Extracto
Hemos demostrado previamente que un derivado de células del estroma factor 1 (SDF-1; CXCL12) sistema /CXCR4 está involucrado en el establecimiento de la metástasis en el cáncer oral. Recientemente, los pequeños ARN no codificantes, microRNAs (miRNAs) han demostrado estar involucrados en el proceso metastásico de varios tipos de cánceres. Sin embargo, los miRNAs que contribuyen a la metástasis inducidas por el sistema /CXCR4 SDF-1 en el cáncer oral son en gran parte desconocidos. En este estudio, se examinaron los miRNAs relacionados con metástasis inducidas por el sistema SDF-1 /CXCR4 utilizando B88-SDF-1 en las células de cáncer oral, que exhiben CXCR4 funcional y distante potencial metastásico
in vivo
. A través del análisis de microarrays miARN, hemos identificado la regulación al alza de miR-518c-5p en B88-SDF-1 en las células, y se confirmó la inducción por análisis de PCR en tiempo real. Aunque un inhibidor de miR-518c-5p basado-LNA no afectó el crecimiento celular de las células B88-SDF-1, se inhibió significativamente la migración de las células. A continuación, transfectadas un vector de expresión de miR-518c en las células parentales B88 y células de cáncer oral, CAL27 y transfectantes estables aisladas, células B88-518c y CAL27-518c, respectivamente. El crecimiento dependiente de anclaje y -independiente de transfectantes miR-518C fue significativamente mayor en comparación con el crecimiento de células simuladas. Por otra parte, se detectó el aumento de la migración de estas células. El inhibidor de miR-518c-5p basados en LNA deteriora significativamente el crecimiento celular mejorada y la migración de los transfectantes de miR-518C, lo que indica que estos fenómenos eran principalmente dependientes de la expresión de miR-518c-5p. A continuación, examinó la función de miR-518c-5p
in vivo
. transfectantes miR-518C o simulacros de transfectantes fueron inoculadas en el músculo masetero o de los vasos sanguíneos de ratones desnudos. El volumen del tumor, los ganglios linfáticos metástasis, y metástasis de pulmón se incrementaron significativamente en los ratones inoculados con los transfectantes miR-518C. Estos resultados indicaron que el miR-518c-5p regula el crecimiento y metástasis del cáncer oral como una diana aguas abajo del SDF-1 /CXCR4 sistema
Visto:. Kinouchi M, Uchida D, N Kuribayashi, Tamatani T, Nagai H, Miyamoto y (2014) Participación de miR-518c-5p al crecimiento y la metástasis en el cáncer oral. PLoS ONE 9 (12): e115936. doi: 10.1371 /journal.pone.0115936
Editor: Mohammad O. Hoque, Johns Hopkins University, Estados Unidos de América
Recibido: 11 Agosto, 2014; Aceptó 2 de diciembre de 2014; Publicado: December 23, 2014
Derechos de Autor © 2014 Kinouchi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación: Este trabajo fue apoyado por una subvención-en-Ayudas a la Investigación Científica (B; 25.293.411 y C; 26463046; http: //www.. jsps.go.jp/english/e-grants/grants01.html). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Hemos demostrado anteriormente que las células B88, que son células de cáncer oral que expresan el receptor de quimiocinas CXCR4, metástasis específicamente a los ganglios linfáticos cervicales a través de un factor derivado de células estromales (SDF) -1 gradiente producido por el estroma linfático [ ,,,0],1] - [3]. La expresión forzada de SDF-1 en las células B88 (nombrado células B88 1-SDF-) conferido mejora la motilidad celular y la metástasis pulmonar después de la inoculación intravenosa [4]. Recientemente, también hemos demostrado que la expresión de CXCR4 contribuye al potencial metastásico de cáncer de las glándulas salivales [5]. Además, también hemos demostrado que el bloqueo de CXCR4 con 1,1 '- [1,4-fenilen (metilen)] bis-1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano octahidrocloruro (AMD3100), un antagonista de CXCR4, puede ser un potente anti terapia -metastatic de cabeza y cuello cáncer relacionado CXCR4 [5], [6].
