Extracto
Antecedentes
La familia de microARN-200 participa en el mantenimiento de un fenotipo epitelial y la pérdida de su expresión puede resultar en transición epitelial a mesenquimal (EMT). Además, la pérdida de la expresión de miembros de la familia miR-200 está vinculado a un fenotipo de cáncer agresivo. Regulación de la expresión de la familia miR-200 en células normales y cancerosas no se entiende completamente.
Metodología /Principales conclusiones
Los mecanismos epigenéticos participan en el control de miR-200c y miR-141 en la expresión tanto las células normales y cancerosas. Una isla CpG cerca del MIR-200c /mir-141 sitio de inicio de la transcripción predicho muestra una correlación sorprendente entre miR-200c y miR-141 expresión y la metilación del ADN tanto en células normales y cancerosas, según lo determinado por la tecnología MassARRAY. La isla CpG no está metilado en humanos miR-200 /miR-141 que expresan las células epiteliales y en el miR-141 células tumorales miR-200c /positivos. La isla CpG es muy metilado en el miR-200C humana /miR-141 y miR fibroblastos negativas-141 células tumorales miR-200c /negativos. células de ratón muestran una correlación inversa similar entre la metilación del ADN y la expresión de miR-200c. El enriquecimiento de modificaciones de las histonas H3 permisivas, acetilación y H3K4 trimethylation, se observó en las células epiteliales normales de miR-200C /miR-141-positivos, tal como se determina mediante inmunoprecipitación de la cromatina junto con PCR en tiempo real. Por el contrario, las marcas represivas H3K9 dimethylation están presentes en condiciones normales de miR-200C /fibroblastos de miR-141 y miR-negativas-200c /miR-141 células de cáncer negativos y las modificaciones de las histonas permisivas están ausentes. El fármaco modificador de la epigenética, 5-aza-2'- desoxicitidina, se reactiva /expresión de miR-200c de miR-141 que muestra que los mecanismos epigenéticos juegan un papel funcional en su control transcripcional.
Conclusiones /Importancia
Nos informan de que la metilación del ADN juega un papel en la expresión específica de tipo celular normal de miR-200c y miR-141 y este papel parece estar conservado evolutivamente, ya que se obtuvieron resultados similares en el ratón. metilación aberrante del ADN de la isla CpG miR-200c /141 está estrechamente ligada a su silenciamiento apropiado en las células cancerosas. Desde el clúster miR-200c juega un papel importante en la EMT, nuestros resultados sugieren un papel importante para la metilación del ADN en el control de las conversiones fenotípicos en las células normales
Visto:. Vrba L, Jensen TJ, Garbe JC, Heimark RL, berro AE, Dickinson S, et al. (2010) El papel de la metilación del ADN en el Reglamento de miR-200c y expresión de miR-141 en células normales y cancerosas. PLoS ONE 5 (1): e8697. doi: 10.1371 /journal.pone.0008697
Editor: Catherine M. Suter, Victor Chang Instituto de Investigación Cardiaca, Australia |
Recibido: 13 Octubre, 2009; Aceptado 21 de diciembre de 2009; Publicado: 13 Enero 2010
Derechos de Autor © 2010 Vrba et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Subvenciones R01CA65662 a BWF apoyado este trabajo. Centro de Subvenciones P30ES06694 y P30CA023074, y el centro de la biotecnología interdisciplinario BIO5 en la UA apoyaron la Genómica de servicios compartidos. J.C.G. y M.R.S. fueron apoyados por NIH U54 CA112970, el DOD BCRP BC060444, y la Oficina de Investigación de la Energía, Oficina de Salud e Investigación Biológica, Departamento de Energía de los EE.UU. bajo el Contrato No. DE-AC03-76SF00098. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
miRNAs son de una sola hebra, 20-24 nt ARNs largos que regulan la expresión génica a nivel postranscripcional. miRNAs suelen atacar a 3 'UTRs de ARNm, y desde miARN motivos objetivo no requiere una homología completa, cientos de mRNA objetivos pueden existir para cada miARN. Las estimaciones actuales son que hay cerca de 900 miRNAs únicos codificados en el genoma humano, y estos miRNAs de control, en parte, la expresión de más de un tercio de los genes humanos [1]. Un número de genes miARN dysregulated en el cáncer humano se ha demostrado que tiene actividad oncogénica o supresor tumoral [2], [3], [4]. Estos incluyen especies miARN que muestran el tipo de células patrones específicos de expresión, algunos de los cuales son importantes en el mantenimiento de la identidad de la célula [5], [6]. Estos tipos de miARN son los principales objetivos para el control epigenético, y los primeros estudios de soporte de control de miARN esta posibilidad [7], [8].
