Extracto
En estudios previos, parasporin-2Aa1, aislado originalmente de
Bacillus thuringiensis cepa A1547
, mostró ser citotóxica contra las células cancerosas humanas específicas, pero los mecanismos de acción no se estudiaron . En el presente estudio, se encontró que la proteinasa K activa la proteína parasporin-2Aa1 aislado de una novela
B Opiniones.
thuringiensis cepa
, 4R2, era citotóxico específicamente a endometrial, colon, hígado, cuello uterino, de mama y cáncer de próstata. Se mostró ninguna toxicidad contra las células normales. Tras el tratamiento con proteinasa activado-K parasporin-2Aa1, se observaron cambios morfológicos y análisis de transferencia Western reveló la escisión de poli (ADP-ribosa) polimerasa, caspasa-3 y caspasa-9 en líneas celulares de cáncer exclusivamente, indicativo de la muerte celular programada, apoptosis. Citometría de flujo análisis, usando yoduro de propidio y la anexina V, así como un caspasas 3/7 ensayo confirmó la inducción de apoptosis. Se realizaron otros análisis para estudiar las vías de supervivencia, incluyendo AKT, XIAP, ERK1 /2 y PAR-4, un conocido inductor de la apoptosis. Estos resultados indican que parasporin-2Aa1 es una proteína citotóxica selectiva que induce la apoptosis en varias líneas celulares de cáncer humano de diversos tejidos
Visto:. Brasseur K, P Auger, Asselin E, S Padres, Côté JC, Sirois M (2015) Parasporin-2 de un nuevo
Bacillus thuringiensis
4R2 deformación induce la activación de caspasas y apoptosis en células de cáncer humano. PLoS ONE 10 (8): e0135106. doi: 10.1371 /journal.pone.0135106
Editor: Ferenc Gallyas, Jr., Universidad de la Escuela de Medicina Pecs, Hungría
Recibido: April 9, 2015; Aceptado: July 16, 2015; Publicado: 11 Agosto 2015
Derechos de Autor © 2015 Brasseur et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. Este estudio fue financiado por el grupo de investigación UQTR interna. Kevin Brasseur era titular de una beca de doctorado de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR). Eric Asselin es titular de la Cátedra de Investigación en molecular gineco-oncología. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Bacillus thuringiensis
es una bacteria Gram-positiva que produce inclusiones cristalinas parasporales durante la esporulación. Estas inclusiones están hechos de proteínas, las delta-endotoxinas. Se clasifican en dos familias, el cristal (Cry) y las proteínas citolíticas (Cyt) codificadas por el
llorar
y
se sientan
genes, respectivamente [1,2]. Las proteínas Cry han sido ampliamente estudiados desde 1970 de debido a sus actividades insecticidas específicos contra lepidópteros, dípteros y coleópteros [3]. Después de la ingestión por un insecto susceptible, las inclusiones parasporales se solubilizan en el intestino medio del insecto alcalina, las protoxinas Cry se liberan y procesadas por proteasas del intestino medio para producir proteínas toxinas activadas. Estos se unen a receptores específicos localizados en la membrana de las células epiteliales intestinales, dando lugar a la formación de poros y en última instancia a la muerte del insecto [1,4].
El éxito del desarrollo y uso de
B Opiniones.
thuringiensis
basados en formulaciones para el control de plagas de insectos ha llevado al aislamiento de miles de cepas nuevas y cientos de proteínas Cry ahora se han caracterizado en diversos grados [5]. Varios estudios han demostrado que las proteínas Cry no insecticidas se distribuyen más ampliamente que las proteínas Cry insecticidas [6]. Esto condujo a la investigación de nuevos potencialmente actividades biológicas de las proteínas Cry no insecticidas. Tras una proyección grande, algunas proteínas Cry no insecticidas y no hemolíticas mostraron actividad citotóxica contra las células cancerosas humanas y estos nuevos
B Opiniones.
thuringiensis
toxinas fueron llamados parasporins [7,8]. Hasta el momento, seis familias de parasporins, PS1 -PS6, se han identificado [9]. Cada familia parasporin exhibe espectro y mecanismo de acción contra las células cancerosas humanas específicas
.
