Extracto
Se evaluó el mecanismo de generación de ROS mediada por la capsaicina en células de cáncer de páncreas. La generación de ROS estaba a punto de 4-6 veces más en comparación con el control y tan pronto como 1 h después de la capsaicina tratamiento en las células AsPC-1 BxPC-3 y, pero no en las células normales HPDE-6. La generación de ROS se inhibió por la catalasa y EUK-134. Para delinear el mecanismo de la generación de ROS, actividades enzimáticas de mitocondrial complejo-I y complejo-III se determinaron en las mitocondrias puros. Nuestros resultados muestran que la capsaicina inhibe aproximadamente 2,5-9% y 5 a 20% de la actividad del complejo I y 8-75% de la actividad del complejo-III en células BxPC-3 y ASPC-1, respectivamente, que era attenuable por SOD, catalasa y EUK-134. Por otro lado, el tratamiento de capsaicina no inhibir actividades complejas-I o complejo-III en células normales HPDE-6. Los niveles de ATP se suprimieron drásticamente por la capsaicina tratamiento tanto en las células BxPC-3 y AsPC-1 y atenuados por la catalasa o EUK-134. La oxidación de cardiolipina-mitocondria específica era sustancialmente más alto en células tratadas con capsaicina. BxPC-3 deriva ρ
0 células, que carecen de ADN mitocondrial, eran completamente resistentes a la capsaicina mediada por la generación de ROS y apoptosis. Nuestros resultados revelan que la liberación del citocromo c y la escisión tanto de caspasa-9 y la caspasa-3 debido a la interrupción del potencial de membrana mitocondrial se bloquearon de manera significativa por la catalasa y EUK-134 en BxPC-3 células. Nuestros resultados demuestran además que el tratamiento de capsaicina no sólo inhiben la actividad enzimática y la expresión de SOD, catalasa y glutatión peroxidasa sino que también reducen el nivel de glutatión. La sobreexpresión de la catalasa por transfección transitoria protegida de las células de la generación de ROS y la apoptosis mediada por la capsaicina. Además, los tumores de los ratones alimentados por vía oral con 2,5 mg /kg programa de capsaicina disminución de la actividad SOD y un aumento en los niveles de GSSG /GSH en comparación con los controles. Tomados en conjunto, nuestros resultados sugieren la participación de mitocondrial complejo I y III en la generación de ROS y la disminución de la capsaicina mediada en los niveles de antioxidantes que resulta en daño mitocondrial severa que conduce a la apoptosis en células de cáncer de páncreas
Visto:. Pramanik KC, SR Boreddy, SK Srivastava (2011) Papel de los complejos de la cadena de transporte de electrones mitocondrial en capsaicina mediada por estrés oxidativo conducen a la apoptosis en células de cáncer de páncreas. PLoS ONE 6 (5): e20151. doi: 10.1371 /journal.pone.0020151
Editor: Michael Polymenis, Texas A & amp; M University, Estados Unidos de América
Recibido: 14 de marzo de 2011; Aceptado: April 19, 2011; Publicado: 25-may 2011
Derechos de Autor © 2011 Pramanik et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional del cáncer, Institutos nacionales de Salud R01 CA129038; R01 CA106953. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas es uno de los más letales de todos los tumores malignos sólidos en los Estados Unidos [1]. Los esfuerzos se han dirigido hacia el desarrollo de terapias adyuvante y neoadyuvante en un intento de mejorar la tasa de supervivencia [1]. cánceres pancreáticos generalmente responden pobremente a las modalidades de tratamiento convencionales, tales como quimioterapia y la radioterapia [2]. Desafortunadamente, la toxicidad y la resistencia inherente de agente quimioterapéutico tal como 5-fluorouracilo (5-FU) y gemcitabina en el cáncer de páncreas son todavía razones de mal pronóstico [3]. No hay consenso en cuanto a agentes terapéuticos óptimos en el cáncer de páncreas, por lo tanto, el desarrollo de nuevos enfoques para prevenir y tratar el cáncer de páncreas es una misión importante. Los estudios epidemiológicos continúan apoyando la premisa de que la dieta rica en frutas, verduras y algunas especias pueden tener un efecto protector contra diversos tumores malignos humanos incluyendo el cáncer de páncreas y que el consumo de chiles puede proteger contra cánceres relacionados gastrointestinales-[4], [5], [6 ], [7], [8], [9], [10].