miR-200c y miR-141 son miembros de la familia miR-200 y son importantes reguladores de la transición epitelial a mesenquimal (EMT) [5], [9], [10], [11]. Además de la función de miR-200c y miR-141 en la conversión fenotípica de las células normales, la desregulación de los patrones normales de expresión de miR-200c se produce en múltiples tipos de células cancerosas y está vinculada a la progresión del tumor [2], [6] , [12], [13], [14], [15]. El mecanismo responsable del control de la expresión de miR-200c tanto en células normales y cancerosas no se entiende completamente. En este estudio, mostramos que el estado epigenético está estrechamente relacionada con el tipo de célula normal expresión específica de miR-200c y miR-141, y este estado epigenético está mal regulada en células de carcinoma, donde la pérdida de miR200c 141 de expresión /se vincula al ADN aberrante metilación de las histonas y modificaciones. Por último, se encontró que la regulación de miR-200c por la metilación del ADN se conserva evolutivamente entre los humanos y los ratones. Dado que el miR-200c juega un papel importante en la EMT, nuestros resultados sugieren que la metilación del ADN desempeña un papel importante en el control de las conversiones fenotípicas de las células normales y cancerosas.
Resultados y Discusión
El MIR -200 familia está compuesta por cinco miRNAs que están codificadas dentro de los dos grupos. Cada agrupación codifica un gen policistrónico. Un grupo reside en el cromosoma humano 1 y codifica el miR-200b, miR-200a, y miR-429, mientras que el otro grupo se encuentra en el cromosoma humano 12, y codifica el miR-200c y miR-141. Nuestros datos de secuenciación pequeña biblioteca de ARN (Figura 1A) muestran que la familia miR-200 es altamente expresado en células cultivadas normales humanos epiteliales mamarias (HMEC) derivadas de tres individuos diferentes, mientras que las células de fibroblastos humanos mamarios isogénicas (FB) carecen de miR-200 expresión familia (Figura 1A). Es evidente a partir de los datos de secuenciación de pequeñas bibliotecas de ARN (Figura 1) que los miembros más altamente expresados de la familia de miR-200 en HMEC son miR-200c y miR-141. Hemos corroborado la expresión de miR-200c y miR-141 en el mismo conjunto de muestras mamarias normales por PCR en tiempo real, y luego ampliado estos resultados de pares de células epiteliales y fibroblastos de próstata y piel, así (Figura 1B; la figura S1). En todos los casos, el miR-200c y miR-141 fueron altamente expresado en las células epiteliales, pero no se expresaron en fibroblastos.
A. expresión familia miR-200 de acuerdo con la secuenciación paralela masiva de bibliotecas de ARN pequeños de un conjunto de tres pares isogénicas de células epiteliales mamarias humanas (HMEC) y fibroblastos (FB). La expresión de la agrupación mir-200b-200a-429 localizado en el cromosoma humano 1, y la expresión de la agrupación mir-200c-141 localizado en el cromosoma humano 12 se muestra. Con el promedio de 63,829 recuentos de 3.926.984 por biblioteca en HMEC, miR-200c forma 1,625% de todos los ARN pequeños en estas células. B. Evaluación de PCR en tiempo real de la expresión de miR-200c en tipos de células normales. El panel izquierdo muestra la expresión de miR-200c en las mismas muestras que el panel A. El panel derecho muestra la expresión de miR-200c en las células epiteliales de la próstata humana (PREC), los fibroblastos del estroma de la próstata (PSF), queratinocitos de piel humana (Kcytes) y fibroblastos de la piel (HFF). Los datos están normalizados con respecto a let-7a, que se expresa a niveles equivalentes entre las diferentes muestras de acuerdo con los pequeños datos de secuenciación de RNA. Análisis en tiempo real PCR de la expresión de miR-141 en estas muestras se proporciona en la figura S1.
