Extracto
En el presente trabajo, hemos diseñado un modelo cuantitativo de las membranas biológicas por la deposición de lípidos de membranas planas sobre sustratos sólidos (llamada soportados membranas), y se inmoviliza con biotina oligómeros de ácido hialurónico (HA-oligo, 6-8 unidades de disacáridos de longitud) a la superficie de la membrana a través de neutravidina reticulantes. Mediante el control de la auto-ensamblaje de los anclajes de lípidos biotinilados, la distancia media entre las moléculas oligo-HA en la membrana podría ser controlada con la precisión nm. La adhesión y la motilidad de las células de adenocarcinoma pancreático que expresan diferentes variantes de empalme de la HA de unión a CD44 receptor de superficie celular en estas superficies se investigaron cuantitativamente. La combinación de la etiqueta libre, proyección de imagen de lapso de tiempo de las células vivas y el análisis estadístico sugiere que la morfología estática (forma global y la remodelación del citoesqueleto) de las células, su dinámica morfológicas estocásticos, y la probabilidad de movimiento dirigido reflejan el comportamiento metastásico de cáncer células
Visto: Kaindl. T, H Rieger, Kaschel LM, Engel T, Schmaus A, Sleeman J, et al. Patrones (2012) espacio-temporal de las células del cáncer de páncreas que expresan CD44 isoformas de apoyo a las membranas Viendo hialurónico oligómeros de ácido matrices. PLoS ONE 7 (8): e42991. doi: 10.1371 /journal.pone.0042991
Editor: David Holowka, Universidad de Cornell, Estados Unidos de América
Recibido: May 7, 2012; Aceptado: 17 Julio 2012; Publicado: 14 Agosto 2012
Copyright: © Kaindl et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Asociación Helmholtz en el marco del programa "biointerfase". Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
En los últimos años, CD44 ha surgido como un importante mediador de las interacciones célula-matriz que integra la actividad de señalización de receptores de factores de crecimiento a través de su función de co-receptor [1]. La expresión del gen CD44 da lugar a una familia de glicoproteínas transmembrana cuyo peso molecular es extremadamente heterogénea (MW 80-200 kDa) debido a N- variable y la glicosilación ligada a O y empalme alternativo [2], [3], [4] . En particular, la inserción de hasta 10 exones variantes durante el empalme alternativo del transcrito de CD44 introduce amplia variabilidad en la región proximal de la membrana extracelular de la proteína [5], [6], [7]. Estas isoformas que contiene el exón-variantes se denominan CD44v, en contraste con CD44s que no contienen estos exones variantes.
La interacción de CD44 con la matriz extracelular hialuronano glicosaminoglicano (HA) es la interacción más estudiado de la CD44 proteína [8]. Esta interacción se regula a un número de niveles, incluyendo la glicosilación [4] y la agrupación de CD44 que se promueve mediante la inclusión de secuencias de exón-codificada variante [9]. HA se sintetiza como un polímero de alto peso molecular compuesto por subunidades de N-acetilglucosamina y ácido glucurónico [10] alterna. Durante el crecimiento tumoral y la inflamación, la degradación de HA se puede mejorar, dando como resultado la acumulación de pequeñas HA oligosacáridos que ejercen actividades biológicas no exhibidas por alto peso molecular HA [11]. Dos motivos de unión de HA en la parte extracelular de la proteína CD44 median su interacción con HA [12]. CD44 se une a la mínima de un hexasacárido HA [13], y la señalización a través de CD44 puede ser regulado por el tamaño de HA [1].