Parasporin-2Aa1 (PS2Aa1, también clasificada Cry46Aa1) producido por
B Opiniones.
thuringiensis serovar
Dakota
A1547 cepa ha sido intensamente investigado por su acción tóxica en las células cancerosas [9-11]. Cuando es activado por proteinasa K, PS2Aa1 es al menos 400 veces más tóxico para la línea celular de cáncer humano HepG2 (cáncer de hepatocitos humanos) que para la línea celular humana normal HC (hepatocito humano normal) y línea celular de cáncer humano HeLa (cervical uterino humano cáncer) [12]. En las células HepG2, la toxina monomérica parece unirse a una proteína de receptor desconocido situado en la balsa de lípidos [13]. Una vez unido al receptor, PS2Aa1 oligomeriza para permeabilizar la membrana que conduce a la formación de poros [11,12]. Una proteína anclada a glicosilfosfatidilinositol (GPI) parece estar implicado en la acción citocida eficiente de PS2Aa1 [13]. La formación de poros da como resultado alteraciones de las estructuras del citoesqueleto, la fragmentación de los orgánulos, alteraciones de la morfología de las células, tales como células de hinchamiento y, finalmente, la lisis celular [11]. El modo de muerte celular parece ser no-apoptóticos pero esta hipótesis no se confirmó [11-13]. Por lo tanto, la caracterización adicional de los eventos intracelulares implicadas en la muerte celular PS2Aa1 induced- era obligatorio para confirmar si o no la apoptosis estaba involucrado.
En el presente estudio, un adicional de
B Opiniones.
thuringiensis
cepa llamada
Bt
4R2, que contiene el gen que codifica la proteína Cry46Aa1 (PS2Aa1) ha sido estudiado para identificar los mecanismos implicados en la inducción de muerte celular citocida-dependiente. Se encontró que PS2Aa1 era muy citotóxico para muchas células cancerosas
in vitro
. Para profundizar en el mecanismo de la utilización de células de cáncer seleccionados a partir de tejido diferente (cáncer HepG2-hepatocitos, cáncer de PC-3 de la próstata y el cáncer de MCF-7-mama), se encontró que la muerte celular apoptosis se produce a través de las caspasas y poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) de escisión. También se encontró que PS2Aa1 muestra muy baja toxicidad para las líneas de células normales (IOSE-144, HIESC, HIEEC y MCF-10A).
Nos apoyan la hipótesis de la inducción de la apoptosis con la identificación de varios inhibición vía de supervivencia incluyendo AKT , XIAP, ERK1 /2 y la inducción del supresor de tumor PAR-4 después del tratamiento con PS2Aa1. También descubrimos que la inhibición de la vía /AKT PI3K en combinación con el aumento de la toxina, de manera sinérgica, la eficiencia de PS2Aa1 para inducir la apoptosis en células de cáncer. Por lo tanto, PS2Aa1 parece ser una apoptosis regulación de la toxina que mata células discriminar en diferentes células de cáncer humano.
Materiales y Métodos
Cepa bacteriana y la cultura de los medios
B
.
thuringiensis serovar
Dakota
cepa 4R2 se utilizó en este estudio. Se obtiene a partir del
Bacillus
Genetic Stock Center (Universidad Estatal de Ohio, Columbus, OH, EE.UU.). Las células bacterianas se cultivaron a 30 ° C en agar nutritivo de Sigma-Aldrich (St-Louis, MO, EE.UU.) a un pH de 7,1.
Células y condiciones de cultivo
línea celular de cáncer de hepatocito humano HepG2 (HB-8065), línea celular de cáncer de próstata humano PC-3 (CRL-1435), la línea colorrectal celular de adenocarcinoma epitelial humano Caco-2 (HTB-37), la línea celular de adenocarcinoma de cuello uterino epiteliales humanas HeLa (CCL-2), el útero humano la línea celular de adenocarcinoma de endometrio HEC-1A (HTB-112), el útero endometrio línea celular de adenocarcinoma humano KLE (CRL-1622), la línea celular de adenocarcinoma de mama humano MDA-MB231 (HTB-26), línea celular de cáncer de mama humano MCF-7 (HTB -22), las células epiteliales no tumorigénicas humanas MCF-10A (CRL-10317), la línea celular de adenocarcinoma