdo) y la cuantificación de las colonias de células (B, panel derecho). Supresión del crecimiento de las células como resultado de la caída nestin se estableció con el Kit de ensayo CCK-8 (C). La tinción de inmunofluorescencia (D) mostró inmunorreactividad positiva para el anticuerpo Ki-67 (rojo), y los núcleos se contratiñeron con Hoechst 33342 (azul). Barra de escala, 100 m; *
p
. & Lt; 0,01, ANOVA usando
Las diferencias en las tasas de síntesis de ADN entre desmontables nestina y A549 control o células H460 se determinaron usando ensayos de incorporación EdU (A). La citometría de flujo fue empleado para analizar el ciclo celular en caída nestina y A549 de control o células H460 (B). Barra de escala, 100 m; *
p
. & Lt; 0,01, ANOVA usando
nestina shRNA clones de visualización detención del ciclo celular en la transición G1 /S fase
Para determinar si la inhibición de las células tumorales de proliferación se relaciona con la regulación del ciclo celular, se investigaron los efectos de la caída nestina en la progresión del ciclo celular en las células cancerosas. Cabe destacar que el número de células en la fase S del ciclo celular se redujo sustancialmente siguiente knockdown nestina (Figura 5B).
nestina shRNA Clones Display Disminución de la fosforilación de Akt en Ser 473 y GSK3α /β en Ser 21 /9
A continuación, se determinaron los perfiles de señalización de los clones shRNA nestina. Dado que la transición de G1 a la fase S es un punto de control importante durante la proliferación celular, se verificó además las vías de señalización implicadas en G1 a S progresión. knockdown nestina muestra relativamente menor fosforilación de proteínas clave implicadas en la proliferación y la metástasis, incluyendo Akt en Ser 473, GSK3α /β en Ser 21/9, y Rb en la Ser 780, 795, y 807/811 (Figura 6A). El análisis cuantitativo reveló además que la disminución de fosfo-Akt y proteínas /ß fosfo-GSK3α fue particularmente marcada en las células tumorales transducidas con la secuencia de shRNA2, mientras que la expresión de fosfo-Rb se redujo más significativamente en las células tumorales transducidas con la secuencia de shRNA1 (Figura 6B -F). Por lo tanto, los principales eventos de fosforilación alterados en regulación a la baja de nestina son las de los principales mediadores en la vía de la fosfatidilinositol 3-quinasa.
(A) Los patrones de expresión de una serie de proteínas relacionadas con el ciclo celular en caída nestina y A549 de control Células. (B-D) Análisis cuantitativo de Rb y fosfo-Rb, (B) y AKT fosfo (Ser473) -AKT (C), y GSK3 y fosfo-GSK3α /β (D). *
p Hotel & lt; 0,01; ANOVA.
Discusión
nestina se expresa en una amplia variedad de poblaciones de células embrionarias y progenitoras de adultos, y se considera un marcador para distinguir las células precursoras de otras células diferenciadas [30], [ ,,,0],31]. Los informes recientes han demostrado que la expresión de nestina de mama, próstata y cáncer de páncreas tiene una correlación positiva con la malignidad del tumor [16] - [18]. Estas observaciones han llevado a un mayor interés en la investigación de los patrones de expresión de nestina en diversos tumores y su relación con las características de proliferación y metástasis.
En el presente estudio, se demostró que la expresión de nestina se asocia significativamente con características malignas del tejido NSCLC , específicamente, pobremente diferenciado fenotipo y clasificación histología. Además, el ARNm nestina y proteínas se expresan en todas las líneas celulares de NSCLC examinadas. Los análisis estadísticos revelaron un aumento significativo de la tasa de riesgo (riesgo de muerte) en los pacientes con alta expresión de nestina, en comparación con aquellas que expresan bajos niveles de nestina. Alta expresión de nestina en el tejido CPNM se asocia más frecuentemente con recaída de la enfermedad y la muerte. Nuestros resultados confirman aún más los informes anteriores de una relación positiva entre la expresión de nestina y la malignidad del tumor [11], [18] - [21].
