Extracto
Antecedentes
La detección de mutaciones en el gen del cáncer críticos en muestras de tumores clínicos pueden predecir los resultados del paciente e informar a las opciones de tratamiento; Sin embargo, de alto rendimiento de perfiles de mutación está poco desarrollado como un método de diagnóstico. Se presenta la implementación de un algoritmo de determinación del genotipo y la validación de perfiles que permite robusta mutación del tumor en el ámbito clínico.
Metodología
Hemos desarrollado e implementado una mutación optimizado perfiles de plataforma ( "OncoMap") para interrogar ~ 400 mutaciones en 33 oncogenes conocidos y supresores de tumores, muchos de los que son conocidos para predecir la respuesta o la resistencia a las terapias dirigidas. El rendimiento de OncoMap se analizó usando ADN derivado de tanto congelado y material clínico FFPE en un conjunto diverso de tipos de cáncer. Un posterior análisis en profundidad se llevó a cabo en histológica y clínicamente gliomas pediátricos anotados. La sensibilidad y especificidad de OncoMap eran 93,8% y 100% en el tejido fresco congelado; y 89,3% y 99,4% en el ADN derivado de FFPE. Hemos detectado mutaciones conocidas en las frecuencias esperadas en los cánceres comunes, así como mutaciones nuevas en adultos y cánceres pediátricos que pueden predecir la respuesta elevada o la resistencia a terapias contra el cáncer existentes o de desarrollo. OncoMap perfiles también soportan una nueva estratificación molecular de los gliomas de bajo grado pediátricos en base a
BRAF
mutaciones que pueden tener un impacto clínico inmediato.
Conclusiones
Nuestros resultados demuestran la factibilidad clínica de alto rendimiento de perfiles de mutación para consultar un gran panel de mutaciones de genes del cáncer "recurribles". En el futuro, este tipo de enfoque puede ser incorporado en ambos estudios epidemiológicos del cáncer y toma de decisiones clínicas para especificar el uso de muchos agentes anticancerígenos dirigidos
Visto:. MacConaill LE, Campbell CD, Kehoe SM, Bajo AJ, Hatton C, Niu L, et al. (2009) de perfiles críticos cáncer mutaciones genéticas en muestras de tumores clínicos. PLoS ONE 4 (11): e7887. doi: 10.1371 /journal.pone.0007887
Editor: Chris Jones, Instituto de Investigación del Cáncer, Reino Unido
Recibido: 25 Agosto, 2009; Aceptado: 20 Octubre 2009; Publicado: 18 Noviembre 2009
Derechos de Autor © 2009 MacConaill et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional del cáncer (R21CA126674) a la zaga, (K08CA134931) para AJB, y el Instituto de cáncer Dana-Farber. A.J.B. fue apoyado por el Programa de Formación Investigador Clínico de Harvard. Los fondos para el análisis de los tumores gastrointestinales se suministró la American Society of Clinical Oncology, Amigos del Instituto del Cáncer Dana-Farber y el H.T. Fundación Berry. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. En cuanto a la divulgación de información financiera, Levi Garraway es un consultor para y /o recibe patrocinado la investigación de Novartis, Inc. Ninguna de estas relaciones constituye un conflicto de intereses para este trabajo. Esto no altera su adhesión a todas PLoS ONE políticas sobre la distribución y materiales datos.
Introducción
Muchos tumores contienen mutaciones del sello dentro de oncogenes o supresor de tumores (TS) genes que pueden conferir una mayor susceptibilidad a las terapias contra el cáncer dirigidas. ejemplos bien establecidos incluyen
KIT
mutaciones en los tumores del estroma gastrointestinal (GIST) que predicen la respuesta al imatinib o nilotinib, y no pequeñas de cáncer de pulmón de células con
EGFR
mutaciones que son sensibles a erlotinib [ ,,,0],1], [2], [3]. La presencia de otras mutaciones predice una falta de respuesta a la terapia dirigida. Por ejemplo, de pulmón y colorrectal, que contienen mutaciones en el
KRAS
oncogén no responden al tratamiento con anti-EGFR
agentes [4], y la inactivación de
PTEN
mutaciones ( o la pérdida de proteínas) en glioblastomas predecir la resistencia al erlotinib [5]. Por lo tanto, la toma de decisiones clínicas basadas en la información genética del tumor cada vez será informado por el estado mutacional de múltiples genes del cáncer. Sin embargo, la generación de un perfil completo de las mutaciones del ADN tumoral diana poder o de otra manera "procesable" en el ámbito clínico sigue siendo un reto.