La horquilla MIR-200c secuencia y aproximadamente 300 pb de la secuencia genómica aguas arriba de codificación es CpG ricos. De acuerdo con nuestros cálculos utilizando el programa de CpG Cluster [16] Esta región es un clúster de alta estadísticamente significativa CpG (Figura 2A). Este grupo CpG (longitud de 334 pb, GC% 68.56, O /E ratio 0,58, 21CpGs, p-valor 8,44 × 10
-11) tiene las características cercanas a una definición de isla CpG en función del tamaño, contenido de GC y dinucleótido CpG frecuencia [17], así como su ubicación con respecto a la unidad transcripcional [18]. Además, esta región se considera una isla CpG sobre la base de una definición probabilística recientemente publicado [19]. Analizamos esta región como un posible objetivo de control epigenético.
A. Un diagrama de la región genómica de HSA-mir-200c. La barra superior muestra los fragmentos específicos analizados por MassARRAY. Los fragmentos rojos nombradas con los sitios CpG indican los fragmentos de los que procede la metilación del ADN de datos. Estos datos se presentan el panel B. A continuación esta es la región analizada por MassARRAY en relación con la localización genómica (en azul), seguido por la región del tiempo real de amplificación de PCR para el análisis de inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP), y la isla CpG identificó por el CpGcluster programa. Las regiones que codifican la región putativa del inicio de la transcripción (TSS) deducido de la EST pista humana de la UCSC genoma navegador MIR-MIR-200c y 141 horquillas y se muestran, y cada círculo en esta pista representa la posición de un dinucleótido CpG. La regla en la parte inferior muestra la localización en el cromosoma humano 12 de acuerdo con hg18 asamblea del genoma humano. B. Resumen de los niveles de 5-metilcitosina obtenidos por análisis MassARRAY de la isla CpG HSA-mir-200c en muestras caracterizadas en la Figura 1B. El eje y muestra el porcentaje de metilación de citosina dentro de las unidades de CpG individuales marcados en el eje x. Las unidades de CpG en el amplicón MassARRAY están numerados en la dirección inversa, con CpG 2 que se encuentra dentro de la secuencia de codificación de la miR-200c.
El estado epigenético de la miR-200c /141 isla CpG muestra clara y amplias diferencias tipo de células específicas entre las células normales de miR-200C /141-positivas y miR-200c /141-negativos. Utilizamos la tecnología MassARRAY para analizar el estado de metilación del ADN de la agrupación MIR-200c isla CpG (Figura 2B). Los resultados muestran que los sitios CpG no metilado son en tres cepas separadas de miR-200c HMEC /miR-141-positivo. En contraste, todos los sitios CpG están altamente metilados en el isogénica miR-200c /cepas de fibroblastos de miR-141-negativos. La correlación inversa entre la expresión de los genes miARN y la metilación del ADN se extiende a otros miR-200c /miR-141-positivos pares /negativos de las células normales, tales como células de la próstata epiteliales y queratinocitos de la piel, y sus homólogos de tipo de células mesenquimales, de próstata y fibroblastos de la piel. Por lo tanto, la isla CpG clúster miR-200c está metilado en las células epiteliales normales de miR-200C /miR-141-positivas, mientras que siendo densamente metilado en las /los fibroblastos emparejados normales de miR-200C de miR-141-negativas (Figura 1B, la figura 2B, Figura S2).
miR-200c y miR-141 expresión se pierde en diferentes tipos de células de cáncer [5], [11], [20], [21], y hemos tratado de determinar si esta pérdida de expresión estaba vinculado a los cambios epigenéticos en la isla CpG miR-200c /miR-141. Se analizaron 11 líneas celulares de cáncer de mama, y en cada caso, el miR-200c y miR-141 expresión está estrechamente relacionada con el estado de metilación del ADN de la isla CpG (Figura 3A; Figura S3). Siete de las líneas celulares de cáncer de mama probado expresa miR-200c y miR-141 y cada uno tiene una isla MIR-200c CpG no metilado. Las otras líneas celulares de cáncer de mama de cuatro probados no expresan el miR-200c y miR-141 y exhiben una isla CpG MIR-200c densamente metilado. El panorama es similar con respecto a las células del cáncer de próstata. Mostramos dos líneas celulares de cáncer de próstata (PC3 y PC3 B1) donde la pérdida de miR-200c y miR-141 expresión está unida con la metilación aberrante del ADN del MIR-200c /141 isla CpG (Figura 3B; Figura S3), y dos de próstata líneas celulares de cáncer (LNCaP y DU145) que retienen el miR-200c /expresión de miR-141 y miR-200c una isla no metilado 141 /CpG. En conjunto, estos resultados indican que las células cancerosas derivan de lo normal miR-200c /miR-141-positivas las células epiteliales pueden replicar el tipo específico patrón de metilación del ADN de las células de la 141 isla de miR-200c /CpG visto en condiciones normales de miR-200c /miR-141 células gramnegativas, y que la metilación del ADN aberrante de la isla CpG miR200c /141 en estas células de cáncer se asocia con su silenciamiento transcripcional en células de carcinoma.