de ovario epitelial humano OVCAR-3 (HTB-161) y la línea celular de adenocarcinoma de ovario epitelial humano Skov-3 (se obtuvieron HTB-77) de la American Type Culture Collection (ATCC). no tumorigénicos la superficie del ovario línea de células epiteliales humana inmortal IOSE-144 fue proporcionado amablemente por el Dr. David Hunstman (Columbia Cancer Research Center Británica, Vancouver, BC, Canadá). las células del estroma endometrial inmortales humanos HIESC y las células epiteliales endometriales humanas inmortales HIEEC eran una especie de regalo y producidos por el Dr. Michel Fortier (Centro Hospitalario de la Universidad Laval, Quebec City, QC, Canadá) [14]. células de carcinoma de ovario A2780 humanos fueron amablemente proporcionados por el Dr. Peter G. Raaphorst (Ottawa Regional Cancer Center, Ottawa, ON, Canadá). línea celular de adenocarcinoma de endometrio humano Ishikawa fue proporcionado amablemente por el Dr. Samuel Chogran (Universidad de Montreal, Montreal, QC, Canadá). HepG2, PC-3, las líneas de células HIEEC y HIESC se mantuvieron en RPMI 1640 que contiene 10% de suero bovino fetal y 50 mg /ml de gentamicina. OVCAR-3 líneas celulares MCF-7 y se mantuvieron en RPMI 1640 que contiene 10% de suero de crecimiento bovino y 50 mg /ml de gentamicina. línea celular MDA-MB-231 se mantuvo en RPMI 1640 que contiene 5% de suero de crecimiento bovino y 50 mg /ml de gentamicina. línea celular HEC-1A se mantuvo en medio de McCoy que contenía 5% de suero de crecimiento bovino y 50 mg /ml de gentamicina. línea celular SKOV-3 se mantuvo en medio de McCoy que contenía 10% de suero de crecimiento bovino y 50 mg /ml de gentamicina. HeLa, Ishikawa y líneas de células A2780 se mantuvieron en medio DMEM-F12 que contenía 2% de suero de crecimiento bovino y 50 mg /ml de gentamicina. línea de células MCF-10A se mantuvo en medio DMEM-F12 que contenía 5% de suero de crecimiento fetal, 20 ng /ml de EGF, 0,5 mg /ml de hidrocortisona, 100 ng de la toxina del cólera /ml, 10 mg /ml de insulina y 1X penicilina-estreptomicina. línea celular KLE se mantuvo en medio DMEM-F12 sin HEPES que contiene 10% de suero de crecimiento bovino y 50 mg /ml de gentamicina. línea celular Caco-2 se mantuvo en medio DMEM-F12 que contiene 10% de suero bovino fetal y 50 mg /ml de gentamicina. línea celular IOSE-144 se mantuvo en medio MCDB105 que contiene 10% de suero bovino fetal y 50 mg /ml de gentamicina. Todas las células se mantuvieron a 37 ° C con 5% de CO
2.
Aislamiento total de ADN
ADN total de
B Opiniones.
thuringiensis
4R2 fue aislada de un cultivo de una noche de 5 ml usando ADN QIAmp mini sangre kit (Qiagen, Toronto, ON, Canadá), de acuerdo con las instrucciones del fabricante para la extracción de ADN bacteriano.
amplificación por PCR
los primers utilizados en este estudio fueron diseñados en nuestro laboratorio de la
secuencia de nucleótidos del gen cry
46Aa1. Los cebadores para la amplificación por PCR fueron las siguientes:
Bt
4R2-2F: 5'-TAACCGGAGGGCTTCAAG -3 '(sentido) y
Bt
4R2-1R: 5'-TAATTCCCCCATTTTGGG -3' (antisentido ). PCR se llevó a cabo en un Applied Biosystems 2720 termociclador (Life Technologies, Ottawa, ON, Canadá). Las reacciones de PCR se realizaron en un volumen de 50 l que contiene 200μM cada uno de desoxinucleósidos trifosfato (dNTP), tampón de PCR 1X, 0,5μM de cada uno de los cebadores, 100 ng de ADN y 1,25 unidades de ADN Taq polimerasa. Todos los reactivos de la PCR eran de New England Biolabs (Ottawa, ON, Canadá). PCR se realizó por un paso inicial de desnaturalización a 94 ° C durante 5 min, seguido de 30 ciclos a 94 ° C durante 45 s, 50 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 2 min y una extensión final a 72 ° C durante 7 min. productos de la PCR eran de un tamaño separados en un gel de 1% de agarosa y se visualizaron utilizando SYBR-Safe (Invitrogen, Burlington, ON, Canadá) tinción sobre transiluminación UV.