Los recientes avances tecnológicos hacen que sea posible, en principio, para examinar una biopsia del tumor para muchos tipos de cambios genómicos . Sin embargo, la incorporación de dicha información en la toma de decisiones clínicas requiere de perfiles genómicos fiable de ADN tumoral congelado, parafina derivados, y de archivo. En este contexto, los ácidos nucleicos a menudo están sujetos a la degradación y /o modificación química, y la disponibilidad de tejido tumoral pueden ser limitantes.
previamente informó de la adaptación de un enfoque de alto rendimiento del genotipo para interrogar a mutaciones clave un panel de 17 oncogenes conocidos. Ahora demuestran la viabilidad clínica de los perfiles de mutación del gen del cáncer basado en espectrometría de masas para un gran panel de mutaciones de oncogenes y de genes TS. Para lograr esto, hemos generado un enfoque denominado OncoMap, que emplea una colección ampliada de 460 ensayos de interrogación mutaciones conocidas en 33 genes del cáncer. El uso de este enfoque de perfil genómico acoplado a un algoritmo de mutación-llamando analítica y paso de validación ortogonal, se identificaron numerosas mutaciones presentes en el ADN genómico tanto de tejido tumoral congelado y FFPE. Por otra parte, la aplicación de perfiles de mutación sistemática a & gt; 120 astrocitomas pediátrica de bajo grado revela una estratificación molecular clínicamente informativo no reconocido previamente en este tipo de tumor. Dicha información, si se hizo ampliamente disponible, podría informar tanto a la toma de decisiones clínicas y diseño de ensayos clínicos óptimos para terapias dirigidas.
Métodos
tumor de pacientes y recogida de tejido tumoral
anonymized muestras se obtuvieron de la Red Cooperativa de Tejidos Humanos (CHTN), Oncología quirúrgica de la Universidad de Siena, Italia, y Dana-Farber Cancer Institute; muestras de glioma humano se obtuvieron de los archivos clínicos de los departamentos de Anatomía Patológica del Hospital Infantil de Boston y el Hospital Brigham y de la Mujer. (El contenido del tumor requerida era & gt; 70%; la necrosis. & Lt; 10%) junta de revisión institucional se obtuvo (IRB) exención para todas las muestras del Dana-Farber /Oficina de Atención del Cáncer Socios para la Protección de Sujetos de Investigación. La extracción de ADN se realizó como se describe en Métodos S1.
OncoMap diseño de ensayo y Genotipado
La selección de mutaciones de los genes del cáncer para el diseño del ensayo y el genotipado de espectrometría de masas se realizaron como se describe anteriormente [6], con modificaciones indicadas en Métodos S1. secuencias de ensayo, cebadores y sondas se indican en la Tabla S1.
El código de barras de la muestra y secuenciación
Los cebadores que flanquean
KRAS codón 12
fueron utilizados para PCR-amplificar el ADN genómico de 91 fresca muestras congeladas y 93 FFPE (secuencias de los cebadores indicados en la Tabla S2). amplicones de PCR se analizaron mediante secuenciación de Sanger. Alternativamente,
KRAS
codón 12 se amplificó por PCR con cebadores con código de barras como se describe en Métodos S1. amplicones de PCR se agruparon y se analizaron (Illumina Genome Analyzer II; solo carril). Se analizó la secuencia de datos como se describe en Métodos S1.
Resultados
Características de las muestras tumorales clínicas
Un total de 903 muestras de tumores clínicos derivados de 12 sitios diferentes de tejidos fueron evaluados para este estudio (Tabla 1). La mayoría de las muestras eran adenocarcinomas (n = 625) de los tumores de la, de pulmón, de próstata, y en el tracto GI de mama. También se incluyeron una colección de los GIST (n = 34) y gliomas (n = 155). De estos, 643 muestras se obtuvieron a partir de tejido fresco congelado y 260 derivan de FFPE bloques. tumor de contenido estimado superó el 70% en todas las muestras, medida por la revisión patológica (ver Métodos).