a. la expresión de miR-200c y 200c-mir la isla CpG metilación en líneas celulares de cáncer de mama once. B. expresión de miR-200c y 200c-mir la isla CpG metilación en líneas celulares de cáncer de próstata de cuatro. El panel superior de cada figura muestra la expresión de miR-200c en muestras de cáncer detectado por PCR en tiempo real, normalizó a let-7a. El panel inferior muestra el nivel de metilación de la región de isla CpG MIR-200c en las mismas muestras de cáncer. El nivel de metilación de CpG unidades individuales dentro del amplicón MassARRAY se muestra como un mapa de calor con el más bajo de metilación en amarillo y el más alto de metilación en azul. El eje y marca las unidades de CpG individuales.
Para demostrar la importancia funcional del estado epigenético de la miR-200c /isla CpG mir-141 en las células cancerosas, expusimos las células cancerosas a la epigenética modificador y ADN metiltransferasa inhibidor de 5-aza-2 'desoxicitidina (5-AdC). El MIR-200c /líneas celulares de cáncer de mama miR-141-negativo MDA-MB-231 y BT549 y PC3 línea celular de cáncer de próstata fueron tratados con 3 M 5-AdC durante 96 horas y miR-200c /141 expresión se evaluó mediante real PCR en tiempo. La Figura 4 muestra 5-AdC reactivado expresión miR-200c en las tres líneas celulares de cáncer. El nivel de miR-200c aumentó 4,3 veces en MDA-MB-231 (valor de p = 0,0004), 6,4 veces en la BT549 (p-valor = 0,0107) y 4,2 veces en las células PC3 (p-valor = 0,0072) . Una reactivación similar de expresión de miR-141 (valor de p & lt; 0,01) también se observó en estas líneas celulares de cáncer después de 5-AdC tratamiento (Figura S4). Estos datos sugieren que los mecanismos epigenéticos participan en la represión inadecuada de miR-200c /expresión de miR-141 en las células cancerosas.
Las células se trataron con 3 M 5-aza-2 'desoxicitidina para 96 h. El nivel de expresión de miR-200c se midió por PCR en tiempo real. Se muestra el promedio de 4 muestras independientes, las barras de error indican el error estándar de medición. Los valores se normalizaron a los controles sin tratar (100%). Figura S4 muestra la reactivación 5-aza-2'- desoxicitidina mediada de miR-141 en las mismas muestras.
El estado de modificación de las histonas de la isla CpG clúster MIR-200c también muestra tipo de células diferencias específicas que están estrechamente relacionados con el estado de expresión de miR-200c /141 en células normales y cancerosas. La Figura 5 muestra los resultados de las inmunoprecipitaciones de cromatina acoplados a análisis de PCR cuantitativa en tiempo real que se utilizaron para examinar el estado modificación de las histonas de la isla CpG miR-200c /141 en células normales y cancerosas. La isla CpG de miR-200c /141 en los tres diferentes cepas de miR-200c /miR-141-positivo HMEC existe en un estado transcripcionalmente competente; se enriquece para las modificaciones transcriptionally permisivas de acetilación de la histona H3 (H3Ac) y lisina 4 trimethylation (H3TriMeK4), mientras que la marca de histona transcriptionally represivo de la histona H3 lisina 9 dimethylation (H3DiMeK9) es insuficientemente representados (Figura 5). Por el contrario, en el isogénica miR-200c /fibroblastos mamarias de miR-141-negativas modificaciones de las histonas permisivas están ausentes, y el H3 lisina 9 Marca dimethylation represiva está presente (Figura 5). Del mismo modo, las líneas celulares de cáncer de mama que habían perdido el miR-200c /141 expresión perdieron la acetilación de histonas H3 y trimethylation K4 y adquieren un estado represivo histona, enriquecida por la marca dimethylation H3 lisina 9 (Figura 5). No se detectó ningún enriquecimiento de trimethylation de lisina de la histona H3 27 en la isla de miR-141 200c /CpG en las muestras analizadas (Figura S5). Tomados en conjunto, los resultados de los análisis de estados de modificación de histonas miR-200c /141 expresión, la metilación del ADN, ya través de una variedad de tipos de células normales y cancerosas demuestran una estrecha relación entre la expresión de miR-200c /141 y el estado epigenético de su isla CpG asociada.