la capsaicina, un derivado del ácido homovanílico (N-vanillyl-8-metil-nonenamida) es un componente activo y picante de chile picante pimiento (Fig. 1A) [11], [12] y se ha utilizado como aditivo alimentario para mucho tiempo en todo el mundo, especialmente en los países del sur de Asia y América Latina [13], [14], [15], [16 ], [17]. Este alcaloide se ha utilizado para tratar el dolor y la inflamación, asociado con una variedad de enfermedades [18], [19], [20], [21]. Varios estudios recientes han demostrado que la capsaicina tiene un efecto antiproliferativo en gástrico hepática [22] [23] de próstata [24] de colon [25] y las células leucémicas [26]. La capsaicina generalmente ejerce su respuesta fisiológica mediante la estimulación del receptor vainilloide 1 (TRPV-1), sin embargo, los receptores de efectos independientes de la capsaicina se han observado en las células del cáncer [25], [26], [27]. La capsaicina suprime el crecimiento de las células cancerosas por el NF-kB inactivación, generaciones de ROS, la detención del ciclo celular y la modulación de EGFR /HER-2 vías [28], [29], [30], [31], [32], [33 ]. El mecanismo molecular exacto por el que la capsaicina provoca estrés oxidativo y la apoptosis sigue siendo vaga. Hemos demostrado anteriormente que la capsaicina inducida por la apoptosis en células de cáncer pancreático se asoció con la generación de ROS y la alteración mitocondrial [34]. Sin embargo, el mecanismo exacto por el cual la capsaicina provoca la generación de ROS y la muerte celular no estaba claro.
(
Un
) Estructura de la capsaicina. La apoptosis efectos de la capsaicina (150 m, 24 h) en la inducción (
B Opiniones) BxPC-3, (
C
) AsPC-1 y (
D
) HPDE- 6 células, se determinó utilizando anexina-V FITC y yoduro de propidio /y se analizaron por citometría de flujo. Los resultados se expresan como media ± desviación estándar (n = 4) de cuatro experimentos independientes. * Estadísticamente diferente en comparación con el control tal como se analizó mediante la prueba t de Student (
P & lt; 0,05
). (
E
) BxPC-3 células fueron tratadas con diferentes concentraciones de capsaicina durante 24 h, y (
F
) celulares fueron tratados en diferentes intervalos de tiempo con 150 mM capsaicina y se analizaron por inmunotransferencia para la escisión de la caspasa-9, caspasa-3 y PARP tal como se describe en Materiales y Métodos. Cada transferencia se desnudó y se volvió a sondear con anticuerpo anti-β-actina para garantizar la igualdad de proteínas de carga. Estos experimentos se realizaron tres veces independientemente con observación similar realizado en cada experimento.
En el presente estudio, hemos demostrado que la capsaicina provoca ROS (radicales superóxido y el peróxido de hidrógeno) mediante la inhibición de la generación mitocondrial complejo I y la actividad del complejo-III y los niveles de ATP en líneas celulares de cáncer de páncreas humano AsPC-1 BxPC-3 y, sin afectar BxPC-3 ρ
0 y normales HDPE-6 células derivadas. Al mismo tiempo, la catalasa y la actividad de la peroxidasa de glutatión y de expresión fueron suprimidos por la capsaicina tratamiento. Como complemento de las células con PEG-catalasa, PEG-SOD, EUK-134 (catalasa mimick) o transfección de las células con catalasa casi completamente bloqueado capsaicina mediada por la generación de ROS y apoptosis. Además, los tumores de /kg de capsaicina ratones tratados 2,5 mg mostraron una disminución de la actividad de SOD y un aumento en el nivel de GSSG /GSH. Este estudio proporciona una evidencia directa de cómo la capsaicina utiliza mitocondrias para causar estrés oxidativo que conduce a la apoptosis en células de cáncer de páncreas.
Resultados
La capsaicina desencadena la apoptosis en células de cáncer de páncreas, pero no en HDPE-6 normales células
La apoptosis se determinó por citometría de flujo utilizando anexina-V /FITC y yoduro de propidio. Tratamiento de BxPC-3 y AsPC-1 células con 150 mM capsaicina durante 24 h dio como resultado aproximadamente 2,5 a 5 pliegues aumento en la apoptosis (Fig. 1B-C). Curiosamente, la capsaicina no inducir apoptosis en células de HPDE-6 normales (Fig. 1D). La apoptosis efecto de la capsaicina inducir fue confirmado por Western Blot. Como se muestra en la Fig. 1E, el tratamiento capsaicina provocó una activación significativa de la caspasa-9, caspasa-3 y PARP como es evidente por sus respectivas divisiones de una manera dependiente de la concentración. Por otro lado, el tratamiento de capsaicina no causó ningún divisiones de caspasas o PARP en las células normales HPDE-6 (datos no mostrados). En un estudio que depende del tiempo, la escisión de la caspasa 9/3 y PARP fueron evidentes por 16 y 24 h de tratamiento de capsaicina (Fig. 1F).