Rendimiento del tumor Mutación de perfiles Algoritmo
Para facilitar el gen del cáncer de perfiles de mutación en clínica de tumores especímenes, hemos desarrollado OncoMap, un panel de ensayos de genotipado que evaluó 396 mutaciones únicas en 33 genes del cáncer. El algoritmo completo mutación de perfiles (Figura 1A) involucrado genotipado de espectrometría de masas seguido de llamada tanto automatizado y revisión manual para generar una lista de mutaciones candidatos. Estos candidatos fueron sometidos a validación genotipado secundaria (ver Métodos S1). Suponiendo que todos los perfiles y validación de un ensayo reactivos primarios están en su lugar, se requieren 7-10 días para completar toda la secuencia de OncoMap.
A. Una visión general del proceso de OncoMap del tumor al perfil mutación. Véase el texto para más detalles. curvas características del operador B. Receptor (ROC) muestran la sensibilidad y especificidad para diferentes valores de corte en la puntuación de la muestra de las muestras de validación. ROC se trazan para fresco congelado (izquierda) y FFPE deriva-(derecha) ADN, utilizando bidireccional
KRAS
ensayos y datos Illumina como una verdad-set (ver Métodos S1).
OncoMap rendimiento se evaluó después de la determinación de la "realidad sobre el terreno" estado mutacional a
KRAS codón 12
utilizando un código de barras del ADN y la estrategia de secuenciación masiva en paralelo por síntesis (ver Métodos S1) aplicado a 91 congelada y 93 FFPE Los ADN tumorales -derivado. Cuando estos resultados de la secuenciación de profundidad se compararon con los ensayos de genotipado interrogar a los mismos
KRAS
codón, encontramos que la sensibilidad y especificidad OncoMap para ser 93,8% y 100%, respectivamente, en el ADN a partir de tejido fresco /congelado; y 89,3% y 99,4% en el ADN derivado de FFPE (Figura 1B). Por el contrario, la sensibilidad de la secuenciación de Sanger convencional era 83,3% para el tejido fresco congelado y 76,0% para el ADN derivado de FFPE, lo que confirma el rendimiento de uso de perfiles de mutación basado en la determinación del genotipo [7].
OncoMap rendimiento se evaluó más extensivamente por las pruebas de 215 muestras tumorales congeladas frescas que abarcan múltiples tipos de tumores en los que el estado mutacional de nucleótidos interrogados por 52 OncoMap ensayos se había establecido previamente. Por este análisis, perfiles mutación logró una manera similar una alta especificidad de 99,8%. La sensibilidad del ensayo era óptima en los tejidos tumorales en el que el contenido de tumor superó el 50% (datos no mostrados). Aunque los valores de sensibilidad individuales no pudieron determinarse para todas las mutaciones ensayadas, cálculos utilizando unidireccional
KRAS
ensayos (reflectantes de la mayoría de los ensayos OncoMap) produjeron valores de sensibilidad y especificidad casi idénticas (Figura S1). Estos resultados sugieren que la mutación basada en la determinación del genotipo de perfiles de la plataforma era adecuado para muchas aplicaciones clínicas.
"recurribles" gen del cáncer de mutaciones a través de diversos tipos de cáncer
De los 903 especímenes de tumores clínicos perfilados, 37% (n = 335) contiene una o más mutaciones. En total, se identificaron 417 mutaciones, con 63 muestras que presentan mutaciones concurrentes. Mientras que 286 se encontraron mutaciones mediante ensayos de interrogar a los oncogenes conocidos o candidatos, se observaron 131 mutaciones en los genes TS. De este modo, la plataforma OncoMap proporciona información más amplia mutación que los esfuerzos de mutación de perfiles anteriores que se centraron exclusivamente en las mutaciones del oncogen. Como se esperaba, la distribución de las mutaciones refleja patrones observados anteriormente en los tumores humanos, aunque la frecuencia de las mutaciones TS fue menor (un reflejo de la menor cobertura de tales mutaciones por OncoMap). Los ejemplos incluyen
PIK3CA gratis (26%) y
TP53 gratis (13%) mutaciones en el cáncer de mama;
APC gratis (11%),
BRAF gratis (10%),
KRAS gratis (38%),
PIK3CA gratis (11%) y
TP53 gratis (9%) mutaciones en el cáncer colorrectal, y
EGFR gratis (12%),
KRAS gratis (23%) y
STK11 gratis (8%) mutaciones en el cáncer de pulmón. Se observaron las distribuciones de mutación que se esperan de ambas muestras congeladas y frescas FFPE, lo que subraya la utilidad potencial de OncoMap en el ámbito clínico.