secuenciación del ADN
amplicones fueron purificados utilizando el Mini Eluir PCR kit de purificación de Qiagen. Las reacciones de PCR purificados se resolvieron en un analizador de Genética 3130xl (Applied Biosystems), Ibis Plate-forme d'Analyses Génomiques (PAG) de l'Université Laval (Quebec, QC, Canadá). Se secuenciaron ambas hebras de la secuencia de ADN: La secuencia de 940pb se comparó con la función Ráfaga-N (Centro Nacional de Información sobre Biotecnología; www.ncbi.nim.nih.gov)
Preparación de proteínas activadas paraesporales
Bacillus thuringiensis cepa
4R2 se cultivó en placas de agar nutriente, se incubaron durante 4 días a 30 ° C hasta que la lisis celular. Las células se recogieron de las placas y se lavaron dos veces con agua destilada estéril. El sedimento que contiene el proteins- esporas-cristales se solubilizó en 500μL de tampón de solubilización que contiene 56mm Na
2CO
3 (pH: 11,4) y ditiotreitol 11 mM (DTT) durante 1 hora a 37 ° C. El material insoluble se sedimentó por centrifugación a 13 200 rpm durante 2 minutos y el sobrenadante se pasó a través de un filtro de membrana de 0, 22μm. 250μL del filtrado se transfirió a un tubo de centrífuga 1,5mL estéril y el pH se ajustó a 8 con 1 M Tris-HCl (pH 4,98).
Las proteínas solubilizadas fueron digeridos con cualquiera de proteinasa K (concentración final a 185μg /ml) o tripsina (concentración final en 300μg /ml) durante 1 h a 37 ° C. fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) se añadió (concentración final 1 mM) para detener el procesamiento proteolítico. Para confirmar la presencia de las proteínas parasporales, se realizó un análisis SDS-PAGE como se describe en otra parte [15] utilizando 4% de gel de apilamiento y 12% de gel de separación. Después de la electroforesis, el gel se tiñó con 0, 1% azul de Coomassie R-250 (Sigma-Aldrich). La concentración de proteína se determinó con el Bio-Rad Protein Assay DC (Bio-Rad Laboratories, Mississauga, ON, Canadá).
Ensayo de citotoxicidad
La actividad antiproliferativa de
B
.
thuringiensis
4R2 proteínas toxinas se evaluó mediante el ensayo MTT [16,17]. Brevemente, las placas se sembraron con 180μL de células normales y cancerosas en suspensión (por HIESC, 14 000; IOSE-144, 12 000; HIEEC, 15 000; Ishikawa, 16 000; HeLa, 16 000; KLE, 14 000; hectá- 1A, 12 000; Caco-2, 20 000, PC-3, 16 000; HepG2, 20 000; A2780, 16 000; OVCAR-3, 20 000; Skov-3, 14 000; MCF-7, 16 000; MDA-MB231, 12 000 y MCF-10A, 8000) en medio usando placas de 96 pocillos. Las placas se incubaron a 37 ° C, 5% de CO
2 durante 24 h. Recién solubilizado y activado
B Opiniones.
thuringiensis
4R2 proteínas toxinas (con proteinasa K o tripsina) en tampón de solubilización se diluyeron en medio fresco, y las alícuotas 100 pl que contiene concentraciones crecientes de las proteínas de la toxina (0μg /ml a 20 microgramos /ml) se añadieron y las placas se incubaron durante otra 24h. La concentración final de la memoria intermedia de solubilización (56mm Na2CO3, 11 mM de DTT, 100μg /ml de proteinasa K (o 30 mg /ml de tripsina) y PMSF 1 mM) en el medio de cultivo fue del 8% y se mantuvo constante en todo el experimento. Después de 24 h, 10μL de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT) (5 mg /ml en PBS) se añadieron a los pocillos. Cuatro horas más tarde, se añadieron 100 pl de la solución de solubilización (dodecil sulfato de sodio al 10% (SDS) en HCl 0,01) y las placas se incubaron durante la noche (37 ° C, 5% de CO
2). La densidad óptica se leyó usando un Fluostar optima BMG (BMG Labtech Inc., Durham, Carolina del Norte, EE.UU.) a 565 nm. Las lecturas obtenidas a partir de células tratadas se compararon con las mediciones de placas de células de control fijos en el día de tratamiento; y el porcentaje de inhibición del crecimiento celular se calculó para cada proteína de la toxina (proteinasa K activa o tripsina activa). Los experimentos se realizaron por triplicado. Los ensayos se consideraron válidos cuando el coeficiente de variación para un conjunto dado de condiciones y en el mismo experimento era & lt; 10%.
microscopía de luz de observación
Para la observación de los cambios morfológicos, normal (HIESC) y células cancerosas (PC-3, MCF-7 y HepG2) se observaron después del tratamiento con proteinasa 24h K activa proteínas de toxinas de 1 g /mL (MCF-7) o 2μg /ml (HIESC, PC-3 y HepG2). 10X y 20X aumentos fueron utilizados con una Olympus (modelo BX60) microscopio de luz (Carsen Group, Markham, ON, Canadá).