Aunque el sistema /CXCR4 SDF-1 funciona principalmente como un factor quimiotáctico en las células cancerosas a las semillas sitios metastásicos, los estudios recientes han demostrado que este sistema también regula el crecimiento tumoral, la interacción microambiente cáncer de células de tumor y la angiogénesis [7] - [10]. De hecho, para establecer las metástasis, varios procesos importantes, como la invasión, intravasación, extravasación y potencial de crecimiento ectópico, son indispensables. Por lo tanto, es crítico para investigar la función de objetivo (s) aguas abajo responsable del proceso de la metástasis en el sistema /CXCR4 SDF-1. microRNAs (miRNAs) son pequeños ARN no codificantes reguladoras que se unen al ARNm diana específicas, lo que lleva a la represión de traducción [11]. miRNAs están involucrados en la regulación de procesos biológicos, incluyendo el crecimiento celular, la diferenciación y la apoptosis, tanto en condiciones fisiológicas y durante enfermedades, como el cáncer [11]. La evidencia reciente ha indicado que los miRNAs juegan un papel crucial en el proceso metastásico de varios tipos de cáncer [11]. Sin embargo, los miRNAs que contribuyen a la metástasis inducidas por el sistema /CXCR4 SDF-1 en el cáncer oral son en gran parte desconocidos. Por lo tanto, en este estudio se analizaron los miRNAs objetivo regulados por el sistema /CXCR4 SDF-1 en B88-SDF-1 en las células utilizando microarrays miARN y se investigó su papel funcional en la metástasis en el cáncer oral.
Materiales y Métodos
Ética declaración
los ratones fueron tratados de acuerdo con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio de los Institutos nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Comité de Investigación Animal de la Universidad de Tokushima (Permiso Número: 11111). En pocas palabras, todos los animales fueron alojados en condiciones libres de patógenos, recibieron alimentos y agua ad libitum, y se mantuvieron en un ciclo de 12 h de luz /oscuridad en un cuarto con temperatura controlada apropiada. Toda la cirugía y la eutanasia se realizaron bajo anestesia con pentobarbital sódico, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. células B88 [1], [12] se establecieron originalmente de un paciente con cáncer de lengua en 1988. El Comité de Ética del Hospital de la Universidad de Tokushima renunciar a la necesidad de consentimiento en el uso de esta línea celular (Permiso Número: 453).
miARN análisis de microarrays
Pequeños ARN para el análisis de microarrays miARN fue extraído de las células B88-maqueta privadas de suero y células B88-SDF-1. Un microarray miARN se realizó y analizó en TORAY (Tokio, Japón), utilizando una matriz de 3D-gen humano (V16.1.0.0). Los datos en bruto de microarrays fueron depositados en la Expresión Génica Omnibus (GEO, http: //www.ncbi.nlm.nih.-gov/geo) de acuerdo con la información mínima sobre directrices para experimentos de microarrays (MIAME). El número de acceso es GSE59323.
Células y cultivo celular
células cancerosas orales fueron consideradas libres de micoplasmas y bacterias contaminantes. células CAL27 son células de cáncer oral que se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Rockville, MD). células B88 altamente metástasis a los ganglios linfáticos cervicales, cuando las células se inoculan en el músculo masetero de ratones desnudos, pero rara vez metástasis a los pulmones por la inoculación intravenosa [1], [4]. En contraste, las células CAL27 raramente metástasis a los ganglios linfáticos cervicales o los pulmones, cuando las células se inoculan en el músculo masetero o vena de la cola de ratones desnudos, respectivamente (observación no publicada). Las células se mantuvieron en Dulbecco Modificado Medio Eagle (DMEM; Sigma, St. Louis, MO) suplementado con 10% de suero de ternera fetal (FCS), 100 mg /ml de estreptomicina y 100 U /ml de penicilina en una atmósfera humidificada de 95% de aire y 5% de CO2 a 37 ° C.