HA y CD44 ambos se han implicado en la regulación del crecimiento del tumor y la metástasis [4], [14], [15]. La acumulación de HA se asocia con un mal pronóstico del paciente y se ha sugerido para aumentar la proliferación tumoral, la invasión y la angiogénesis, entre otros, [8]. Además, la expresión de diferentes isoformas de CD44 se ha relacionado con un mal pronóstico en un número de diferentes tipos de tumores [14], y los estudios en modelos animales han proporcionado evidencia de un papel funcional de las isoformas de CD44 en la metástasis [16]. Es importante destacar que, la interacción entre CD44 y HA se ha asociado con el crecimiento tumoral y la metástasis [17], [18]. Sin embargo, también existen datos contradictorios. En algunos contextos acumulación de HA disminuye tumorigenicidad [19], [20], [21], [22], mientras que la expresión de hialuronidasas, enzimas que degradan HA, puede correlacionar con la progresión del tumor [23]. Del mismo modo la expresión de algunas isoformas de CD44 en determinados tipos de cáncer se puede correlacionar con buen pronóstico [15], y suprimir la metástasis en modelos animales [24]. En conjunto, estas observaciones sugieren que se requiere una mejor comprensión de cómo CD44 interactúa con HA para explicar la importancia de estas interacciones complejas a la progresión tumoral y la metástasis, que a su vez identificar nuevas vías para la intervención terapéutica.
El páncreas de rata modelo de carcinoma BSp73 [25] proporciona un modelo útil para analizar tanto las funciones de promoción de la metástasis de CD44, así como la interacción entre CD44 y HA. La línea de células BSp73AS (llamado 1AS en el siguiente texto) es débilmente metastásico, expresa CD44s pero sólo muy bajos niveles endógenos de variantes de CD44, y se une mal a HA inmovilizado [26]. La transfección de estas células con CD44v4-v7, una variante de empalme que se encuentra en células altamente metastásicas, la línea celular produce ASpSV14 que es altamente metastásico en los modelos de rata [16]. La expresión de la proteína CD44v4-v7 también promueve la unión de células ASpSV14 a través de la agrupación de HA regulada de la proteína CD44v4-v7 [9]. Un punto de mutación R44L en el N-terminal motivo de unión a HA de la proteína CD44v4-v7 hace que la proteína incapaz de unirse a HA, mientras un K162A, R166A mutación doble punto en la otra motivo de unión a HA de los resultados de CD44v4-V7 en un HA reducida capacidad de unión en comparación con la de tipo salvaje proteína CD44v4-v7 [26]. En consecuencia, las células 1AS que expresan ectópica de la proteína R44L CD44v4-v7 (AS-R44 células) no se unen HA, mientras que las células 1AS ectópica expresar la K162A, la proteína R166A CD44v4-v7 (AS-K162R166 células) muestran una reducción de la unión a HA en comparación con ASpSV14 las células [26].
el uso de estas cuatro líneas celulares, se diseñaron experimentos para examinar la interacción de CD44 con HA precisamente espacialmente ordenado de longitud definida (6-8 unidades de disacárido). Específicamente, la adhesión y la motilidad de las células de cáncer de páncreas de rata que expresan diferentes isoformas de CD44 se estudiaron en densidades laterales definidas de HA. En lugar de fisisorción o injerto covalente de moléculas oligo-HA sobre sustratos de plástico no específica, nos anclado moléculas biotiniladas oligo-HA a través de neutravidina reticulantes a la superficie de las membranas lipídicas planas (los llamados "membranas soportadas" [27], [ ,,,0],28]) que incorpora anclajes de lípidos biotinilados. Esto permitió la adhesión no específica de las células por medio de largo alcance Van der Waals atracción reducir al mínimo, y la distancia media entre las moléculas de HA anclados a ser controlada con precisión dentro de la precisión nm [29]. Mediante el empleo de una combinación de time-lapse de las células con etiqueta libre de micro-interferometría (RICM) [30], [31] y el análisis estadístico [32], podríamos evaluar cuantitativamente la fuerza de adhesión celular, la dinámica estocástica de las células morfología, y la persistencia y la velocidad de la motilidad celular.
Materiales y Métodos
Materiales
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) y 1 , 2-dioleoil-sn-glicero-fosfo-etanolamina-3-N- (biotinil cap) (biotina-DOPE) se adquirieron de Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, EE.UU.), y neutravidina desglicosilada de Invitrogen (Karlsruhe, Alemania) . El rojo lejano fluorescente DRAQ5 tinte de ADN de Biostatus limitado (Leicestershire, UK) se utilizó para teñir los núcleos celulares, y Alexa Fluor 488 faloidina (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) se utilizó para la visualización del citoesqueleto de actina. Los ensayos de adhesión se llevaron a cabo en los canales de plástico sin fondo de fluidos (μ-deslizante I) a partir ibidi (Múnich, Alemania) sellados con el grado microscópico de 25 × 75 mm
2 placas de vidrio de Menzel (Braunschweig, Alemania). Todos los demás productos químicos de P. A. calidad se adquirieron de Sigma-Aldrich (Neu-Ulm, Alemania), si no se especifica lo contrario. A lo largo de este estudio, ultrapura agua desionizada (GenPure, TKA Niederelbern, Alemania) se utilizó para la preparación de todas las soluciones tampón.