marcas de histona permisivos representados por la acetilación de la histona H3 (H3Ac) y trimethylation de lisina 4 de la histona H3 (H3TriMeK4), así como la represión dimethylation marca de histona de la lisina 9 de la histona H3 (H3diMeK9 ) se analizaron mediante inmunoprecipitación de la cromatina acoplado a PCR en tiempo real de la región descrita en la figura 2A. HMEC muestras se muestran en verde, muestras FB isogénicas se muestran en rojo, y las líneas celulares de cáncer de mama de dos miR-200-negativas están en azul. El eje Y muestra doblar el enriquecimiento de cada marca de la histona sobre ADN de entrada dentro de la isla CpG MIR-200c.
Por último, hemos tratado de determinar si la regulación epigenética de la expresión de miR-200c en las células normales es evolutivamente conservados, razonando que el control vinculado a la metilación del ADN de expresión de miR-200c a través de especies de mamíferos proporcionaría más apoyo experimental para el control epigenético de las células de tipo específico de la expresión de miR-200c. El cluster genómico que contiene toda MIR-MIR-200c y 141 está bien conservada entre el genoma humano y el ratón. Similar a la /141 región genómica humana MIR-200c, el mir-200c /141 región genómica del ratón también contiene una isla CpG (Figura 6A; longitud de 325 pb, GC% 66.77, O /E ratio 0,58, 19 CpG, p-valor 1,06 × 10
-10). Para evaluar un posible papel de la metilación del ADN en el control de miR-200c /141 en ratones, metilación de CpG y la expresión de los genes miARN se analizaron en las células epiteliales de ratón (epidermis de SKH-1 líneas de células de ratón y de queratinocitos 308 y 6R90) y fibroblastos de ratón ( líneas de células NIH 3T3, NIH 3T6, y NR6). Un amplicón MassARRAY fue diseñado para analizar el estado de metilación del ADN de la homóloga del ratón MIR-200c /141 región a la analizada en humanos (Figura 6A). resultados sorprendentemente similares para miR-200c se encontraron entre las células humanas y células de ratón. Ratón queratinocitos expresaron niveles significativos de miR-200c, mientras que los fibroblastos de ratón no expresaban niveles detectables de miR-200c (Figura 6B). el análisis de metilación del ADN por MassARRAY reveló que los queratinocitos miR-200c-positivos mostraron la metilación del ADN mínima en la isla CpG mir-200c, mientras que los fibroblastos de ratón miR-200C-negativos mostraron extensa metilación del ADN de todos los sitios CpG en la región (Figura 6B) . La conservación significativa en la secuencia de ADN, los patrones de tipo de células específicas de metilación del ADN, y los patrones de expresión asociada miR-200c entre los genomas humano y del ratón, que están separadas por 75 millones de años de evolución [22], proporciona evidencia de que los mecanismos epigenéticos juegan un papel funcional en el control de la expresión de miR-200c.
a. Diagrama del intervalo genómico de ratón MMU-mir-200c. La barra superior muestra el área analizada por MassARRAY. Las regiones que codifican las horquillas de miR-200c y miR-141 y el inicio de transcripción putativo (TSS) deducido del ratón pista EST muestra en el navegador UCSC genoma se muestran, y cada círculo en esta pista representa la ubicación de un dinucleótido CpG. Similar a la HSA-mir-200c humano, el ratón MMU-mir-200c contiene una isla CpG, identificado por el programa CpG Cluster. La regla en la parte inferior muestra la ubicación en el cromosoma 6 del ratón de acuerdo con genoma mm.9 montaje. Los genes se codifican en la cadena (-). B. Las células de ratón muestran un patrón específico tipo de célula similar en la expresión de miR-200c a las células humanas y esta expresión está relacionada con el estado de metilación del ADN de la isla CpG. El panel izquierdo muestra la expresión de miR-200c en las células epiteliales de ratón (308, 6R90, SKH-1 epidermis) y líneas celulares de fibroblastos de ratón (NIH 3T3, NR6, NIH 3T6) detectada por PCR en tiempo real. El panel derecho muestra el nivel de metilación de la región de las islas CpG MIR-200c en las mismas muestras de ratón. El nivel de metilación de CpG unidades individuales dentro del amplicón MassARRAY se muestra como un mapa de calor con el más bajo de metilación en amarillo y el más alto de metilación en azul. El eje x representa las unidades de CpG individuales. unidades CpG dentro MassARRAY amplicón se numeran en sentido inverso, con CpG 1 que se encuentra dentro de la secuencia de codificación de miR-200c.