La capsaicina provoca la generación de ROS mitocondrial en células de cáncer de páncreas
generación intracelular de ROS por la capsaicina se evaluó mediante citometría de flujo utilizando hydroethidine (HE) y DCFDA. Como se muestra en la Fig. 2A, en un estudio dependiente del tiempo, el tratamiento de capsaicina causó alrededor de 8-9 pliega aumento de radical superóxido dentro de 1-2 h que disminuyó por 24 h, medido por HE fluorescencia mediante citometría de flujo. Del mismo modo la generación de peróxido de hidrógeno tras el tratamiento capsaicina aumentó 4-7 de pliegues dentro de 1-2 h y luego disminuyó pero mantiene niveles más altos que superóxido por 24 h, medido por fluorescencia DCF por citometría de flujo (Fig. 2B). La generación de ROS estaba ya en 1 h en comparación con los controles en BxPC-3 células. Con el fin de ver si los antioxidantes pueden bloquear la generación de ROS, las células fueron pretratadas con PEG-SOD (100 U /ml), PEG-catalasa (500 U /ml) o 50 mM EUK -134 (una célula permeable catalasa mimético) antes de la capsaicina tratamiento. PEG-SOD bloqueada casi por completo la generación de radicales superóxido, mientras que PEG-catalasa generación de peróxido de hidrógeno completamente bloqueado como se mide por HE y la fluorescencia DCF, respectivamente, por cyometery flujo (Fig S1A-B). Para confirmar la especificidad de los antioxidantes, se utilizó PEG-catalasa para bloquear la generación de radicales superóxido. Como era de esperar, el PEG-catalasa falló completamente para bloquear la generación de radicales superóxido (Fig S1C). Del mismo modo, PEG-SOD en falso generación de peróxido de hidrógeno (datos no mostrados). En experimentos posteriores, se midió (+ peróxido de hidrógeno al radical superóxido) la generación total de ROS. Del mismo modo, el tratamiento de capsaicina aumentó la generación total de ROS en alrededor de 2.5 a 4.5 veces en las células AsPC-1 con el máximo a las 2 h de tratamiento (Fig. 2C). tratamiento capsaicina no causó la generación de ROS significativa en las células normales HPDE-6, lo que sugiere que las células normales son resistentes a los efectos de la capsaicina (Fig. 2D). En un tratamiento de combinación, nuestros resultados indican que el PEG-SOD, catalasa y PEG-EUK-134 sustancialmente bloqueado capsaicina mediada la generación total de ROS en células BxPC-3 (Fig. 2F).
(
A
) y (
B
) BxPC-3 células fueron tratadas con DMSO o 150 capsaicina mu M para los diferentes puntos de tiempo y se tiñeron con HE y DCFDA y se analizaron para el peróxido de hidrógeno y radicales superóxido, respectivamente, por citometría de flujo. (
C
) AsPC-1, (
D
) HPDE-6, (
E
) BxPC-3 ρ
0 células fueron tratadas con 150 mM capsaicina para 2, 4 y 24 h y se analizaron para la generación total de ROS (superóxido y peróxido de hidrógeno) por citómetro de flujo después de teñir las células con HE y DCFDA. Los resultados se expresan como media ± SD (n = 3) a partir de cuatro experimentos independientes y de datos representa veces de incremento de la generación de ROS por el control. * Estadísticamente diferente en comparación con el control como analizados por ANOVA de un factor seguido por el test post hoc de Bonferroni
P & lt; 0,05
). (
F
) Efecto de los antioxidantes sobre la capsaicina mediada por la generación total de ROS en células BxPC-3. Las células fueron tratadas con PEG-SOD (100 U /ml), PEG-catalasa (500 U /ml) o EUK-134 (50 M) durante 1 h, seguido de 150 mM capsaicina durante 2 h. Los resultados se expresan como media ± SD (n = 3) de cuatro experimentos independientes. * Estadísticamente diferente en comparación con el control (
P & lt; 0,05
) y ** estadísticamente diferente en comparación con el tratamiento con capsaicina (
P & lt; 0,05
), como analizados por ANOVA de un factor seguido por el post de Bonferroni -hoc prueba.