Las mutaciones predecir la respuesta a terapias dirigidas
La Tabla 2 indica un conjunto de " procesables mutaciones genéticas del cáncer "identificados en el presente documento. La plataforma OncoMap detecta robustamente mutaciones que constituyen marcadores establecidos de respuesta a terapias dirigidas. Por ejemplo,
EGFR mutaciones
predictivos de la respuesta a erlotinib y gefitinib fueron identificados en la frecuencia esperada (12%) en el cáncer de pulmón de células no pequeñas, y
KIT
mutaciones ligadas a la sensibilidad a imatinib y se detectaron nilotinib en el 76% de los GIST. Curiosamente,
erbB2
mutaciones se detectaron en cuatro adenocarcinomas gástricos, aumentando la posibilidad de poner a prueba un inhibidor de HER-2, tales como trastuzumab en pacientes con cáncer gástrico seleccionados en base a este criterio genética [8].
Varios tumores albergaban mutaciones que pueden predecir la respuesta a los fármacos en investigación. Por ejemplo,
BRAF
V600E
se identificaron mutaciones en colorrectal (n = 16), de ovario (n = 1), la tiroides (n = 4) y endometrial (n = 1) tipos de cáncer, así como este tumor debe pediátricos (n = 22; véase más adelante). Los tumores que albergan estas mutaciones pueden responder a un selectivo
BRAF
inhibidor de [6], [9]. También se identificaron 96 muestras a través de siete tipos diferentes de cáncer (de mama n = 14, colorrectal n = 24, endometriales n = 15, de esófago n = 4, gástricos n = 34, de próstata n = 3, y de astrocitoma pediátrica n = 2) mutaciones que albergan ya sea en
PIK3CA
o
podría esperarse PTEN.
Estas mutaciones para enriquecer en tumores sensibles a los inhibidores de la PI3 quinasa actualmente en desarrollo.
las mutaciones predecir la resistencia a las terapias dirigidas
Junto con las mutaciones que confieren mayor sensibilidad a las terapias dirigidas, OncoMap robusta detectado mutaciones asociadas con la resistencia a varios agentes. ejemplos incluyen establecidos
KRAS
mutaciones en el cáncer no microcítico de pulmón de células (23%) y el cáncer colorrectal (38%) que confieren resistencia al erlotinib, gefitinib (pulmón) o cetuximab (colorrectal) [4], [10 ], [11]. Mientras que 94% de
KRAS
mutaciones identificadas localizan en los codones 12 o 13, 6% se produjo en el resto del gen (más comúnmente en el codón 61). Como la mayoría de los estudios de
KRAS
resistencia -asociado se han centrado exclusivamente en los codones 12 y 13 [3], [12], [13], OncoMap identificado adicional
KRAS
mutaciones que pueden influir en la sensibilidad a la tratamiento anti-EGFR. También OncoMap identificado un
HRAS
mutación en un adenocarcinoma de pulmón y un
ANR
mutación en un adenocarcinoma colorrectal. RAS mutaciones que implican isoformas alternativas son poco comunes en estos tipos de cáncer; Es concebible que éstos también pueden conferir resistencia a la terapia anti-EGFR.
Mutación de perfiles mutaciones también identificados que confieren "secundaria" resistencia a las terapias dirigidas (por ejemplo, alelos de resistencia que surgen durante el transcurso de la terapia dirigida). En los tumores GIST, donde 31
KIT
mutaciones fueron identificadas en 25 muestras; tanto primaria (imatinib-sensible) y secundaria (resistente a imatinib)
se observaron KIT
mutaciones, de acuerdo con estudios previos de mutación de perfiles de [7]. En particular, varios
KIT
mutaciones que implican el exón 9 (
KIT
Y503_or F504insAY; 5 casos) fueron detectados en los tumores GIST no tratados. Estas mutaciones se asocian con un aumento de las necesidades de drogas para provocar una respuesta clínica [14], [15]. Un predictivo
PDGFRA
mutación (D842V) de la resistencia a imatinib [15] también fue identificado en una muestra GIST.