imágenes micro-interferometría de células 1AS en apoyo a las membranas que muestran (A) y poli-HA (B) oligo-HA a una distancia media de & lt;
d Hotel & gt; ~ 5.5 nm a
t =
2 h. Barra de escala: 8 micras
La fracción de células 1AS adheridos a las membranas compatibles como se indica representados gráficamente en función del tiempo.. Las tres membranas estudiadas fueron las membranas pura DOPC (línea negro) y las membranas que exhiben oligo-HA a & lt;
d Hotel & gt; ~ 11 nm (línea verde) y & lt;
d Hotel & gt; ~ 5.5 nm (línea azul).
HA Preparación de muestras
polímero de ácido hialurónico (poli-HA) se adquirió de Sigma-Aldrich (Neu-Ulm, Alemania). oligómero de ácido hialurónico (HA-oligo, GE Healthcare, Heidelberg, Alemania) fue preparado por la degradación enzimática con hialuronidasa bovina testículo [33] y fraccionamiento con un purificador ÄKTA (GE Healthcare, Heidelberg, Alemania) para obtener oligómeros de 6-8 unidades de disacárido en longitud. Para la inmovilización a la superficie de la membrana, tanto poli- y oligo-HAS fueron modificados por acoplamiento con (+) -. Hidrazida biotina (Sigma-Aldrich, Neu-Ulm, Alemania) [34], [35]
Preparación de la superficie de HA
Antes de la unión, sustratos de vidrio se limpiaron mediante el uso de un protocolo modificado RCA [36]. Específicamente, los sustratos se sometieron a ultrasonidos durante 5 minutos en acetona, etanol, metanol, y agua, después se sumergen en una solución de H
2O
2 (30%) /NH
4OH (30%) /H
2O (01:01: 5 en volumen) y se sonicó durante 5 min a temperatura ambiente antes de remojarlos durante otros 30 min a 60 ° C. Después, se enjuagaron intensamente con agua, se secó a 70 ° C, y se almacenaron en una cámara de vacío. mezclas de lípidos con diferentes relaciones molares de biotina-DOPE se expusieron primero a una corriente de nitrógeno, y luego se mantuvieron en una cámara de vacío a 25 ° C durante 12 h. Después de suspender las películas lipídicas secas en agua desionizada, pequeñas vesículas unilaminares (SUV) fueron preparados por sonicación con un sonicador de punta (Misonix, Nueva York, EE.UU.) durante 30 minutos a 1,0 W. membranas soportadas fueron preparadas por deposición de suspensiones de SUV en sustratos limpiados. Después de 20 min de incubación, las cámaras se enjuagaron intensamente con agua desionizada para eliminar las vesículas restantes. La distancia media entre los anclajes de lípidos (biotina-DOPE) y por lo tanto la distancia entre las moléculas de HA puede estimarse a partir de la fracción molar de biotina-DOPE χ
b-DOPE y la superficie por lípidos (
A
lípidos ~ 60 Å
2 [37]), como. En el siguiente paso, la membrana se incubó en solución neutravidina (1 g /ml, en agua desionizada) durante 20 min. Después de lavado intensivo, se inyectó una solución acuosa de HA biotinilado (0,4 mg /ml) en cada cámara de los portaobjetos de vidrio y se incubó durante 20 min. Finalmente, las muestras se lavaron con medio de cultivo de células pre-calentado y se mantuvieron a 37 ° C antes de los experimentos de adhesión.