BxPC-3 derivada ρ
0 células eran completamente resistentes a la capsaicina mediada por la generación de ROS
para establecer firmemente la contribución de las mitocondrias en la generación de ROS por la capsaicina, generamos el ρ
0 variantes de BxPC-3 células. ρ
fueron generados y mantenidos por la incubación de BxPC-3 células con 60 ng /ml de bromuro de etidio y 50 mg /ml de uridina durante 12 semanas y se caracteriza por PCR para confirmar el agotamiento de ADNmt y normal phosphosrylation oxidativo como se informó anteriormente 0 células [35]. La supervivencia de ρ
0 células depende de ATP derivado de la glucólisis anaeróbica. ρ
0 células son incapaces de generar ROS del complejo ETC ya que carecen de la fosforilación oxidativa normal [35], [36]. En comparación con el tipo salvaje BxPC-3 células, la generación total de ROS no se observó en absoluto en BxPC-3 ρ
0 células después del tratamiento con capsaicina (Fig. 2E). Tomados en conjunto, nuestros resultados sugieren que BxPC-3 ρ
0 células eran totalmente resistentes a los efectos de la capsaicina en comparación con la de tipo salvaje BxPC-3 células.
tratamiento de capsaicina inhibe ETC Complejo-I y Complejo -III actividades
ETC complejos
mitocondriales son los principales generadores de ROS en células y tejidos. Desde que se observó la generación de ROS por la capsaicina, queríamos ver si las mitocondrias están involucrados en este proceso. Por lo tanto, se determinó la actividad enzimática y la expresión de mitocondrial complejo I, complejo-II, complejo-III y complejo-IV de la capsaicina tratado BxPC-3, AsPC-1, HDPE-6 y BxPC-3 ρ
0 células. tratamiento capsaicina inhibe la actividad de complejo-I en alrededor de 5 a 20% en BxPC-3 y 2,5-9% en las células AsPC-1, respectivamente, en comparación con los controles respectivos (Fig. 3A-B). Por otra parte, como se esperaba, la capsaicina no inhibir la actividad del complejo-I en BxPC-3 ρ
0 (células que carecen de DNA mitocondrial) y las células normales HPDE-6 (Fig. 3C). A continuación, hemos querido investigar si esta disminución en la actividad del complejo I puede ser atenuada por los anti-oxidantes. Nuestros resultados revelan que el tratamiento previo de las células con catalasa o EUK-134 bloquea sustancialmente las disminuciones en la actividad del complejo-I por la capsaicina (Fig. 3D). El tratamiento posterior de capsaicina disminuyó significativamente los niveles de proteína de complejo de proteína de complejo-I después de 4 h de tratamiento en un estudio dependiente del tiempo y de la catalasa o EUK-134 impedido este cambio (Fig. 3E-F). Del mismo modo, la actividad del complejo-III por la capsaicina fue inhibida por 8-75% tanto en las células BxPC-3 y AsPC-1 (Fig. 4A-B). No obstante, la capsaicina no logró disminuir la actividad del complejo-III en BxPC-3 ρ
0 células (Fig. 4C). Sin embargo, una modesta disminución en la actividad del complejo III se observó en células HPDE-6 por la capsaicina tratamiento (Fig. 4C). La disminución en la actividad del complejo-III en BxPC-3 células por la capsaicina fue atenuada por la catalasa y EUK-134 (Fig. 4D). De acuerdo con datos de la actividad, expresión de la proteína compleja compleja-III se redujo drásticamente en BxPC-3 células después del tratamiento con capsaicina (Fig. 4E). El efecto de la capsaicina en el nivel de proteínas de complejo-III fue abrogada por la catalasa y EUK-134 (Fig. 4F). Nuestros resultados muestran que el complejo mitocondrial-III está más involucrado en la generación de ROS mediada por la capsaicina en comparación con el complejo-I. La capsaicina no tuvo efecto sobre complejo-II y IV (datos no mostrados). Tomados en conjunto, estos resultados indican que la inhibición del complejo I mitocondrial y complejo-III de la capsaicina causa la generación de ROS.