Los anticuerpos y reactivos
El Na
2CO
3, DTT, 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio bromuro, HCl, SDS, PMSF, Tris-HCl y proteinasa K se obtuvieron todos de Sigma-Aldrich. Todos los anticuerpos primarios se obtuvieron de Señalización Celular Tecnología (Bervely, MA, EE.UU.) a excepción de β-actina (Sigma-Aldrich). El anticuerpo secundario, conjugado de cabra-HRP anti-conejo eran compra de Bio-Rad Laboratories. Anexina V kit apoptosis /PI se adquirió de Invitrogen. MEK ½ inhibidor, U0126, se obtuvo de Señalización Celular Tecnología e inhibidor de PI3K, Wortmannina, se obtuvo de Sigma-Aldrich.
Western blot
células tratadas
PS2Aa1 se lavaron con PBS y se sometieron a lisis en tampón que contiene inhibidores de la proteasa (RIPA frío completos de Roche Applied Science, Laval, QC, Canadá) y el inhibidor de fosfatasa (PhosSTOP de Roche Applied Science) seguido por tres ciclos de congelación-descongelación. Cantidades iguales de lisados de células, determinadas usando ensayo de proteínas DC Bio-Rad, se separaron en geles de poliacrilamida (10-14%) y se transfirieron sobre membranas de nitrocelulosa (Bio-Rad). Las membranas se bloquearon en 5% de leche, PBS 1X, 0,06% de Tween 20 durante 1 h a temperatura ambiente, se sondaron con anticuerpo primario, se lavaron en PBS 1X, 0,06% de Tween 20 y se incubaron con anticuerpo secundario de rábano picante conjugada con peroxidasa (Bio-Rad ). La detección se realizó utilizando sustrato SuperSignal West Femto (Thermo Fisher Scientific, Nepean, ON, Canadá), como se describe por el fabricante utilizando sistemas UVP Bioimaging.
Medición de las células V /PI Anexina
FITC se utilizó anexina V /Dead Cell apoptosis Kit (Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, se recogieron las células tratadas, se lavaron con PBS y se diluyeron en 1X tampón de unión Anexina (100 l). Para cada muestra, 5 l de anexina V y 2 l de yoduro de propidio (PI) se añadieron a la suspensión celular y se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente. Se añadió un volumen 100 l adicional de tampón de unión de Anexina a cada muestra para un total de 200 l. Se analizaron las muestras (10 000 eventos) utilizando un flujo de Beckman Coulter FC500 citómetro Cytomics. Los análisis se realizaron utilizando el software de análisis CXP (Beckman Coulter, Mississauga, ON, Canadá).
caspasa ensayo de 3-7
Para medir la actividad específica de la caspasa 3 y 7, un kit de ensayo luminiscente se utilizó el nombre de la caspasa-Glo 3/7 de ensayo (Promega, Madison, WI, EE.UU.)). Este ensayo proporciona una proluminescent caspasa-3/7 sustrato que contiene una secuencia (DEVD) específica a la caspasa 3 y 7. Si las caspasas 3 y /o 7 están activos, el sustrato se escinde y se emitirá aminoluciferin. Brevemente, las placas se sembraron con 180μL de células normales y cancerosas en suspensión (por HIESC, 14 000; PC-3, 16 000; HepG2, 20 000 y MCF-7, 16 000) en medio. Las placas se incubaron a 37 ° C, 5% de CO
2 durante 24 h. Recién solubilizado y activado
B Opiniones.
thuringiensis
4R2 proteínas toxinas (con proteinasa K) en tampón de solubilización se diluyeron en medio fresco. A continuación, partes alícuotas de 100 pl que contienen la toxina, con o sin inhibidores, se añadieron y las placas se incubaron durante otra 24h. La concentración final de la memoria intermedia de solubilización (56mm Na2CO3, 11 mM de DTT, 100μg /ml de proteinasa K y 1 mM PMSF) en los medios de cultivo fue del 8% y se mantuvo constante en todo el experimento. Después de 24 h, se añadió 100 pl de la caspasa-Glo 3/7 reactivo a los pocillos. Una hora más tarde, la densidad óptica se leyó usando un Fluostar optima BMG (BMG Labtech Inc., Durham, Carolina del Norte, EE.UU.). Las lecturas obtenidas a partir de células tratadas se compararon con las mediciones de control de las células utilizando incrementos de plegado. . Cada experimentos se realizaron por duplicado
análisis estadísticos
Los datos fueron sometidos a ninguno de los análisis unidireccional de la varianza o la prueba t de Student (software Prism versión 5.00; GraphPad, San Diego, CA ). Las diferencias entre grupos experimentales, cuando se utiliza análisis unidireccional de la varianza, se determinaron por la prueba de Tukey. La significación estadística fue aceptada cuando p & lt; 0.05.