RICM imágenes (izquierda) e imágenes confocal de fluorescencia (centro y derecha) de ( a) Las células 1AS (B) AS-K162R166 células (células C) ASpSV14, y (D) AS-R44 células incubadas en apoyo a las membranas que exhiben oligo-HA a & lt;
d Hotel & gt; ~ 5,5 nm para 4 h. Después de la fijación, el ADN y actina se tiñeron con DAPI y Alexa 488 faloidina.
Los experimentos de adhesión celular
1AS, células ASpSV14, AS-R44 y AS-K162R166 se cultivaron como se ha descrito anteriormente [26], [38]. Las células se recogieron por tripsinización y posteriormente se resuspendieron en pre-calentado RPMI 1640 a una densidad de 1,75 x 10
7 células /ml. Una porción de 0,2 ml de suspensión celular se inyectó en cada cámara de las placas de vidrio, y se mantuvo a 37 ° C y 5% de CO
2. imágenes de células vivas no invasiva se realizó mediante microscopía de contraste de interferencia de reflexión (RICM) en una Axiovert 200 microscopio invertido (Carl Zeiss, Göttingen, Alemania) equipado con un PlanNeofluar 63 × /1,25 Antiflex objetivo de inmersión en aceite. Para calcular el área de contacto con la membrana celular, las imágenes se grabaron con una cámara CCD Orca ER (Hamamatsu Photonics, Herrsching, Alemania). Después de la sustracción del fondo, se binarizados las imágenes para determinar el borde de la zona de adhesión. La fracción de células adheridas se determinó mediante la normalización de las células observadas por RICM (células adheridas) con el total de células en las imágenes de contraste de fase correspondientes. Las células para la adquisición de datos en función del tiempo también se incubaron en RPMI 1640 medio celular a 37 ° C y 5% de CO
2. Las imágenes fueron tomadas en una posición fija con intervalos de tiempo de 10 min y 15 min para 20 h. Después de la extracción de la curva de nivel de células de cada imagen binaria, el centro de masa se extrae y se utiliza para la documentación del desplazamiento celular y análisis de curva de nivel. Ambos valores, área de adhesión
Una longitud
y el contorno de la línea celular
L
, fueron utilizados para el cálculo de la circularidad sin dimensiones. El factor de elongación se dedujo aún más por la relación de menor perpendicular a los ejes principales, y por lo tanto también se traduce en una gama adimensional entre 1 y 0.
(A) una instantánea de una célula ASpSV14 en un oligo-HA -functionalized membrana (& lt;
d Hotel & gt; ~ 5.5 nm,
t =
9 h) capturado por RICM. El borde periférico de la célula se determinó por el contraste de intensidad de los píxeles. (B) La amplitud de la amplitud de la fluctuación representa como una función de
θ
. es la distancia radial media más
θ =
0-360 °. (C) El mapa de amplitud como una función del ángulo de
θ
en el tiempo (
t
= 140 a 1000 min). (D) La autocorrelación correspondiente al mapa de amplitud en el panel (C).
Resultados
La adhesión de 1AS de poli- y oligo-HA anclada al apoyo a las membranas
para comparar el HA características de las células 1AS y sus derivados vinculante, lo primero que examinó la capacidad de adherirse a 1AS HA atado a apoyo a las membranas. La Figura 1 muestra imágenes representativas de RICM células 1AS de unión por 2 h a poli-HA y oligo-HA atado a una distancia intermolecular promedio de & lt;
d
& gt; ~ 5,5 nm. En este estudio, la distancia media intermolecular & lt;
d Hotel & gt; puede ser controlada por la concentración molar de moléculas de anclaje libremente difusivos en la membrana soportada. Como se presenta en la Figura 1, las células mostraron una pronunciada 1AS difusión en ambas superficies. Las áreas proyectadas medias de células adheridas sobre las membranas funcionalizado con poli-HA y oligo-HA calculados a partir de la figura 2A y la figura 2B fueron comparables,
Un
poli = 480 m
2 y
Un
oligo = 560 m
2, respectivamente. En experimentos de control, las células 1AS casi no mostraron signo de la adhesión a las membranas DOPC puros (Figura 1C), lo que confirma la especificidad de la adhesión a las superficies de HA.
mapas de amplitud representativos de (A) 1AS y (B) ASpSV14 células representan como función de
θ
registrados durante la primera etapa de la adhesión celular (
t
= 0 a 200 min). Las correspondientes funciones de autocorrelación para 1AS y ASpSV14 se presentan en el panel (C) y (D), respectivamente.