A pesar de que estudios anteriores han informado de que desmontables de nestina de siRNA reduce eficazmente la proliferación y crecimiento de las células C6 de astrocitoma [23] y su regulación a la baja activa cdk5 /vías de apoptosis p35 dependiente de [24], [32], el papel preciso de nestina en la metástasis tumoral es oscuro en la actualidad. En este caso, se observó una relación positiva entre la nestina y Ki-67 expresión en tejidos y células de NSCLC. La observación de que la proteína Ki-67 se expresa en todas las fases activas del ciclo celular (G1, S, G2, y mitosis), pero ausente en las células en reposo, también apoya la teoría de que nestin puede estar asociada con la proliferación de células tumorales. Dada la asociación entre la alta expresión de nestina y tinción elevada para los marcadores de células proliferativas, Ki-67 y PCNA, nos hemos centrado en el papel de nestina en la proliferación de células tumorales usando retrovirus para introducir shRNA vectores con secuencias nestina focalización (o de control) en el CPNM Células. De manera significativa, las propiedades de proliferación, como la capacidad de formación de colonias y la tasa de crecimiento celular, se redujeron en los clones ARNhc nestina. Nuestros resultados proporcionan evidencia preliminar para un papel de nestina en la proliferación celular del cáncer de pulmón.
Un posible mecanismo para explicar el vínculo entre la expresión y la proliferación nestin se propone sobre la base de los resultados de nuestro análisis de la regulación del ciclo celular en células tumorales. Específicamente, el tamaño de la población de células en fase S se redujo dramáticamente en desmontables células nestina. Consistente con este hallazgo, la síntesis de ADN, que se produce durante la fase S, se redujo en los clones ARNhc nestina. La transición de G1 a la fase S es un punto de control importante en el ciclo celular. Nuestra investigación de las proteínas clave que regulan este punto de control, como la proteína Rb, proporcionó apoyo adicional para un papel para nestina en la proliferación a través de la modulación del ciclo celular. Las interacciones de Rb con los complejos ciclina D-CDK4 /6 y ciclina E-CDK2 promueven la fosforilación de Rb y la expresión de los genes necesarios para entrar en la fase S [33], [34]. Nuestros experimentos mostraron que los clones shRNA nestina muestran niveles relativos disminución de la fosforilación en varios sitios de Rb. Por consiguiente, proponemos que la promoción de la fosforilación de Rb es uno de los mecanismos moleculares a través del cual nestin induce la proliferación de células tumorales. Estamos, además, investigamos las proteínas específicas de la vía de señalización de Akt. Las anormalidades en la proteína quinasa de serina /treonina, Akt, están estrechamente relacionados con el estado de proliferación de las células e inducir la fosforilación de GSK3 [35], [36]. En su forma activada desfosforilado, GSK3 promueve la degradación de la ciclina D, y no fosforilada GSK3 suprime la fosforilación de Rb y previene la progresión del ciclo celular [37], [38]. Los datos de este estudio indican que la supresión de la proliferación celular en los clones ARNhc nestina depende de la regulación por disminución de la vía de señalización Akt-GSK3-Rb. Por extensión, estos datos implican que los niveles elevados de nestina en las células de cáncer de pulmón estimulan la proliferación y la metástasis al aumentar la actividad de esta vía. Un número de investigadores creen que nestin tiene principalmente una función del citoesqueleto, proporcionando un sitio de reacción para una variedad de vías de señalización [39], [40], y por lo tanto citoesqueleto se esperan cambios a afectar a las quinasas relacionadas con la invasión y la metástasis. Más importante aún, debido a A549 y células H460 líneas son p53 de tipo salvaje y la proteína MDM2 p53 regulada es un regulador conocido de la función de Rb, la diafonía entre nestina y vía de p53 parece ser tomado en consideración, y la inhibición de la actividad de mTOR por p53, que a su vez regula el nivel de Akt-S473-fosfo, también puede proporcionar un posible vínculo entre p53 y nestina [41], [42]. Por lo tanto, la relación entre la expresión y regulación de nivel de la proteína Rb nestina necesita tratarse con mayor atención.