Las actividades enzimáticas de complejo I mitocondrial se determinó en las mitocondrias puros aislados de control y 150 mM capsaicina tratado (
Una
) BxPC-3 y (
B Opiniones) células AsPC-1 para 2, 4 y 24 h. (
C
) Comparación de la actividad del complejo-I en AsPC-1, BxPC-3, BxPC-3 ρ
0 y HPDE-6 células tratadas con 150 mM durante 24 h. (
D
) capsaicina disminución mediada por la actividad del complejo-I fue impedida por el tratamiento previo de BxPC-3 células con catalasa (2000 U /ml) y EUK-134 (50 M) durante 1 h seguido por 150 M capsaicina para la 24 h. Los resultados se expresan por el control como media ± SD (n = 3) de tres experimentos independientes. * Estadísticamente diferente en comparación con el control (
P & lt; 0,05
) y ** estadísticamente diferente en comparación con el tratamiento con capsaicina (
P & lt; 0,05
), como analizados por ANOVA de un factor seguido por el post de Bonferroni -hoc prueba. (
E
) expresión de la proteína Complejo-I se determinó por inmunotransferencia utilizando proteína pura mitocondrial aislado de control y 150 mM capsaicina tratados BxPC 3-celdas para los períodos de tiempo indicado o (
F
) 1 h tratamiento pre con catalasa (2000 u /ml) o EUK-134 (50 M) seguido de 150 mM capsaicina para 24 h. Inmunotransferencia para cada proteína se realizó tres veces de forma independiente y se obtuvieron resultados similares. Las transferencias fueron despojados y reprobed con anti-Cox-IV para proteínas mitocondriales para garantizar la igualdad de proteínas de carga.
Se determinó la actividad mitocondrial-III complejo en la mitocondria puros aislados de control y 150 mM capsaicina tratado (
Un
) BxPC-3 y (
B
) células AsPC-1 para 2, 4 y 24 h. (
C
) Comparación de la actividad del complejo-III en AsPC-1, BxPC-3, BxPC-3 ρ
0 y HPDE-6 células tratadas con 150 mM capsaicina para 24 h. (
D
) capsaicina disminución mediada por la actividad del complejo-III fue atenuada por pre-tratamiento de BxPC-3 células con catalasa (2000 U /ml) o EUK-134 (50 M) durante 1 h seguido por 150 M capsaicina para la 24 h. Los resultados se expresan por el control como media ± SD (n = 3) de cuatro experimentos independientes. * Estadísticamente diferente en comparación con el control (
P & lt; 0,05
) y ** estadísticamente diferente en comparación con el tratamiento con capsaicina (
P & lt; 0,05
), como analizados por ANOVA de un factor seguido por el post de Bonferroni -hoc prueba. (
E
) expresión de la proteína-III complejo fue determinada por inmunotransferencia usando proteína mitocondrial puro aislado de control y 150 mM capsaicina tratados BxPC-3 células por períodos de tiempo indicados o (
F
) El tratamiento previo con catalasa (2000 u /ml) o EUK-134 (50 M) durante 1 h, seguido de 150 mM capsaicina para 24 h. Expresión de la proteína compleja-III se determinó por inmunotransferencia de las mitocondrias puros aislados como se describe en el método. Cada transferencia se desnudó y se volvió a sondear con anticuerpo anti-Cox-IV para garantizar la igualdad de proteínas de carga. Estos experimentos se realizaron tres veces independientemente con resultado similar obtenido en cada experimento.
Efecto de la capsaicina en la generación de ATP mitocondrial
Las mitocondrias son la fuente principal de energía para las células. El próximo querían saber si la capsaicina mediada por la interrupción de los complejos respiratorios mitocondriales afectó a la producción de ATP. Para determinar los niveles de ATP, se evaluó la actividad del complejo ATP-V sintasa en las mitocondrias aisladas de control y BxPC-3 y AsPC-1 en las células capsaicina tratada. La generación de ATP es a través de complejo-V en la mitocondria. tratamiento capsaicina agota los niveles de ATP en alrededor de 75% tanto en las células BxPC-3 y AsPC-1 en comparación con el control (Fig. 5A-B). También se observó que la catalasa y EUK-134 prevenirse significativamente la disminución de los niveles de ATP en respuesta a capsaicina tratamiento (Fig. 5C). Para confirmar aún más estas observaciones, la expresión del complejo de proteínas V-mitocondrial se determinó por Western Blot. Nuestros resultados ponen de manifiesto que el tratamiento con capsaicina disminuyó la expresión de la proteína compleja-V a partir tan pronto como 1 hora, pero fue más prominente a las 16 y 24 h (Fig. 5D). Esta disminución en la expresión compleja-V fue atenuada por la catalasa y EUK-134 (Fig. 5E). En general, nuestros resultados demuestran que el tratamiento con capsaicina altera drásticamente las funciones mitocondriales que empujan las células hacia la apoptosis.