El análisis de la zona de adhesión, factor de elongación y la circularidad calculada a partir de nueve células (Tabla 1) sugiere que las células 1AS extienden isotrópica en ambas superficies oligo-HA poli-HA y. De hecho, las regiones de adhesión apretado identificados por intensidades de los píxeles bajas (típicamente, la distancia de separación por debajo de 10 nm [39]) se encuentran cerca de la periferia de la célula. Por consiguiente, concluimos que oligo-HA, así como de poli-HA puede actuar como ligandos específicos para células 1AS. Como se observó ninguna diferencia en la unión de las células a superficies 1AS poli-HA y oligo-HA, en los experimentos posteriores que utilizan exclusivamente oligo-HA con una distribución de tamaños estrecha (6-8 unidades de disacárido de repetición).
(A) mapa de amplitud de 1AS representativo y (B) células ASpSV14 traza como función de
θ
registraron después del establecimiento de la adhesión estable (
t =
600-1000 min). La autocorrelación correspondiente de células 1AS y ASpSV14 se presentan en el panel (C) y (D), respectivamente. Tres imágenes en bruto RICM se comunican para las células (E) 1AS y (F) ASpSV14 en diferentes puntos temporales. Las barras de escala:.. 10 micras
El grado de deformación celular de una única célula 1AS representante (línea de color negro) y una célula ASpSV14 (línea azul) con respecto a la dirección de la motilidad celular
a continuación se examinó cómo el espaciamiento de HA oligosacáridos atados influye en la unión de las células 1AS a estas superficies. La proporción de células 1AS se adhieren a la oligo-HA apoyado membranas para varias distancias medias entre moléculas oligo-HA se evaluó como una función del tiempo. Sorprendentemente, sólo un ligero cambio en & lt;
d Hotel & gt; de 5,5 nm a 11 nm resultó en una diferencia significativa en ambos la cinética y eficacia de la adhesión celular (Figura 2). A & lt;
d Hotel & gt; ~ 11 nm, las células 1AS necesario 90-120 min para alcanzar niveles de saturación de adherencia (40 a 50%), mientras que en & lt;
d
& gt; ~ 5,5 nm para las mismas células se requería solamente 30 a 60 min para alcanzar tanto un mayor nivel de saturación de adherencia (& gt; 80%). Estos resultados sugieren que la adhesión específica de las células 1AS de oligo-HA es altamente sensible a la presentación espacial de las moléculas oligo-HA de apoyo a las membranas en el nivel de precisión nm.
A continuación se examinó la capacidad de las células 1AS expresando diferentes isoformas de CD44 para unirse a oligo-HA atados a las membranas soportadas en & lt;
d Hotel & gt; ~ 5,5 nm para 4 h. En estas condiciones, RICM y las imágenes de fluorescencia confocal se obtuvieron para 1AS células, AS-K162R166 células, células, y células ASpsV14 AS-R44 (Figura 3). En paralelo, se realizó un experimento de control para los cuatro tipos de células para examinar su adhesión a las membranas DOPC puros, y confirmó que la adhesión no específica es despreciable (& lt; 10%) para todos los tipos de células (datos no mostrados). Antes de la proyección de imagen, se fijaron las células, y la actina y el ADN se tiñeron con Alexa 488 faloidina y DRAQ5, respectivamente. Para cada línea celular, se analizaron entre 30 a 90 células, y un mínimo de cinco células se seleccionaron para la microscopía confocal. Los ejemplos representativos se muestran en la Figura 3. 1AS células toman una forma pentagonal o heptagonal, y muestran una más isotrópico propagación de las células AS-K162R166 y ASpsV14 (Figura 3A). En contraste, las células AS-R44 permanecieron casi esférica (Figura 3D), y la imagen RICM no presentaron ningún signo de adhesión significativa por estas células a la membrana (Figura 3D, columna izquierda).