En comparación con los informes anteriores relativas a la expresión de nestina en el cáncer de pulmón [21], [26], nuestros resultados no sólo confirman que la expresión de nestina en las muestras de NSCLC parecía correlacionarse con las medidas clínicas de malignidad del tumor y la mala clasificación histológica, pero también sugirió que nestin podría contribuir a la conducta proliferativa e invasiva de células de NSCLC. Además, nuestro trabajo también estudió en primer lugar, la relación biológica entre la alta expresión de nestina y características malignas de NSCLC usando técnicas de ARN desmontables, análisis del ciclo celular, y la evaluación de una serie de proteínas del ciclo de las células asociadas a los modelos de líneas celulares de cáncer de pulmón. Basándose en estos resultados, tendríamos proporcionado la primera demostración de que el fenotipo nestina exhibieron mejorada propiedades proliferativas, y explicado científicamente las cuestiones más importantes del mecanismo potencial de la acción nestina en la proliferación de células tumorales. Por lo tanto, los fenómenos que las células tumorales que expresan nestina son importantes para la proliferación, migración y metástasis en el cáncer de pulmón.
Aunque nuestros resultados indican que los actos nestina a través de la vía de señalización de Akt-GSK3-Rb a contribuir a la proliferación en Las células de cáncer de pulmón, otros aspectos de la malignidad del tumor, como la angiogénesis, la LI y el metabolismo del tumor, sin embargo, se han de examinar directamente. Sin embargo, a la vista de estos resultados, el papel de nestina debe tenerse en cuenta en el diagnóstico clínico en curso o como una nueva diana para el tratamiento del cáncer.
Conclusiones
Hemos observado células tumorales nestina positiva en la mayoría de las muestras de NSCLC y asociación significativa de la expresión de nestina con el subconjunto de pacientes de NSCLC que muestran resultados pobres y altos niveles de marcadores de proliferación. Por otra parte, desmontables nestina inhibe la proliferación celular y la detención G1 /S en las células NSCLC humanos, posiblemente a través de regulación a la baja de AKT-GSK señalización D 3β-ciclina. Nuestros datos sugieren colectivamente que las células tumorales que expresan nestina promover la proliferación en NSCLC, que puede constituir un mecanismo clave de malignidad nestin mediada en células de cáncer de pulmón. la regulación específica de nestina puede así tener aplicaciones terapéuticas en el tratamiento del cáncer de pulmón humano.
Información de Apoyo
figura S1.
La tinción de nestina y PCNA en las muestras de NSCLC. tinción (A) IHC de nestina y PCNA en los tejidos de NSCLC. (B) histoscores PCNA fue elevado en adnocarcinoma (adeno) y el carcinoma de células escamosas (SCC) con una mayor expresión de nestina. Barra de escala, 100 m; *
P Hotel & lt; 0,01, ANOVA usando
doi:. 10.1371 /journal.pone.0085584.s001 gratis (TIF)
figura S2. Francia El expresión de la proteína nestina entre las células tumorales y las células normales utilizando láser captura microdissection. captura microdissection (A) láser de las células tumorales y las células normales. H & amp; De celda que muestra células tumorales (a) y las células normales (d) antes de microdisección E-manchadas. sección que muestra células mismo tumor (B) y las células normales (e) después de microdisección. Las células tumorales (c) y las células normales (f) siguientes microdisección de la tapa. (B) Los resultados de la transferencia Western de dos pares de las células tumorales y las células normales microdissected. Barra de escala, 100 micras
doi:. 10.1371 /journal.pone.0085584.s002 gratis (TIF)
Reconocimientos
Esta investigación ha sido presentada en la 2
II Conferencia Europea de cáncer de pulmón (2010, Ginebra).