(A)
(
B)
células BxPC-3 AsPC-1 se tratados con DMSO o 150 mM capsaicina durante 24 h, y (
C
) BxPC-3 células se trataron con catalasa (2000 u /ml) o EUK-134 (50 M) 1 h antes de 150 M capsaicina se determinó el tratamiento de 24 h y ATP-sintasa actividad en proteína pura mitocondrias aisladas de control y las células tratadas como se describe en la sección de método. Los resultados se expresan como media ± SD (n = 3) de tres experimentos independientes. * Estadísticamente significativo si se compara con el control o ** estadísticamente significativa en comparación con el tratamiento con capsaicina, como analizados por ANOVA de un factor seguido por el test post hoc de Bonferroni (
P & lt; 0,05
). (
D
) Efecto del tratamiento con capsaicina en la expresión de la proteína compleja-V. BxPC-3 células fueron tratadas con DMSO o 150 mM capsaicina durante periodos de tiempo indicados o (
E
) BxPC-3 células fueron tratadas con catalasa (2000 U /ml) o EUK-134 (50 M) durante 1 h antes del tratamiento con capsaicina 150 M durante 24 h. Expresión de la proteína compleja-V se determinó por inmunotransferencia de la proteína mitocondrial pura como se describe en la sección de método. Cada transferencia se desnudó y se volvió a sondear con anticuerpo anti-Cox-IV para garantizar la igualdad de proteínas de carga. Estos experimentos se realizaron tres veces independientemente con resultados similares obtenidos en cada experimento.
capsaicina interrumpe potencial de membrana mitocondrial y causar la oxidación de los lípidos mitocondrial
intracelular excesiva ROS llevan las células a la apoptosis por interrumpir el potencial de membrana mitocondrial. El cambio en el potencial de membrana mitocondrial por la capsaicina se determinó tanto mediante la tinción de la célula con membrana mitocondrial colorante sensible TMRM y se analizó por citometría de flujo. Se encontró que la capsaicina tratamiento disminuyó significativamente el potencial de membrana mitocondrial en BxPC-3 células en un 26% comparado con el control (Fig. 6A). Para confirmar si la capsaicina mediada por ROS causa el cambio en el potencial de membrana mitocondrial, se usaron catalasa y EUK-134. El pretratamiento de las células con ambos antioxidantes, seguido por la capsaicina completamente impedido la caída de potencial de membrana mitocondrial (Fig. 6A). Además, examinó la posibilidad si la capsaicina induce preferentemente la peroxidación lipídica mitocondrial en células BxPC-3. Para este propósito, las células se tiñeron con naranja de acridina nonil (NAO) para detectar la oxidación de cardiolipina, un componente lipídico de la membrana mitocondrial, por microscopía de fluorescencia y citometría de flujo [37]. La cardiolipina es exclusivamente presentes en las mitocondrias y después de ser marcado con NAO y exhibe fluorescencia amarilla. Cuando analizamos nuestras células bajo el microscopio de fluorescencia, se observó que casi todas las células del grupo de control se muestren un color amarillo. Sin embargo, la tinción amarilla disminuyó y se convirtió en verde en células tratadas con capsaicina que indica la oxidación drástica de cardiolipina (Fig. 6B). Sin embargo, la catalasa y la EUK-134 impide totalmente la oxidación de cardiolipina (Fig. 6B). Estos resultados se confirmaron por citometría de flujo, donde se observó que la capsaicina provoca la oxidación de cardiolipina en BxPC-3 células, como se muestra por un cambio de la fluorescencia NAO hacia la izquierda (Fig. 6C). Además, utiliza catalasa y EUK-134 para ver si la oxidación de cardiolipina se puede prevenir. Hemos encontrado que la adición de catalasa o EUK-134 bloqueó casi completamente el cambio de la tinción de NAO (Fig. 6C) lo que sugiere que la disminución de la fluorescencia NAO era debido a la oxidación de lípidos cardiolipina mitocondrial por ROS mitocondrial.