ratones y
in vivo
estudio
ratones BALB /c desnudos fueron adquiridos de CLEA Japón (Osaka, Japón). Los ratones se mantuvieron en condiciones libres de patógenos. Los experimentos se iniciaron cuando los ratones eran de 8 semanas de edad y se realizaron como se describe anteriormente [1], [4]. Brevemente, las células se inocularon de forma ortotópica en el músculo masetero de ratones desnudos (2 × 10
6) o se inocularon en los vasos sanguíneos de ratones desnudos (1 × 10
6); los ratones se sacrificaron en el día 35. El volumen del tumor se estimó midiendo el tamaño del tumor y el uso de la siguiente fórmula: volumen del tumor = 1/2 × L × W
2, en la que L y W representan el diámetro más grande y el más pequeño de diámetro, respectivamente. La presencia o ausencia de ganglios linfáticos y metástasis a distancia fue confirmada por tinción de hematoxilina y eosina.
Transfección
Las células (5 × 10
5 células /placa) se sembraron en cultivo de 100 mm platos (Falcon, Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ) en DMEM suplementado con 10% de FCS. Veinticuatro horas después, las células se transfectaron con 5 g del vector de expresión de HSA-miR-518C o el vector control (Origene, Rockville, MD), utilizando Lipofectamine LTX (Life Technologies, Carlsbad, CA) a la concentración final de 50 pM. Las células se incubaron durante 24 h en DMEM que contenía 10% de FCS (V /V) y, posteriormente, se tripsinizaron y se sembraron (relación 01:05) en 100 mm platos de cultivo en medio DMEM que contiene 10% de FCS (V /V). Cuarenta y ocho horas más tarde, las células se colocaron en un medio selectivo que contiene geneticina (700 mg /ml de G418; Life Technologies). Después de la selección con G418 durante 2 semanas, todas las colonias fueron recogidos y las siguientes transfectantes estables se aislaron: B88-518c, B88-mock2, CAL27-518c, y las células CAL27 de forma simulada
RT-PCR cuantitativa.
Después de 24 h, el ARN se aisló de crecimiento logarítmico células con reactivo TRIzol (Life Technologies) según las instrucciones del fabricante. La transcripción inversa se realizó utilizando el Kit de TaqMan MicroARN RT (Life Technologies) o Kit miScript II RT (Qiagen, Hilden, Alemania). En la PCR cuantitativa, miR-518c-5p y miRNAs RNU6B se detectaron utilizando la Expresión Génica TaqMan ensayo (Life Technologies) o el Primer Ensayo miScript (Qiagen). productos específicos del gen se midieron continuamente por un sistema de PCR en tiempo real ABI StepOnePlus durante 40 ciclos de PCR. En algunos experimentos, las células fueron transfectadas con o sin 50 nM inhibidor miRCURY LNA microRNA (Exiqon, Vedbaek, Dinamarca) usando Lipofectamine RNAiMax (Life Technologies).
MTT ensayo
Las células se sembraron en una placa de 96 pocillos (Falcon; Becton Dickinson Labware) a 5 x 10
3 células por pocillo en DMEM que contiene 10% de FCS. Veinticuatro horas más tarde, las células fueron transfectadas con o sin 50 nM miRCURY LNA microRNA inhibidor usando Lipofectamine RNAiMax. Después de 24 o 48 h, el número de células se cuantificó mediante un ensayo usando MTT [3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio; Sigma].
in vitro
la migración de células de ensayo
El
in vitro
la migración de las células se evaluó utilizando cultivos polarizados (Corning, NY) como descrito anteriormente [1]. Las células enchufados en el poro o de las células unidas a la superficie inferior de la membrana se contaron en 10 campos de alto poder vista (x 400) por una tercera persona cegado a condiciones de tratamiento. En algunos experimentos, 50 nM miRCURY LNA inhibidor microRNA se transfectó antes se sembraron las células en la cámara superior.
ensayo de heridas
A las 24 h después de sembrar las células, una herida lineal fue generada el las monocapas confluentes por raspado con una punta de pipeta. células no unidas se lavaron con agitación. Las células se fotografiaron en el mismo punto en una cuadrícula de 48 h más tarde. Cada línea celular se sembró por triplicado e hirió
esferoide ensayo de formación de
Las células se sembraron en una placa de 96 pocillos (placa NanoCulture; SCIVAX Ciencias de la Vida, Woburn, MA). A 1 × 10
3 células por pocillo en DMEM que contenía inactivado por calor 10% de FCS. Veinticuatro horas más tarde, el fenotipo de las células fue observada por el microscopio de contraste de fase (x 300).