La presencia de una densa malla de actina periférica y la formación de fibras de estrés como se observa para las células parentales 1AS se ha asociado con las células que no son móviles [40]. Por otro lado, AS-K162R166 células (Figura 3B) y células ASpSV14 células (Figura 3C) muestran rasgos característicos de gran movilidad, migración de las células, tales como actina lamellipodial densa en la parte delantera difusión (indicado por flechas), y las fibras de estrés a lo largo de el eje mayor de las células. Debe tenerse en cuenta que el área de adherencia es comparable entre 1AS, AS-K162R166 células y ASpSV14, a pesar de las diferencias significativas en la morfología celular entre las células 1AS y sus derivados CD44v4-V7-expresión de AS-K162R166 y ASpSV14 (Figura S1).
morfológicas Dinámica de 1AS y ASpSV14 células
para resaltar la evolución temporal de la morfología celular en respuesta a oligo-HA superficies, primero se extrae el borde periférico de células a partir de las imágenes RICM de lapso de tiempo. Un total de cinco y siete 1AS células ASpSV14 se analizaron de esta manera. La Figura 4A muestra un ejemplo representativo de una célula ASpSV14 en una membrana soportada funcionalizado con oligo-HA (& lt;
d Hotel & gt; ~ 5.5 nm,
t =
9 h). Después de la delimitación del borde periférico de la célula utilizando el contraste de los valores de píxel, la distancia radial
r
entre el borde de la célula (línea amarilla) y el centro de masa se representa como una coordenada polar (
r
,
θ
), como se muestra en la Figura 4B. Aquí,
θ
= 0 se define como dirección vertical en el sistema de laboratorio. Esto nos permitió realizar un seguimiento de la dirección del movimiento de las células y para identificar la anisotropía morfológica de una célula en el punto de tiempo
t
. La amplitud de la fluctuación de forma se define como, donde es la distancia radial media más
θ =
0-360 °. Trazando una etiqueta con un código de color en función del ángulo de
θ
con el tiempo
t gratis (Figura 4C), los cambios morfológicos dinámicos en la célula diana se pueden representar. Por otra parte, los patrones espacio-temporales ocultas detrás del ruido estocástico de dinámica morfológica se pueden extraer mediante el análisis de sus funciones de correlación [32]. La función de autocorrelación del mapa de amplitud puede ser calculado por: (10)
Como se muestra en la Figura 4D, la función de autocorrelación calculada a partir del mapa de amplitud (Figura 4C) sugiere que la célula se estira linealmente hasta Δ
t
~ ± 200 min, los contratos de una línea de contorno redondo en Δ
t
~ ± 300 min, y posteriormente se estira linealmente en una dirección perpendicular después Δ
t
~ ± 400 min, que puede ser identificado por un cambio de posiciones de los picos por ~ 90 °.
Figuras 5A y 5B representan los mapas de amplitud de células 1AS y ASpSV14 representativos representados gráficamente como una función de
θ
y
t
durante la fase anterior de adherencia (
t =
0-200 min) a membranas de oligo-HA-funcionalizado en & lt;
d Hotel & gt; ~ 5,5 nm. Como se presenta en la figura, tanto las células muestran muy poca desviación de la distancia radial media desde el centro de masa. Las autocorrelaciones correspondientes para (C) 1AS y (D) ASpSV14 también muestran ninguna característica, lo que sugiere que tanto metastásico y células no metastásicas extienden isótropa cuando están inicialmente en contacto con las membranas funcionalizados-oligo-HA. Este hallazgo experimental es coherente con los informes anteriores sobre la inicial difusión de condrocitos [41] y fibroblastos [42].
Por otro lado, se observó una clara transición en la morfología celular después de la dinámica estable células de cáncer establecido adhesión. Se observó que la transición en torno a
t = 300 min
tanto para metastásico ASpSV14 y células metastásicas 1AS mal. Después de la transición, las células mostraron claras diferencias en las amplitudes y las autocorrelaciones. Las células 1AS exhiben más de 3 maxima distinta con amplitudes comparables de alrededor de 20 micras, con t = 750 min (Figura 6A), lo que implica que la célula adherido desarrollado en una forma hexagonal. Como la figura 6A y 6E demuestran, es muy difícil distinguir patrones característicos sólo de los mapas primas de amplitud, debido a la dinámica morfológicas de las células biológicas son altamente estocástico. ruido estocástico intrínseca de los sistemas dinámicos se superó mediante el cálculo de la función de autocorrelación (Ecuación 1). Como se muestra en la figura 6C, tres picos de autocorrelación estables y pronunciadas de simetría rotacional en Δ
θ
max = -120 °, 0 ° y 120 ° fueron identificados. La intensidad de autocorrelación temporal decaído rápidamente para Dt ≠ 0 min, lo que sugiere que la célula 1AS gira sin cambiar su forma
.