En resumen, nuestros resultados proporcionan múltiples líneas de evidencia que los mecanismos epigenéticos están implicados en el regulación de miR-141 200c expresión /tanto en células normales y cancerosas. En primer lugar, existe una correlación inversa entre la expresión consistente y estados de metilación del ADN en tipos de células humanas y de ratón normales, así como líneas celulares de cáncer de mama y próstata humanos. En segundo lugar, existen diferentes códigos de histonas entre miR-200c /141 expresar y células que no expresan que reflejan con precisión la expresión y los estados de metilación del ADN. En tercer lugar, el modificador de la epigenética 5-aza-2'- desoxicitidina alivia la represión de miR-200c /miR-141 en líneas celulares de cáncer. En cuarto lugar, la relación entre la metilación del ADN y de expresión de estados se produce a través de especies de mamíferos, ya que se observa en humanos y de ratón. Tomados en conjunto, estos resultados indican que el miR-200c /141 es un racimo miARN epigenetically lábil conservadas evolutivamente.
La desregulación de miR-200c y miR-141 se produce en múltiples tipos de cáncer [5], [11], [ ,,,0],20], [21], [23], [24], [25], [26], y esto implica un compromiso desregulación del estado epigenético de la isla CpG asociada con el miR-200c y miR141. Los resultados sugieren que estas células de carcinoma pueden cooptar
de novo
vías de metilación del ADN implicadas en el control epigenético de genes específicos del tipo de células normales, como las que rigen el estado epigenético de miR-200c /miR-141 . Un cooptación aparente similar de tipo celular vías de metilación del ADN específica por las células cancerosas también se observa en los genes codificantes de proteínas, tales como
maspin Opiniones y
14-3-3 sigma
[27] , [28]. En conjunto, estos resultados sugieren que las vías responsables de la creación o el mantenimiento de los tipos específicos de los estados de metilación del ADN de células normales pueden ser interrumpidos durante la carcinogénesis
.
Dado que el miR-200c y miR141 juegan un papel importante en la EMT y, por tanto, la identidad celular, la interrupción de los mecanismos que gobiernan los patrones de metilación de ADN específica de tipo celular durante la carcinogénesis probable podría efectuar la expresión de miR-200c y miR141 y proporcionar plasticidad fenotípica a las células cancerosas. Apoyo de esta posibilidad viene de los fenotipos de las células cancerosas analizadas en este estudio. Los cuatro de las líneas celulares de cáncer de mama que se perdieron miR-200c y miR-141 tienen una expresión de miR-141 200c isla aberrantemente metilados /CpG, y cada una de estas líneas celulares muestra un fenotipo mesenquimal [11], [29]. Por el contrario, esas líneas celulares de cáncer de mama que expresan el miR-200c y miR-141 y tienen una isla CpG no metilado muestran un fenotipo epitelial [11], [29]. El panorama es similar en las líneas celulares de cáncer de próstata. Las células PC3 que han perdido el miR-200c y la expresión de miR-141, muestran una isla aberrantemente metilados CpG y un fenotipo mesenquimal, mientras LNCaP y Du145 conservan miR-200c y miR-141 expresión y un fenotipo epitelial [11], [30] . Estos resultados sugieren que la metilación del ADN puede controlar los cambios fenotípicos observados en las células cancerosas.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y cultivo celular