El análisis estadístico
Las diferencias significativas entre las medias para los diferentes grupos fueron evaluados con Statview 4.5 (Abacus Concepts, Berkeley, CA) usando ANOVA de una vía con una significación establecida en p. & lt; 0,05
resultados
el aislamiento de miR-518c-5p, que es inducida por el SDF 1 sistema /CXCR4
Hemos investigado miARN aguas abajo del sistema SDF-1 /CXCR4 usando la línea celular de cáncer de boca, B88-SDF-1, que tiene un sistema autocrino SDF-1 /CXCR4 y muestran el potencial metastásico distante
in vivo
[4]. Microarray análisis reveló que varios miRNAs se upregulated o downregulated en B88-SDF-1 en las células en comparación con células simuladas (datos no mostrados). Para confirmar la especificidad del análisis de microarrays, la expresión de los genes miARN fue confirmada por RT-PCR cuantitativa. Similar a los resultados de microarrays, miR-518c-5p (anteriormente llamado miR-518c *) expresión se reguló en B88-SDF-1 en las células en comparación con las células falsos (fig. 1A). Por otra parte, esta regulación al alza fue completamente abrogada por la transfección de un inhibidor de miR-518c-5p LNA (Fig. 1A). También se obtuvieron resultados similares en las células B88 parental estimulados con SDF-1 (fig. 1B).
(A) La expresión de miR-518c-5p fue confirmado en B88-B88-maqueta y SDF-1 células por PCR en tiempo real. La regulación a la baja de miR-518c-5p en las células B88-SDF-1 después del tratamiento con un inhibidor de LNA miR-518c-5p también fue confirmada. N.D .: no detectable. (B) La expresión de miR-518c-5p se confirmó en las células B88 parental después del tratamiento con o sin SDF-1 por PCR en tiempo real.
Efecto de la inhibición de miR-518c-5p en la célula crecimiento y SDF-1 /CXCR4 dependiente de la migración de células
Anteriormente, hemos encontrado que ni la paracrina ni el sistema autocrino /CXCR4 SDF-1 afectaron el crecimiento dependiente de anclaje de las células B88 [1], [4] . Se examinó el efecto de miR-518c-5p sobre el crecimiento celular mediante el uso de un inhibidor específico de LNA miR-518c-5p. El inhibidor no afectó el crecimiento de cualquiera de B88-mock o células B88-SDF-1 (Fig. 2A). A continuación se investigó el efecto de miR-518c-5p en el /la migración CXCR4 dependiente de SDF-1 de las células. ensayos de cámara de la migración revelaron que la movilidad mejorada de B88-SDF-1 células se vio afectada significativamente después del tratamiento con un inhibidor de miR-518c-5p LNA (Fig. 2B).