El
AKT1
E17K
mutación ha sido previamente reportado en mama, colorrectal y cáncer de ovario. La plataforma OncoMap identificó raras
AKT1
mutaciones en estos tipos de tumores, así como única
AKT1
E17K
casos de endometrio, esófago escamoso, gástrico y cáncer de próstata. Esta mutación puede predecir la resistencia a la inhibición de la PI3 quinasa (y, posiblemente, inhibición del receptor tirosina quinasa) en algunos contextos [16].
Los cánceres con mutaciones Concurrentes "recurribles"
La presencia de co mutaciones que ocurren que implican genes críticos cáncer pueden modificar la respuesta clínica a un solo agente de la terapia dirigida. Aquí, 20 adenocarcinomas colorrectales (10, dos de endometrio y 8 gástricos) exhibieron co-produciendo
PIK3CA Opiniones y
KRAS
mutaciones. Aunque las mutaciones coincidentes en estos genes han sido previamente informado en los cánceres del intestino grueso [17],
PIK3CA
y
KRAS
mutaciones han mostrado un patrón típicamente mutuamente excluyentes de ocurrencia en el cáncer de endometrio [18 ], [19]. Un adenocarcinoma de endometrio con co-produciendo
FGFR2
y
también fue identificado mutaciones de PTEN
. Dos tumores coincidente albergado
BRAF
y
PTEN
mutaciones (uno de endometrio, colorrectal uno), y una muestra colorrectal adicional contenida tanto en un
PIK3CA Opiniones y un
BRAF
mutación. podría esperarse Estos tumores para exhibir resistencia a la inhibición del receptor de tirosina quinasa.
Clasificación Molecular of Pediatric tumores cerebrales por cáncer de mutación del gen de perfiles
La capacidad de realizar perfiles robusto mutación del tejido tumoral clínico y de archivo puede promover la caracterización molecular sistemática de los cánceres "huérfanos", incluyendo algunos tumores pediátricos, donde suficiente tejido es a menudo insuficiente. Para explorar esta hipótesis, OncoMap se utiliza para consultar una serie de gliomas de bajo grado pediátricos (LGGs) cuyo espectro de mutaciones se define de forma incompleta. Este análisis incluyó ADN genómico de 127 pediátrica y 28 gliomas adultos (para comparación) que abarcan cinco subtipos histológicos de astrocitoma pilocítico, ganglioglioma y astrocitoma difuso.
Candidato pronóstico o dianas terapéuticas en los tumores cerebrales pediátricos
p
Varios potencialmente "recurribles" genes del cáncer se encontró mutado en las AGL pediátricos. Los ejemplos incluyen
PDGFRA gratis (n = 1) y
PIK3CA gratis (n = 2), que puede predecir la respuesta a los fármacos existentes (por ejemplo, imatinib o nilotinib) o agentes de desarrollo (por ejemplo, PI3 inhibidores de la quinasa). Dos zonas de gobierno local pediátricos albergaban mutaciones en
MYC
, un homólogo del oncogén bien establecido de
NMYC
, que se amplifica e indicativo de mal pronóstico en el neuroblastoma pediátrico [20], [21]. Por lo tanto, la mutación de perfiles de tumor puede refinar la estratificación del paciente y /o pronóstico de la enfermedad en algunos cánceres cerebrales pediátricos.
BRAF
Las mutaciones V600E son comunes en este tumor debe Pediátrica
La duplicación de la
BRAF
locus se ha informado que la aberración más frecuente en las AGL pediátricos (66% [18]), mientras que la activación de mutaciones puntuales en
BRAF
se producen con menor frecuencia (4-6%) [22], [23 ]. Identificamos la activación de
BRAF
V600E
mutaciones en el 11% (10/88) de las AGL-pediátricos un porcentaje más alto que se informó anteriormente [22], [23]. Curiosamente, la
BRAF
V600E
mutación era más frecuente en el subtipo ganglioglioma de AGL pediátricos (clásicos y no clásicos; 8/14 tumores, p = 0,00005), como se muestra en la Fig. 2.