vida finita pre-estasis HMEC a partir de muestras 184 (lote D), 48R (lote T), y 240L (lote B), se derivan de la reducción de tejido mamoplastia de las mujeres de 21, 16, y 19 respectivamente. Las células se iniciaron como organoides en cultivo primario en un medio M85 que contiene suero suplementado con oxitocina (Bachem) en 0,1 nM, y se mantuvieron en medio suplementado con M87A oxitocina y la toxina del cólera a 0.5 ng /ml [31]. Los fibroblastos de muestras 184, 48, y 240 L se obtuvieron a partir del mismo tejido mamoplastia de reducción y se cultivaron en DMEM /F12 con 10% de FBS y 10 mg /ml de insulina [31] y propagado más en DMEM /F12 con 10% de FBS. Se obtuvieron células epiteliales de la próstata de Clonetics (San Diego, CA), y queratinocitos de la piel fetales de Cell Applications (San Diego, CA.) y se cultivaron de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Fibroblastos de prepucio humano (HFFS) se mantuvieron y se cultivaron por el Centro de Cáncer de Arizona de cultivos celulares de servicios compartidos. los fibroblastos del estroma de próstata humano (PSF) fueron fueron cultivadas como se describe anteriormente [32]. líneas celulares de cáncer de mama BT549, Hs578T, MCF7, MDA-MB-157, MDA-MB-231, MDA-MB-453, MDA-MB-468, UACC893, UACC1179, UACC2087, y UACC3199 se cultivaron como se ha descrito anteriormente [33] , [34]. Próstata líneas celulares de cáncer PC3, PC3 B1, LNCaP y DU145 [35], [36], [37] se mantuvieron en RPMI 1640 que contiene 10% de suero bovino fetal suplementado con 100 unidades /ml de penicilina y 50 mg /ml de estreptomicina. líneas de células de queratinocitos de ratón 308 y 6R90 se cultivaron como se describe [38], las líneas celulares de fibroblastos de ratón NIH 3T3, NIH 3T6 y NR6 [39], [40], [41] se mantuvieron en medio DMEM que contenía suero bovino fetal al 10%. muestras de epidermis SKH-1 de ratón fueron retirados de presión de nitrógeno líquido congelado piel dorsal mediante el raspado de hielo seco.
miARN preparación biblioteca, secuenciación y análisis
El ARN total fue extraído por medio de Trizol. La fracción de ARN pequeño se purificó en un gel de poliacrilamida-urea 15%. Un adaptador de preadenylated se ligó al extremo 3 'del ARN pequeño seguido por la purificación del producto de ligadura en un gel de PAA-urea 15%. Un específico 5 adaptador 'Illumina se ligó y el producto se purificó en un gel de PAA-urea 10%. ARN pequeño con adaptadores ligado se transcribe de forma inversa en ADN usando un cebador de RT con la extensión específica Illumina. cDNA fue entonces amplificado por PCR usando cebadores específicos Illumina y el producto de PCR se purificó en un gel de agarosa al 3%. bibliotecas pequeñas de ARN se sometieron a secuenciación de Illumina para NCGR (Santa Fe, Nuevo México). Lee de Illumina GAII fueron asignadas al genoma humano hg18 asamblea mediante el programa Novoalign (www.novocraft.com). La salida de Novoalign se analizó adicionalmente en R (http://www.r-project.org). Los recuentos de miRNAs individuales se normalizaron para el tamaño de la biblioteca media (3,926,984 recuentos).
aislamiento de ácidos nucleicos
ARN se aisló utilizando Trizol (Invitrogen) o el kit RNeasy Mini (Qiagen) y se cuantificó por mediciones de absorción a 260 nm. El ADN genómico se aisló utilizando el kit DNeasy de Sangre y Tejidos (Qiagen) y se cuantificó por espectrofotometría.
-PCR en tiempo real la detección de los genes miARN
detección por PCR en tiempo real de microRNAs se llevó a cabo, en principio, como se describe [42]. La transcripción inversa se realizó usando TaqMan transcripción reversa Reactivos (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). PCR en tiempo real se llevó a cabo en un sistema ABI Prism 7500 Sequence sistema de detección (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) utilizando Perfecta SYBR Green Supermix, Low ROX (Quanta Biosciences, Gaithersburg, MD, EE.UU.) con un C desnaturalización 95 ° para 3 minutos seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos y 60 ° C durante 45 segundos. Las diferencias en la expresión se determinaron utilizando el método comparativo Ct se describe en el manual del usuario en relación con ABI let-7a. Primer secuencias se enumeran en la Tabla S1.