(A) El crecimiento de B88-simulacro células (lado izquierdo) y las células B88-SDF-1 (lado derecho) en la presencia de un inhibidor de LNA de control o un inhibidor de LNA miR-518c-5p se examinó usando un ensayo MTT. No hubo diferencias significativas entre los tres grupos por ANOVA de una vía. (B) La motilidad de las células B88-SDF-1 en presencia de un inhibidor de LNA de control o un inhibidor de LNA miR-518c-5p se examinó usando un ensayo de migración Transwell. Un total de 2 × 10
4 células fueron transfectadas antes de ser sembradas en la cámara. **;
p
. & Lt; 0,01 en comparación con las células de control tratados con inhibidor de LNA o de control no tratados por ANOVA de una vía
Efecto de la sobreexpresión de miR-518c-5p sobre el crecimiento celular
a continuación, se realizó un ensayo de ganancia de función de la sobreexpresión de miR-518c-5p en las células B88 de los padres y también en células CAL27 parentales en el que la expresión de CXCR4 y miR-518c-5p no era detectable. Después de la transfección del vector vacío o vector de expresión de miR-518c, se recogieron todos los clones resistentes a G418 para evitar la heterogeneidad clonal de las células y se establecieron los siguientes transfectantes, B88-mock2, B88-518c, CAL27-maqueta y CAL27-518c. Hemos podido detectar la regulación al alza de miR-518c-5p en los transfectantes miR-518C en comparación con las células simuladas, que fue completamente inhibida por el tratamiento con el inhibidor de miR-518c-5p LNA (Fig. 3A, B). El potencial de crecimiento dependiente de anclaje tanto de las células B88-518c y CAL27-518c fue significativamente mejorada en comparación con la de las células simuladas (Fig. 3C, D), que se inhibió significativamente por el tratamiento con el inhibidor de LNA miR-518c-5p (Fig. 3E, F). A continuación, se examinó el efecto de la sobreexpresión de miR-518c en el crecimiento independiente de anclaje de las células. células B88-mock2 redondas formado y apretados esferoides de adhesión célula-célula (Fig. 3G), mientras que las células formadas B88-518c esferoides vid similar (Fig. 3H). Por el contrario, ambos transfectantes CAL27 formadas redondas esferoides (Fig. 3I, J), pero no se observaron esferoides más grandes en las células CAL27-518c (Fig. 3J).
B88 y células CAL27 fueron transfectadas de forma estable con un control se aislaron células vector o un vector de expresión de miR-518c, y B88-mock2 o células CAL27 B88-518c y de forma simulada o CAL27-518c, respectivamente. (A, B) La expresión de miR-518c-5p en los transfectantes B88 (A) y CAL27-transfectantes (B) fueron evaluados por PCR en tiempo real. La regulación a la baja de miR-518c-5p en las células o células B88-518c CAL27-518c después del tratamiento con un inhibidor de LNA miR-518c-5p también fue confirmada. (C, D) el crecimiento dependiente de anclaje de las B88-transfectantes (C) y CAL27-transfectantes (D) se evaluó usando un ensayo MTT. *;
p Hotel & lt; 0,05, **;
p
& lt; 0,01 en comparación con células simuladas por ANOVA de una vía. (E, F) El crecimiento de las B88-transfectantes (E) y CAL27-transfectantes (F) en presencia de un inhibidor de LNA de control o un inhibidor de LNA miR-518c-5p se examinó usando un ensayo de MTT. *;
p Hotel & lt; 0,05, **;
p
& lt; 0,01 en comparación con células de control tratados con inhibidor de LNA o control no tratado por ANOVA de una vía. crecimiento (GJ) independiente del anclaje de B88-mock2 (G), B88-518c (H), CAL27-mock (I) o CAL27-518c (J) se evaluó usando una placa de nano-cultura.
Efecto de la sobreexpresión de miR-518c-5p sobre la migración celular
células B88-518c adquirido una respuesta chemokinetic significativa (Fig. 4A) y el aumento de la motilidad celular (Fig. 4B). También se detectó un aumento de la migración de las células CAL27-518c (Fig. 4C). La motilidad celular mejorada de las células B88-518c se vio afectada significativamente después del tratamiento con el inhibidor de miR-518c-5p LNA (Fig. 4D).
células (A) B88-mock2 o B88-518c se cultivaron a confluencia. Se realizó un ensayo de cicatrización de heridas. *;
p
& lt; 0,05 en comparación con células simuladas por ANOVA de una vía. (B, C) La motilidad de las células B88-518c (B) o células CAL27-518c (C) se evaluó utilizando un ensayo de migración Transwell. Cada transfectante se sembró a una densidad de 1 × 10
4. **;
p
& lt; 0,01 en comparación con células simuladas por ANOVA de una vía. (D) La motilidad de B88-transfectantes en presencia de un inhibidor de LNA de control o un inhibidor de LNA miR-518c-5p también se examinó usando un ensayo de migración Transwell. **;
p Hotel & lt; 0,01 en comparación con las células de control tratados con inhibidor de LNA o de control no tratados por ANOVA de una vía
El papel de miR-518c-5p en el crecimiento y la metástasis.