BRAF
V600E
mutaciones no fueron identificados en cualquiera de los tumores adultos examinados, aunque
TP53
mutaciones comúnmente se produjeron en esta configuración (10/28 casos). Por el contrario, sólo 2 gliomas pediátricos albergaban un
TP53
mutación; en ambos casos, esto era coincidente con otra mutación (
EGFR
y
FLNB
, respectivamente). Estos resultados sugieren que OncoMap podría facilitar la clasificación de los astrocitomas de bajo grado y otros tipos de tumores raros en base a criterios genéticos
Abreviaturas:. PA - astrocitoma pilocítico, grado I de la OMS; LGG, nn - glioma de bajo grado, no se especifique lo contrario, la OMS grado I o II; GG - ganglioglioma; A2 - astrocitoma de grado II de la OMS; HG - glioma de alto grado, la OMS grado III o IV. Los paréntesis indican el número total de muestras (en la carta) o número de muestras con la mutación indicada (tabla externa).
Discusión
Oncología Clínica se encuentra en medio de la transición de un paradigma de tratamiento dictada principalmente por el sitio anatómico de origen tumoral a uno en el que las características genéticas y /o moleculares juegan un papel decisivo en la elección de la terapia de guía. Por otra parte, la proliferación de agentes dirigidos en el desarrollo y la práctica clínica requiere la aplicación concomitante de los enfoques complementarios de diagnóstico que enriquecen a subpoblaciones con más probabilidades de responder a un fármaco. Por lo tanto, se necesitan nuevos enfoques diagnósticos que supervise cualquier tumor de mutaciones genéticas cruciales en múltiples genes del cáncer de forma simultánea, en contraste con la mayoría de las pruebas existentes que se centran en los genes individuales (o proteínas).
En este estudio, hemos adaptado genotyping- perfiles de mutación basado en la caracterización de las dos muestras de tumor congelados y FFPE derivados abarcan 12 tipos de cáncer. Nos robusta detectó mutaciones en el gen del cáncer que el uso clínico directo y predecir la resistencia a los agentes existentes, tales como inhibidores de la tirosina quinasa (por ejemplo,
EGFR
y
KRAS
mutaciones). También se identificaron múltiples mutaciones que pueden orientar el uso de agentes emergentes. Por último, en una investigación específica de los astrocitomas infantiles de grado bajo, hemos demostrado el valor especial de esta plataforma puede tener para los raros tipos de cáncer "huérfanos" mediante la identificación de mutaciones que pueden informar clasificación molecular, así como nuevas vías terapéuticas para niños con estas enfermedades malignas.
Las intervenciones de diagnóstico que se introducen con éxito mutación de perfiles de tumor para la práctica clínica deben sortear varios obstáculos técnicos y logísticos. El principal de ellos es la consecución de un rendimiento sólido en muestras derivadas de FFPE y /o material tumoral de archivo. Se encontró que la plataforma OncoMap logró casi el 100% de especificidad en tanto ADN tumoral fresco /congelado y derivados de FFPE, lo que indica que las llamadas de mutación de falsos positivos es probable que sean relativamente raro con este enfoque. Cabe señalar, sin embargo, que la consecución de este nivel de especificidad requerido la aplicación de una secuencia de análisis en el que los datos de genotipos en bruto se somete a la llamada base de automatizado seguido de revisión manual de mutaciones candidatos y validación de todos los candidatos usando químicas de genotipado alternativos. Por lo tanto, la aplicación clínica de OncoMap debe incorporar tanto la generación de datos genómica y experiencia analítica bioinformático en una patología molecular o el ajuste de diagnóstico clínico.