En contraste, el mapa de amplitud de las células metastásicas ASpSV14 mostró dos máximos pronunciados hasta
R
max ~ 11 micras (Figura 6B). La autocorrelación correspondiente exhibe dos correlaciones positivas separadas por ~ 180 ° (Δ
θ
max = 0 ° y ± 180 °), que son estables en el tiempo Δ
t gratis (Figura 6D ). Esto indica que la célula se estira linealmente y se movió durante más de 2 h en la misma dirección. imágenes RICM de células ASpSV14 en lugares de imagen fija (Figura 6f) ilustran el movimiento y el alargamiento de la célula antes de cambiar su orientación. Este hallazgo está en contraste con la propagación isotrópica observado en los puntos de tiempo anteriores (Figura 5C y 5D).
motilidad de las células cancerosas que expresan CD44s y CD44v4-v7
En el siguiente paso, hemos realizado un estudio la motilidad de las células ASpSV14 y 1AS mediante el seguimiento del desplazamiento del centro de masa, determinada a partir del área proyectada de la adhesión. Aquí, la velocidad media de la célula se define como el desplazamiento de la célula
dx
la muestra dentro de un intervalo de tiempo de cada
dt
= 30 min durante nueve células ASpSV14 y cuatro 1AS células. La velocidad media se mantuvo casi constante para ambos tipos de células más de 20 h. La velocidad media de células ASpSV14, & lt;
v
psV14 & gt; = 5 ± 0,2 m /h, fue sólo ligeramente mayor que la de las células 1AS, & lt;
v
1AS & gt; = 4 ± 0,2 m /h, donde los errores representan la desviación estándar de los valores medios.
Para deducir la relación entre la dirección de la motilidad y el cambio morfológico, también calcula la función de distribución de probabilidad del grado de células la deformación y la dirección de la motilidad celular: (14)
Nota que
θ
= 0 se define como la dirección de la motilidad celular. Se evaluó la velocidad de deformación y el cambio de las células cancerosas por seis 1AS y cuatro células ASpSV14. Tal como se presenta en la Figura 7, una clara señal de la ruptura de simetría de una sola célula ASpSV14, representante puede ser identificado como una clara sub-pico que se desvía del centro en un 8 micras en la dirección de la motilidad celular. Esto está en contraste con la de las células que poseen 1AS el pico cerca del centro, que corresponde al movimiento aleatorio, isotrópico. Para ambas líneas celulares, el histograma se calculó para más de 55 líneas de contorno de la célula.
Discusión
Aunque la interacción de CD44 con HA es claramente importante en el contexto del cáncer [4], la papel de estas moléculas en el crecimiento del tumor y la metástasis necesita más investigación para entender los resultados a veces contradictorios en cuanto a la naturaleza de esta interacción. En particular, el análisis utilizando el espaciamiento de HA de un tamaño homogéneo definido que ha faltado hasta la fecha. Aquí hemos utilizado HA atado a apoyo a las membranas para investigar los parámetros biofísicos asociados a células de unión a HA. Se encontró que mientras que CD44s células que expresan 1AS obligados igualmente bien a superficies de oligo-HA poli-HA y, la unión era exquisitamente sensible a la distribución espacial de HA. En el nivel de células individuales, la expresión ectópica de CD44v4-v7 en estas células no alteró la unión inicial de las superficies de oligo-HA, pero más tarde inducida por alteración de la morfología celular y la migración direccional mejorada.