in vivo
Seguidamente, evaluó el efecto de miR-518c-5p en el crecimiento y metástasis in vivo. B88 y CAL27 transfectantes fueron inoculados ortotópicamente en el músculo masetero de ratones desnudos [1]. El tamaño del tumor primario de células B88-518c (Fig. 5A) y células CAL27-518c (Fig. 5B) se aumentó significativamente en comparación con los tumores procedentes de células simuladas. Aunque ambos transfectantes simulacros y miR-518C histopatológicamente metástasis a los ganglios linfáticos cervicales, el peso de los ganglios linfáticos que contienen transfectantes miR-518C fue significativamente más pesada que la de los ganglios linfáticos contienen células simuladas (Fig. 5C-E). A continuación realizó la inoculación intravenosa usando estos transfectantes. se detectaron numerosos y grandes nódulos metastásicos en los pulmones en todos los ratones inoculados con células B88-518c (Fig. 6A). El número de nódulos de los ratones inoculados con células B88-518c se aumentó significativamente en comparación con el número de células simuladas (Fig. 6B).
(A, B) B88-transfectantes (A) y CAL27-transfectantes ( B) fueron inoculados ortotópicamente en el músculo masetero de ratones desnudos, que fueron sacrificados a día 35. el tamaño de los tumores primarios se midió una vez a la semana. Los resultados presentados son las medias ± SD. *; p & lt; 0,05 en comparación con células simuladas por ANOVA de una vía. (C) Representante H & amp; E tinción de los ganglios linfáticos metastásicos de los ratones desnudos inoculados con células B88-mock2 (izquierda) y células B88-518c (derecha). (D, E) El peso de los ganglios linfáticos submandibulares se midió en los ratones inoculados con B88-transfectantes (D) y CAL27-transfectantes (E). *; p & lt; 0,05 en comparación con células simuladas por ANOVA de una vía
Las células se inocularon en los vasos sanguíneos de ratones desnudos, que fueron sacrificados en el día 35. (A) Representante H & amp;. E tinción de los pulmones de los ratones desnudos inoculados con células B88-mock2 (izquierda) y células B88-518c (derecha). (B) Los nódulos metastásicos se contaron bajo un microscopio. **, P. & Lt; 0,01 en comparación con las células simuladas por ANOVA de una vía
Discusión
miRNAs son pequeños, endógena, evolutivamente conservados ARN no codificantes que regulan aproximadamente el 60% de genes de mamífero por la modulación de sus niveles de transcripción. miRNAs están involucrados en muchas vías moleculares y en los procesos biológicos fundamentales que incluyen el crecimiento celular, el desarrollo, la diferenciación, la proliferación y la muerte celular [11]. La evidencia reciente ha demostrado el papel de miRNAs en la modulación del proceso metastásico en el contexto de tumores sólidos, y estos miRNAs se han denominado metastamir [13]. Numerosos metastamirs han sido identificados y tienen efectos pro y anti-metastásicos [11]. Sin embargo, es probable que haya muchos miRNAs que son metastamir con funciones desconocidas, porque 3% del genoma humano se estima que el código de secuencias de genes miARN [14]. En el presente estudio, hemos demostrado que el miR-518c-5p puede ser una novela metastamir metástasis promotoras. miR-518c-5p se identificó originalmente en los 250 bibliotecas de ARN pequeños de 26 sistemas de órganos diferentes y tipos de células de humanos y roedores, enriquecido en neuronal, así como células normales y malignas hematopoyéticas y tejidos [15]. Aunque la función de miR-518c-5p no se ha definido claramente en los cánceres, Dyrskjøt y sus colegas demostraron que el miR-518c-5p se asoció significativamente con la progresión de la enfermedad cuando se corrige el estadio de la enfermedad y el grado utilizando un análisis de regresión de Cox [16]. Por otra parte, las investigaciones recientes mostraron que el miR-518c-5p exhibió una regulación al alza significativa en el retinoblastoma en un análisis de microarrays miARN [17]. Tomados en conjunto con nuestros resultados actuales, miR-518c-5p puede funcionar como un oncomiR en las células tumorales.