Resultados
Caracterización de la proteína cristalina de B. thuringiensis citotóxica 4R2
El análisis de SDS-PAGE de las proteínas cristalinas solubilizadas reveló una banda principal estimada en 37 kDa, que corresponde a la forma nativa de la proteína Cry46Aa1 (Fig 1). En los experimentos de PCR con cebadores específicos Cry46Aa1, se obtuvo un producto de amplificación de 940bp. Los análisis de la secuencia de nucleótidos utilizando herramientas de BLAST reveló que la secuencia de nucleótidos fue 100% homóloga con la proteinasa K activa secuencia de nucleótidos Cry46Aa1 (NCBI número de acceso AB099515.1). Debido a esta nucleótidos de identidad de secuencia, los 37 kDa de las proteínas de cristal
B Opiniones.
thuringiensis
4R2 fue nombrado PS2Aa1
(A) Carril 1:. Marcador de peso molecular; carril 2: solubilizado pro-PS2Aa1. secuencia (B) Los nucleótidos de la
llorar
fragmento del gen 46Aa1 obtenido tras la amplificación con el par de cebadores Bt4R2-2F y Bt4R2-1R.
citotoxicidad de PS2Aa1 en el cáncer y las células normales
La tripsina (utilizado como tratamiento de control) y las proteínas de cristal activado por proteinasa K a partir de
B Opiniones.
thuringiensis
4R2 (PS2Aa1) se examinaron para la citotoxicidad contra las células humanas normales y de cáncer utilizando MTT de ensayo para un 24 h de tratamiento (Fig 2). No se observó actividad citocida después de tratamiento con tripsina de las proteínas de cristal solubilizadas por cualquiera de las líneas de células. Entre las células ensayadas, proteinasa K proteínas cristalinas activado fueron altamente citotóxico para HepG2, MCF-7, KLE, HEC-1A, MDA-MB231 y células PC-3 mientras que ser moderadamente citotóxico para las células Caco-2. No se observó actividad citotóxica significativa en A2780, OVCAR-3, SKOV-3 y las líneas celulares de cáncer de HeLa. Ninguna de las líneas de células normales (IOSE-144, HIEEC, HIESC y MCF-10A) mostró efectos citotóxicos. La citotoxicidad de las proteínas de cristal era dependiente de la dosis y se examinó el uso de proteínas de serie de diluciones. Sobre la base de su alta sensibilidad a PS2Aa1, HepG2, se seleccionaron líneas de células PC-3 y MCF-7 de cáncer para más experimentos. Se utilizaron células HIESC como un modelo normal línea celular para estudiar más a fondo los efectos de PS2Aa1 sobre las células no cancerosas.
Las células normales humanas cultivadas (A) y células humanas cancerosas cultivadas (B) (2 X 10
4 células) se preincubaron a 37 ° C durante 20 h; se añadió la toxina se trata con tripsina (○) o proteinasa K (●) (concentraciones finales, 0.3μg /ml a 20 microgramos /ml) se incubaron adicionalmente durante 24 h. La proliferación celular se ensayó usando MTT.
Los cambios morfológicos en las células cancerosas inducidas por PS2Aa1
Para estudiar adicionalmente el efecto de PS2Aa1, las concentraciones de 1μg /ml de 2μg /ml se utilizaron basa en el experimento de la viabilidad celular anterior. Se observaron, PC-3 (2μg /ml) y MCF-7 células después del tratamiento por proteínas activadas PS2Aa1 proteinasa K en HepG2 (2μg /ml) (1μg /ml), las características morfológicas de las células tratadas con microscopía de luz (figura 3) . la contracción de la célula, característica de la muerte celular apoptótica [18], se observó sólo en HepG2, las células MCF-7 y PC-3 de cáncer. Sin embargo, no se observaron cambios morfológicos en HIESC; confirmando la no citotoxicidad de PS2Aa1 sobre las células normales como previamente observados con el experimento MTT. No se observaron cambios morfológicos de necrosis celular como hinchazón o formación de ampollas en [18].
PC-3 (A), las células MCF-7 (B), HepG2 (C) y (D) HIESC fueron tratados con 1μg /ml o 2μg /ml
B Opiniones.
thuringiensis
4R2 proteínas toxinas durante 24 h. Después de 24 h, las células se observaron al microscopio óptico con un aumento de 10X y 20X. Los resultados mostrados son representativos de tres experimentos independientes.