(
a
) BxPC-3 células se trataron con catalasa (2000 u /ml) o EUK-134 (50 M) durante 1 h, seguido de 150 mM capsaicina durante 24 h y el cambio en el potencial de membrana mitocondrial se determinó por tinción de la célula con membrana mitocondrial colorante sensible TMRM y se analizaron por citometría de flujo. panel derecho muestra la cuantificación del potencial de membrana mitocondrial. (
B Opiniones) Efecto de la capsaicina sobre la peroxidación lipídica mitocondrial. células BxPC-3 fueron tratados con catalasa (2000 U /ml) o EUK-134 (50 M) durante 1 h antes del tratamiento con 150 mM capsaicina para 24 h y se tiñeron con naranja de nonil acridina (NAO) para detectar la oxidación de cardiolipina, un componente lipídico de la membrana mitocondrial mediante microscopía de fluorescencia, y (
D
) citometría de flujo y el panel derecho muestra la cuantificación de la oxidación mitocondrial cardiolípide. resultado representativo de tres experimentos realizados independientemente. * Estadísticamente diferente en comparación con el control (
P & lt; 0,05
) o ** estadísticamente diferente en comparación con el tratamiento con capsaicina sola (
P & lt; 0,05
), según el análisis de ANOVA de una vía seguido de prueba post-hoc de Bonferroni.
apoptosis inducida por capsaicina es attenuable por anti-oxidantes
Hemos observado que la capsaicina provoca la generación de ROS mediante la interrupción de la función mitocondrial. Una vez que se interrumpen las funciones mitocondriales, el citocromo-c es liberado de las mitocondrias en el citosol y activar la caspasa-3 cascada que conduce las células en apoptosis. Nos preguntamos si la catalasa y EUK-134 podría derogar la apoptosis inducida por la capsaicina. Como se muestra en la Fig. 7A, PEG-SOD, catalasa y PEG-EUK-134 protegida significativamente BxPC-3 células de capsaicina apoptosis inducida. Estos resultados se confirmaron adicionalmente mediante la evaluación de la liberación de citocromo-c y la escisión de la caspasa-3 por el Western Blot. Nuestros resultados revelan que tanto la catalasa y EUK-134 prevenirse significativamente la liberación de citocromo-c en el citosol y la escisión de la caspasa-3 mediada por la capsaicina (Fig. 7C). Es de destacar que BxPC-3 ρ
0 células, que son incapaces de producir ROS a través de las mitocondrias, eran totalmente resistentes a la apoptosis efectos de la capsaicina inducir (Fig. 7B), lo que confirma la participación de la mitocondria en la capsaicina mediada por la generación de ROS y apoptosis.
(
A
) BxPC-3 células fueron pretratadas con PEG-SOD (100 u /ml), PEG-catalasa (500 u /ml) o EUK-134 (50 micras ) durante 1 h y después se trató con DMSO o 150 mM capsaicina durante 24 h, (
B
) BxPC-3 ρ
0 se trataron las células con DMSO o 150 mM capsaicina durante 24 h, y la apoptosis se determinado utilizando anexina-V FITC y yoduro de propidio /y se analizaron por citometría de flujo. Los resultados se expresan como media ± SD (n = 3) de tres experimentos independientes. * Estadísticamente diferente en comparación con el control (
P & lt; 0,05
) o ** estadísticamente significativa en comparación con el tratamiento con capsaicina (
P & lt; 0,05
), según el análisis de ANOVA de una vía seguido de Bonferroni de prueba post-hoc. (C) de citocromo-c y Cl-caspasa-3 se determinó por inmunotransferencia en células BxPC-3 pretratados con catalasa (2000 U /ml) o EUK-134 (50 M) durante 1 h antes del tratamiento con 150 mM capsaicina para 24 marido. Cada transferencia se desnudó y se volvió a sondear con anticuerpo anti-actina para garantizar la igualdad de proteínas de carga. Estos experimentos se realizaron tres veces de forma independiente y se obtuvieron resultados similares.