En el presente estudio, se demostró que el miR-518c-5p está regulada positivamente por el sistema SDF-1 /CXCR4 de una manera paracrina o autocine. Rhodes y sus colaboradores investigaron los genes miARN expresión inducida por el sistema de SDF-1 /CXCR4 en células de cáncer de mama con receptor de estrógeno alfa-positivas [18]. Sin embargo, ni el miR-518c-5p ni otra miARN detectado en nuestro análisis de miARN estaban presentes en sus resultados. Por otra parte, si bien también se analizó el análisis de miARN microarrays en las células de cáncer de las glándulas salivales CXCR4-positivo, el CAC-M [19], después de la estimulación con SDF-1, no había ninguna miRNAs comunes entre los tres miARN análisis de microarrays a pesar de la utilización de el sistema SDF-1 /CXCR4 en estas células de cáncer (datos no mostrados). Este hallazgo puede ser debido a las diferentes condiciones experimentales de las células; sin embargo, puede ser debido a la diferente patrón metastásico específica de sitio de estas células de cáncer. Por ejemplo, los favores de cáncer de mama con metástasis al hueso, cáncer de la glándula salival en el pulmón y el cáncer oral a los ganglios linfáticos. Por lo tanto, miRNAs que son necesarios para homing al órgano diana específico pueden ser activados por CXCR4 en la unión del su ligando, SDF-1 en estas células de cáncer
.
El mecanismo de la regulación al alza miR-518c-5p por el SDF sistema de -1 /CXCR4 en células de cáncer oral no se aclaró en el presente estudio. miR-518c-5p pertenece a la familia de miR-515 en un clúster miARN cromosoma 19, llamado C19MC [20]. C19MC es el grupo más grande, conservado sólo en primates, la codificación 59 miRNAs maduros y presentan una expresión muy baja en la mayoría de los tejidos humanos debido al control epigenético [20]. Debido a que el sistema de SDF-1 /CXCR4 puede regular positivamente DNMT1 /DNMT3ß expresión [21] o ANP32A /Lanp, un componente del inhibidor de la histona acetil transferasa [22], la regulación positiva miR-518c-5p puede ser dependiente del resultado de la desmetilación de C19MC. Alternativamente, las investigaciones recientes han demostrado que algunos de los miembros miARN en C19MC fueron upregulated en el carcinoma hepatocelular caracterizado por IGF aberrante, fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) -Akt-mTOR o activación de la vía p53 [23], [24]. El sistema /CXCR4 SDF-1 también podría activar las vías PI3K-Akt en células B88 [1], y estas vías podría estar implicada en la regulación de miR-518c-5p. Además, examinó la expresión de miR-518c-5p usando una línea celular de cáncer oral, HNT, en el que la expresión de CXCR4 fue 7,5 veces menor que la de las células B88 [1], [3]. HNT-SDF-1 en las células exhibieron ligera, pero no significativa, los cambios fenotípicos
vitro
en y
in vivo
, en el que la activación de PI3K-Akt por SDF-1 no era detectable [ ,,,0],4]. Además, la inducción de miR-518c-5p en células HNT-SDF-1 fue detectable solamente en un nivel marginal, muy probablemente debido a la reducción de la expresión de CXCR4, en comparación con la de las células B88 (datos no mostrados). Por lo tanto, el nivel de expresión de CXCR4 y fuerte de señalización corriente abajo, tales como PI3K-Akt, también podrían ser críticas para la activación de la expresión de miR-518c-5p, por lo tanto, serían necesarios más estudios para aclarar este mecanismo.