PS2Aa1 induce la muerte celular por mecanismos apoptóticos
Para confirmar nuestras observaciones anteriores relativas a los cambios morfológicos relacionados con la apoptosis se produce en las células cancerosas, se realizó anexina V /yoduro de propidio (PI) en el análisis de las células tratadas de la tinción. Anexina V tiene la capacidad de manchar fosfatidil serina en la cara externa de la membrana plasmática y su presencia en el exterior prospecto en lugar de la pared interna es una característica única de la apoptosis [19]. Los resultados mostraron que 6h y 24h después del tratamiento, PS2Aa1 inducidos alto nivel de apoptosis en las tres líneas celulares de cáncer (Fig 4A-4C) y muy poco en la línea endometrial normal de las células del cáncer de HIESC (Fig 4D) Esto está en correlación directa con el MTT los resultados del ensayo (Fig 2). La mayoría de las células de cáncer mostraron alto nivel de apoptosis después de 6 h de tratamiento que indica la alta eficiencia de PS2Aa1 en la inducción de apoptosis.
PC-3 (A), MCF-7 (B), HepG2 (C) y HIESC (D células) fueron tratados con
B Opiniones.
thuringiensis
4R2 proteínas toxinas (1μg /ml (B) o 2μg /ml (A, C, D)) durante 24 h. Anexina V y tinción PI se detectó por análisis de FACS. Los resultados son la media ± S.E.M. de tres experimentos independientes. * P & lt;. 0,05 en comparación con el modelo de las células tratadas correspondiente
Debido a PS2Aa1 induce alta toxicidad y gran cantidad de células son PI positiva sólo después de 24 horas, se decidió realizar un ensayo de caspasa-3/7 para comprobar si PS2Aa1 activa específicamente las caspasas -3 y -7 para inducir la apoptosis (Fig 5). Después del tratamiento 24h, PS2Aa1 aumentó significativamente la actividad de ambas caspasas -3 y -7 en líneas celulares de cáncer de HEPG2 PC-3 y (Fig 5A y 5C). línea celular de cáncer MCF-7 es la caspasa-3 deficiente y teniendo en cuenta esta deficiencia, únicamente la caspasa-7 se puede medir mediante este ensayo en esta línea celular [20]. Un aumento significativo de la actividad de caspasa se puede observar en la línea celular MCF-7 de cáncer que indica que la apoptosis inducida se compensa por la caspasa-7, implicado en el mecanismo de acción de PS2Aa1 (Fig 5B). Bajo nivel de muerte celular se observó anteriormente en HIESC normal de la línea celular por Anexina V /PI citometría de flujo y, en consecuencia, ningún aumento significativo de la actividad de caspasa-3/7 podría ser medido por el ensayo de la caspasa en HIESC (Fig 5D).
PC-3 (A), MCF-7 (B), las células HepG2 (C) y (D) HIESC fueron tratados con
B
.
thuringiensis
4R2 proteínas toxinas (2μg /ml) durante 24 h. El nivel de caspasas-3/7 se midió usando la caspasa-Glo 3/7 ensayo. Las células MCF-7 (B) son la caspasa-3 deficiente y sólo caspasa-7 se puede medir. * P & lt; 0,05 y ** P & lt;. 0,01 en comparación con el modelo de las células tratadas correspondiente
Para investigar más a fondo la inducción de la apoptosis, también medimos diferentes marcadores de apoptosis por Western blot como la caspasa-3 troceados, 8, -9 y se escindió PARP. Nuestros resultados muestran que, tan pronto como 6 h de tratamiento con PS2Aa1, se observó caspasa-3 escisión /activación tanto en las células PC-3 y HEPG2 cáncer (Fig 6A y 6C; MCF-7 siendo la caspasa-3 negativo). Una vez activado, la caspasa-3 es una caspasa efectora y puede hacer la escisión proteolítica en diversas proteínas, tales como la PARP proteína de reparación, a continuación, lleva a la muerte celular apoptótica. Sin embargo, la caspasa-3 requiere caspasas iniciadoras ya sea de la vía intrínseca o extrínseca al escindirse /activado [21,22]. Por Western blot, que mide exfoliados caspasa-8 (vía extrínseca) y se escindió de la caspasa-9 (vía intrínseca) y descubrimos que sólo la caspasa-9 de escisión /activación estaba presente en las tres líneas celulares de cáncer (Figura 6A-6C), mientras no se observó caspasa-8 de escisión /activación (datos no mostrados). En correlación con las caspasas escote, PS2Aa1 también inducida PARP división /degradación en las tres líneas celulares de cáncer (Figura 6A-6C). PARP escindida y se escindió de la caspasa-3 niveles de proteína son bajos después del tratamiento de 24 horas de la toxina en línea celular de cáncer HEPG2 (figura 6C). Esto es probablemente porque la mayoría de las células estaban muertos después de 6 h (& gt; 75%). Después de 24 horas de tratamiento, casi todas las células HepG2 fueron flotante y muertos (& gt; 92%). Las proteínas fueron probablemente todos degradada debido a la acción de las proteasas a finales de la apoptosis conduce a la proteína masiva y destrucción celular [23]. Esto se ve apoyado por los datos de MTT (Fig 2B) y Anexina V /PI citometría de flujo (Fig 4C y 4H) que indican que casi el 100% de las células están muertas a esta concentración después de 24 horas de tratamiento explicar la situación observada. Es también notable que ninguno de estos marcadores de la apoptosis se observó en la línea celular normal de HIESC (Fig 6D) que indica que no se estaba produciendo la apoptosis utilizando la dosis máxima de PS2Aa1 (2μg /ml) utilizado anteriormente en las líneas celulares de cáncer. Las bandas de Western blot visibles en el HIESC normal de la línea celular son el nivel basal de los diferentes marcadores, observable solamente después de la exposición para revelar las bandas de proteína correspondientes (Fig 6D). Esto está en concordancia con la ausencia de apoptosis y la actividad de caspasas-3/7 observado en los experimentos anteriores para la línea celular normal HIESC (Figs 4 y 5).