La capsaicina tratamiento altera la homeostasis redox celular que resulta en estrés oxidativo
Redox homeostasis en una célula es debido a un delicado equilibrio entre el intracelular de ROS y ROS barrido antioxidantes y sistemas de enzimas. Reducida GSH es un antioxidante intracelular y es conocido para mantener el equilibrio redox celular. por lo tanto, que mide los niveles de GSH intracelular y también se determinó los niveles de forma oxidada de GSH (GSSG). Como se muestra en la Fig. 8A, el tratamiento capsaicina aumentó significativamente los niveles de GSSG; y la disminución de los niveles de GSH que indican el cambio del equilibrio redox hacia el estado pro-oxidante (Fig. 8A-B). Los otros sistemas de enzimas que desempeñan papel en el equilibrio redox incluyen la superóxido dismutasa (SOD), catalasa y glutatión peroxidasa (GPx). Los radicales superóxido se generan por el complejo-I y complejo-III de la mitocondria y se convierten rápidamente en peróxido de hidrógeno debido a la dismutación de superóxido dismutasa. Como se muestra en la Fig. 8C, el tratamiento capsaicina inhibió la actividad de SOD 23-51% en un estudio en función del tiempo. Las otras dos enzimas (catalasa y GPx) participan en peróxidos intracelulares desintoxicantes incluyendo peróxido de hidrógeno. Nuestros resultados demuestran que la capsaicina reduce significativamente la actividad enzimática de catalasa dentro de 2 h de tratamiento (Fig. 8D). Estas observaciones fueron confirmadas por expresión de la proteína catalasa. Hemos observado que la expresión de la catalasa se redujo después de 2 h de tratamiento capsaicina (Fig. 8 D-E). A lo largo de nuestros estudios, se observó que la catalasa o la administración de suplementos EUK-134 prevenirse la generación de ROS y protegidos de las células de los efectos nocivos de la capsaicina, lo que indica claramente que la catalasa juega un papel crítico en la capsaicina mediada por el estrés oxidativo y la apoptosis en células de cáncer pancreático. Desde la glutatión peroxidasa es otra enzima importante que utiliza GSH como sustrato para desintoxicar el peróxido de hidrógeno, se determinó su actividad enzimática y expresión de proteínas. Como se puede ver en la Fig. 8 F-G, la capsaicina reduce la actividad de GPx y expresión en BxPC-3 células en respuesta al tratamiento capsaicina. De hecho, la expresión de la GPx se redujo significativamente justo después de 1 h de tratamiento capsaicina. En conjunto, nuestros resultados sugieren que el agotamiento de GSH nivel y la inhibición de SOD, catalasa y GPx por la capsaicina perturba la homeostasis redox celular que resulta en un aumento del estrés oxidativo.
(A) Efecto de la capsaicina sobre los niveles de glutatión oxidado (GSSG). células BxPC-3 fueron tratados con DMSO o 150 capsaicina mu M durante 2, 4 y 24 h y GSSG y (
B
) los niveles de GSH se determinaron utilizando un kit disponible en el mercado. Estos experimentos se repitieron dos veces con resultados similares obtenidos cada vez. (
C
) SOD, (
D
) catalasa, (
F
) GPx actividades se determinaron como se describe en la sección de método. células BxPC-3 fueron tratados con DMSO o 150 capsaicina mu M durante 2, 4 y 24 h. Los resultados se expresan como media ± SD (n = 3) de tres experimentos independientes. * Estadísticamente diferente en comparación con el control (
P & lt; 0,05
) como se analizó mediante ANOVA de un factor seguido por el test post hoc de Bonferroni.
(E) y (G)
Expresión de catalasa y GPx1 se determinaron por inmunotransferencia de las células BxPC-3 tratados con DMSO o 150 mM capsaicina para el período de tiempo indicado. Cada transferencia se desnudó y se volvió a sondear con anticuerpo anti-actina para garantizar la igualdad de proteínas de carga. Estos experimentos se realizaron tres veces de forma independiente y se obtuvieron resultados similares.
La expresión ectópica de la catalasa a proteger las células de la capsaicina mediada por la generación de ROS y apoptosis
Desde que se observó que la capsaicina mediada por la generación de ROS , el daño mitocondrial y la apoptosis fueron atenuadas por la catalasa o EUK-134, el próximo querían ver si la expresión ectópica de catalasa puede proteger las células del daño mediado por la capsaicina. Estamos transfectadas transitoriamente las células con plásmido que expresan catalasa y pudimos conseguir alrededor de 1,6 veces la sobreexpresión de la catalasa en comparación con el control de vectores (Fig. 9A). La disminución de la expresión de catalasa por tratamiento capsaicina fue bloqueada en las células transfectadas con catalasa (Fig. 9A). Además, la catalasa que expresan más de BxPC-3 células bloqueó completamente la generación total de ROS por la capsaicina y protegida de las células de la apoptosis en comparación con células transfectadas de vector tratado de capsaicina (Fig. 9B-C). La liberación del citocromo c y la escisión de la caspasa-3 también fue completamente bloqueada en las células que expresan más de catalasa (Fig. 9A). En la Fig.