en el presente estudio, el miR-518c-5p inducida por el sistema /CXCR4 SDF-1 no estimula el crecimiento celular, pero mejoró la migración de las células utilizando un inhibidor de la LNA. Por el contrario, se podría detectar tanto la estimulación del crecimiento y aumento de la migración después de la transfección de un vector de expresión de miR-518c,
in vitro
y
in vivo
. Aunque la razón no está clara, el hallazgo puede ser debido al efecto de miR-518c-3p producida por el vector de expresión de miR-518c. Sin embargo, no hemos podido encontrar informes anteriores sobre el miR-518c-3p en las células cancerosas y el crecimiento celular, y un inhibidor de LNA en contra de miR-518c-5p podría suprimir el crecimiento mejorado tanto en células B88-518c y CAL27-518c (Fig. 3E ,F). Por lo tanto, creemos que el efecto de miR-518c-3p en el crecimiento de las células podría ser parcialmente descuidado. La segunda posibilidad puede ser debido a la regulación a la baja de los mRNAs diana no fisiológicas o falsas que comparten una secuencia de semillas similares por la sobreexpresión de miR-518c-5p. Sin embargo, la sobreexpresión de miR-518c-5p por el oligonucleótido contrariamente inhibió el crecimiento y la migración de las células B88 y células CAL27, muy probablemente debido a la regulación a la baja de ARNm diana falso (datos no mostrados). Este resultado indica que la expresión de miR-518C utilizando el método de vector indujo una condición fisiológica y no tóxicos en estas células de cáncer oral. Por lo tanto, creemos que la inducción moderada de miR-518c-5p puede ser suficiente para la migración celular, pero fuerte inducción de miR-518c-5p puede ser necesaria para la inducción del crecimiento celular. Debido a que el
in silico
mRNA objetivos de miR-518c-5p incluyen varios tipos de genes que regulan el crecimiento y la metástasis (Tabla S1), tesis genes diana pueden controlar el efecto diferente de miR-518c-5p.
C19MC, incluyendo el miR-518c-5p, se asigna a la banda cromosómica 19q13.4 [20]. Kasamatsu y colegas demostraron que el locus 19q13.4 se amplifica en el carcinoma adenoide quístico de la glándula salival, un tipo altamente metastásica de cáncer de cabeza y cuello [25]. Además, la amplificación de este locus se detecta con frecuencia en ependymoblastoma y tumores embrionarios con abundante neuropil y rosetas verdaderos, los tumores embrionarios muy agresivas, a una tasa de 93% [26]. El sistema /CXCR4 SDF-1 juega un papel importante en el mantenimiento de la arquitectura de nichos para hematopoyéticas y otras células madre de tejido, tales como las células germinales y folicular, intestinal, y células madre neurales [27], [28]. Cabe destacar que la mayoría de las células madre del cáncer (CSC) expresan CXCR4 y responden a un gradiente quimiotáctico de SDF-1, lo que sugiere que las CSC, probablemente, representan una subpoblación capaz de iniciar la metástasis [29]. Además, varios grupos han vinculado recientemente a la expresión de los miembros de C19MC con la firma característica de miRNA de las células madre de embriones humanos [20]. Tomados en conjunto, C19MC, incluyendo el miR-518c-5p, podría expresarse en células madre cancerosas que están involucrados en el crecimiento y la metástasis.
Conclusiones y Recomendaciones
Estos resultados indicaron que regula el miR-518c-5p el crecimiento y metástasis del cáncer oral como una diana aguas abajo del sistema /CXCR4 SDF-1. En el futuro, sería crítico para examinar la asociación entre el CXCR4 y la expresión de miR-518c-5p en el material clínico. Si el mecanismo molecular de miR-518c-5p contra la metástasis del cáncer podría aclararse aún más, la supresión del crecimiento celular y la migración por un inhibidor de miR-518c-5p puede servir como base para el desarrollo de terapias contra la metástasis.
Apoyo a la Información sobre Table S1.
miARN dirigido por el miR-518c-5p se analiza mediante el uso del programa de microRNA.org (http://www.microrna.org/microrna/getMirnaForm.do), y el valor de corte se adapta menos de -1.5 de la puntuación miRSVR
doi:. 10.1371 /journal.pone.0115936.s001 gratis (DOC)
Reconocimientos
agradecemos al Dr. Koh-ichi Nakashiro (Departamento de Cirugía Oral y Cirugía maxilofacial, Universidad de Ehime Facultad de Medicina) para proporcionar asistencia técnica.