PC-3 (A), MCF-7 ( B), las células HepG2 (C) y (D) HIESC fueron tratados con
B Opiniones.
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4R2 proteínas toxinas (1-2μg /ml) durante 6 h y 24 h. Los niveles de proteínas escindidas-apoptosis específica de la caspasa-3, caspasa-9 y PARP se determinaron en las células tratadas utilizando el análisis de western blot. Las células MCF-7 (B) son deficientes en caspasa-3. ß-actina se utilizó como control de carga. Los resultados mostrados son representativos de tres experimentos independientes.
Reglamento de las diferentes vías de supervivencia y muerte en respuesta a PS2Aa1
Todos los experimentos anteriores demuestran que la toxina PS2Aa1 puede inducir la muerte celular en las células cancerosas a través de la inducción de apoptosis. Con el fin de investigar la posible participación de otras vías de supervivencia /muerte, hemos realizado experimentos adicionales sobre las células del cáncer de próstata PC3 utilizando análisis de Western blot. Lo primero que investigó la vía de supervivencia AKT conocido por ser un importante mecanismo de supervivencia de las células cancerosas. Las proteínas de la vía de AKT son a menudo alteradas en el cáncer y la señal de alta supervivencia de estas mutaciones son a menudo responsables de la resistencia de las células cancerosas a la terapéutica tratamientos y la imposibilidad de inducir apoptosis [24-28]. Nuestros resultados mostraron una alta disminución de (la forma activa) AKT fosforilada en la serina 473. Nivel total AKT también se redujo lo que sugiere que también es en parte responsable de la disminución del nivel de p-AKT. XIAP, un inhibidor de la caspasa y una ligasa de ubiquitina para PTEN (un regulador negativo de la fosforilación de AKT) también se redujo (Fig 7A) [29]. ERK1 /2, proteínas de la vía MAPK, requiere la activación /fosforilación de inducir la apoptosis en células de cáncer después del tratamiento con cisplatino o otros estímulos de apoptosis [30-32]. Como se observó en los tratamientos de cisplatino, PS2Aa1 indujo un aumento de ERK1 /2 fosforilación a las 24 horas después del tratamiento, mientras que el nivel total de ERK se alojaba estable (Figura 7B). Esto sugiere que se requiere la activación de ERK para la inducción de apoptosis. Por último, recientemente hemos descubierto un nuevo mecanismo relacionado con el supresor de tumor PAR-4 que se escinde por la caspasa-3 en los estímulos de apoptosis y es capaz de inducir apoptosis una vez escindido [33,34]. Debido a la capacidad PS2Aa1 para activar los mecanismos de apoptosis, nos preguntamos si PAR-4 escisión podría estar implicado en la inducción de apoptosis tras el tratamiento con la toxina. Curiosamente, un fragmento escindido de aproximadamente 25 kDa apareció tan pronto como 6 horas después del tratamiento con PS2Aa1 en su totalidad correlación con nuestra hipótesis (Fig 7C). La presencia del fragmento escindido PAR-4, normalmente presente sólo en las células de cáncer sometidos a apoptosis, refuerza la idea de que PS2Aa1 es un inductor de la apoptosis en células de cáncer.
PC-3 células de cáncer se trataron con la toxina Bt 4R2 proteínas (2μg /ml) durante 6 h y 24 h.