CpG predicción isla
islas CpG se prevé utilizar el programa CpGcluster [16]. Este programa utiliza un enfoque estadístico para buscar regiones con un enriquecimiento significativo de dinucleótidos CpG en lugar de parámetros dentro de una ventana deslizante. Hemos establecido el umbral al 50 (distancia media) y p-valor de corte de 10
-8.
análisis de metilación del ADN por MassARRAY
Se realizó un análisis de metilación del ADN por MassARRAY como se describe [ ,,,0],43]. Primer secuencias se enumeran en la Tabla S1.
tratamiento
5-aza-2'- desoxicitidina
Las células fueron tratadas con 3 M 5-aza-2'- desoxicitidina (Sigma, St Louis, MO , EE.UU.) durante 96 h, tal como se describe anteriormente [44].
inmunoprecipitación de la cromatina
La cromatina immoprecipitation (cHIP) análisis se realizó tal como se describe anteriormente [33], [45], [46] con anticuerpos contra la histona H3 acetilada (# 06-599, Millipore), histona H3 K4 trimethylated (# 05-745, Upstate), histona H3 K9 dimethylated (CS200587, Millipore), y la histona H3 trimethylated K27 (# 07-449, Millipore ). Cantidades iguales (1 ng) de chip y de entrada de ADN se utilizaron para el análisis de PCR en tiempo real. Se diseñaron los cebadores para su uso con la Biblioteca de Conjunto Humana Universal Probe (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, EE.UU.). PCR en tiempo real se llevó a cabo en un sistema ABI Prism 7500 Sequence sistema de detección (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) utilizando Perfecta qPCR Supermix, Low ROX (Quanta Biosciences, Gaithersburg, MD, EE.UU.) con una desnaturalización de 95 ° C durante 3 minutos, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos y 60 ° C durante 45 segundos. Primer secuencias se enumeran en la Tabla S1.
Información de Apoyo
figura S1.
evaluación de PCR en tiempo real de miR-141 expresión en tipos de células normales. El panel izquierdo muestra la expresión de miR-141 en tres pares isogénicas de las células epiteliales mamarias (HMEC) y fibroblastos mamarias (FB). El panel derecho muestra la expresión de miR-141 en las células epiteliales de la próstata humana (PREC), los fibroblastos del estroma de la próstata (PSF), los queratinocitos humanos de la piel (Kcytes) y fibroblastos de la piel (HFF). Los datos están normalizados con respecto a let-7a, que se expresa en niveles consistentes entre diferentes muestras de acuerdo con los datos de secuenciación de ARN pequeños
doi:. 10.1371 /journal.pone.0008697.s001 gratis (0.13 MB TIF)
Figura S2.
la metilación del ADN de la isla CpG MIR-200c se correlaciona inversamente con la expresión de miR-200c en muestras humanas normales. Esta figura resume los datos mostrados en la Figura 1B y 2B. El panel superior muestra la expresión de miR-200c detectado por PCR en tiempo real. El panel inferior muestra el nivel de metilación del MIR-200c región de las islas CpG en las mismas muestras humanas. El nivel de metilación de CpG unidades individuales dentro del amplicón MassARRAY se muestra como un mapa de calor con el más bajo de metilación en amarillo y el más alto de metilación en azul. El eje y marca las unidades de CpG individuales
doi:. 10.1371 /journal.pone.0008697.s002 gratis (0.19 MB TIF)
Figura S3.
evaluación de PCR en tiempo real de la expresión de miR-141 en líneas celulares de cáncer de mama y próstata. El panel izquierdo muestra la expresión de miR-141 en once líneas celulares de cáncer de mama humano. El panel derecho muestra la expresión de miR-141 en cuatro líneas celulares de cáncer de próstata humano
doi:. 10.1371 /journal.pone.0008697.s003 gratis (0.14 MB TIF)
figura S4.
expresión de miR-141 en líneas celulares de cáncer se reactiva mediante tratamiento 5-aza-2'- desoxicitidina. Las células se trataron con 3 M 5-AdC durante 96 h. El nivel de expresión de miR-141 se midió por PCR en tiempo real. Se muestra el promedio de 4 mediciones, las barras de error indican el error estándar de medición. Los valores se normalizaron a los controles sin tratar (100%)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0008697.s004
(0.06 MB TIF)
Figura S5.
histona H3 K27 estado trimethylation de la isla CpG MIR-200c.