Previamente hemos demostrado que, en contraste con las células ASpSV14, las células 1AS se unen muy mal a las superficies de HA inmovilizados [26]. En estos ensayos de unión de células, se empleó absorción de HA a las superficies de plástico, donde fue posible ningún control sobre la densidad o la distribución espacial de las moléculas de HA [26]. Sin embargo, en el presente estudio, ambos tipos de células unidas a oligo-HA atados membranas, aunque las células ASpSV14 respondieron de manera diferente en términos de morfología y motilidad después de la unión inicial de las superficies. También se encontró que la superficies de unión de las células 1AS de oligo-HA fue fuertemente influenciado por la separación de las moléculas de HA. Por tanto, es posible que la distribución espacial de HA en los ensayos anteriores no era óptima para la unión de las células 1AS, pero fue suficiente para la unión de las células que expresan ASpSV14 además la proteína CD44v4-v7. Se requiere trabajo adicional para determinar si las células ASpSV14 son menos sensibles a la distribución espacial de HA de las células 1AS. Esto parece probable, debido a la agrupación de CD44 en la superficie de las células que conduce a mejorar la propiedades de unión de HA [9].
El derivado 1AS AS-R44 expresa ectópica una forma mutante de CD44v4-v7 que no puede unirse a HA [26]. Sorprendentemente, a pesar de AS-R44 células expresan CD44s similares a las células 1AS parentales que se pueden unir a las superficies de oligo-HA, las células AS-R44 no fueron capaces de interactuar con estas superficies (Figura 3). Por tanto, estos datos sugieren que la forma mutada no-HA-unión de CD44v4-v7 puede afectar a la actividad de unión a HA de la proteína CD44s endógeno. Consistente con esta noción, las células AS-K162R166 que expresan una forma mutada de CD44v4-v7 que muestra sólo una capacidad de unión parcialmente reducido a HA [26] comportó de manera similar en los ensayos de unión a las células ASpSV14 que expresan el tipo salvaje CD44v4- v7 proteína
en la distribución espacial de oligo-HA empleada en este estudio, la velocidad media de las células translocación ASpSV14 (& lt;.
v
psV14 & gt; = 5,0 ± 0,2 m /h) fue comparable a la de las células 1AS (& lt;
v
1AS & gt; = 4,4 ± 0,2 m /h) durante 20 h, a pesar de una diferencia significativa en su dinámica morfológicos (Figura 6). Sin embargo, el análisis de la deformación celular dirigida (Figura 7) sugiere que mientras que las células migran 1AS solamente al azar en la superficie oligo-HA, las células ASpSV14 presentan una mayor motilidad direccional. Estas diferencias pueden reflejar el comportamiento altamente metastásica de las células ASpSV14
in vivo
en comparación con el comportamiento metastásico débil de las células 1AS [7], [16]. Además, aunque 1AS citoesqueleto células exhiben características previamente asociado con células inmóviles [40], el hecho de que su velocidad se observó a ser similares a las células ASpSV14 sugiere que estas características y no reflejan las características morfológicas dinámicos de las células.
en este estudio, hemos utilizado cuantitativamente funcionalizado apoyo a las membranas y estudiamos la adhesión, los patrones morfológicos, y la motilidad de las células de adenocarcinoma pancreático que expresan diferentes isoformas de CD44. Para discriminar las características patrones espacio-temporales del ruido estocástico de los sistemas dinámicos de célula, introdujimos un relativamente simple pero sencillo análisis de imagen estadística tales como funciones de autocorrelación. Anteriormente, Maeda et al. investigado la morfología y la correlación de orientación del moho del lodo
Dictyostelium discoideum
sobre sustratos de vidrio [32], la presentación de informes que
D. discoideum
sufre transiciones estocásticas dentro de una ventana de tiempo de 10-20 minutos. Nuestros resultados sugieren que la dinámica morfológicas de las células de cáncer de páncreas es mucho más lenta, con característicos ventanas de tiempo de varias horas. Esto se puede atribuir en parte a la difusión prominente y la adhesión de las células cancerosas mediadas a través de interacciones específicas HA-CD44, y puede requerir tanto la adhesión a la superficie (agarre) y la escisión sucesiva de CD44 (release) durante la migración celular como se sugiere por un anterior estudio [43].
la dinámica de partículas "autopropulsados" está atrayendo cada vez más atención en el campo de la física estadística lejos del equilibrio. J.P.S.