La sensibilidad de OncoMap está influenciada por parámetros tecnológicos inherentes, las características de rendimiento del ensayo de mutación individuales, y el calidad y pureza de tejido tumoral. La sensibilidad del ensayo 89 a 94% observada en este estudio es suficiente para muchos de traslación y aplicaciones clínicas; sin embargo, hay circunstancias de curso donde incluso mayores sensibilidades de ensayo será deseable. El enriquecimiento de las células tumorales mediante la disección del núcleo aguja o microdisección por láser de captura previa al establecimiento de perfiles mutación puede ofrecer una vía para mejorar la sensibilidad, sobre todo en tumores del estroma o donde el contenido inflamatoria es alta. Al mismo tiempo, la sensibilidad de OncoMap muy superior a la de la secuenciación de Sanger, que sigue siendo el estándar de oro para muchos enfoques de diagnóstico genético. Por otra parte, la amplitud de los genes del cáncer y mutaciones específicas interrogados por OncoMap apoyada por la sensibilidad y especificidad rigurosos antes mencionadas determinaciones sustancialmente superior a la de los perfiles genómicos basados en espectrometría de masas comercial existente se acerca [24].
terapias guiadas genómicamente pueden desempeñar un papel especialmente importante en los tumores raros en los grandes ensayos aleatorios son a menudo poco práctico. Para poner a prueba la capacidad de la OncoMap para identificar tumores poco comunes y /o la muestra limitada que pueden beneficiarse de determinadas clases de agentes terapéuticos, perfilamos un panel de gliomas de bajo grado pediátricos para mutaciones genéticas comunes de cáncer. El conocimiento de las anomalías genéticas presentes en las AGL pediátricos es limitada, aunque estudios recientes han identificado
BRAF
translocaciones, duplicaciones cromosómicas y mutaciones de bases ocasionales en astrocitomas de bajo grado [18], [25], así como diversa mecanismos de activación de la vía ERK /MAPK en astrocitoma pilocítico [23]. Estos hallazgos sugieren que los inhibidores de molécula pequeña de
BRAF
ya en los ensayos de adultos también puede representar la terapéutica prometedora para subconjuntos de estos tumores. Nuestros resultados indican que la frecuencia de
BRAF
mutaciones puntuales en las AGL pediátricos en su conjunto puede ser más alta que la publicada, y en concreto de que este tumor debe poseer
BRAF
mutaciones V600E en muy alta frecuencia . Esta observación también puede ayudar en la identificación de diagnóstico de estos tumores. Gangliogliomas, que tienden a ser tumores indolentes, por tanto, pueden compartir algunas propiedades con nevos cutáneos, cuyos precursores de melanocitos también proceden del sistema nervioso (cresta neural), mostrando un crecimiento indolente, y donde el
BRAF
V600E mutación también es altamente prevalente. También se identificaron varias mutaciones no han sido registradas con astrocitoma pediátrica, algunos de los cuales (
EGFR
,
PIK3CA
,
PDGFRA
) constituyen un objetivo potencialmente viables. En concordancia con los informes anteriores [22], [26], [27] se observa que las mutaciones en los genes frecuentemente observadas en los astrocitomas y /o glioblastomas anaplásico adultos, como
TP53
o
PTEN
, sólo son rara vez se encuentra en pilocíticos y de bajo grado astrocitomas difusos pediátricos.
a pesar de que nuestros resultados apoyan la viabilidad clínica de alto rendimiento de perfiles de mutación del tumor, reconocemos que el enfoque de espectrometría de masas genotipado tiene ciertas limitaciones que pueden impedir su aplicación como una plataforma de diagnóstico de cáncer definitivo. Estos incluyen el número finito de mutaciones puntuales específicas que se pueden ensayar (designado
a priori
dentro de un subconjunto de los genes del cáncer), las dificultades en el diseño de ensayos de genotipificación que identifican pequeñas inserciones o deleciones ( "in-dels") más grande que ~50bp en tamaño, una incapacidad para detectar la mayoría de las mutaciones de genes (TS que pueden ocurrir en cualquier lugar dentro del gen, no sólo "punto caliente" regiones) o alteraciones genómicas adicionales tales como amplificaciones de genes de alto nivel o supresiones que también pueden afectar los genes clave del cáncer y la naturaleza un tanto en mano de obra intensiva de revisión manual y validación de un ensayo ortogonal. A largo plazo, la adaptación de las nuevas tecnologías genómicas tales como la secuenciación de segunda generación puede ofrecer un enfoque unificador para perfiles integral mutación del tumor. Sin embargo, la plataforma OncoMap puede ofrecer una vía inmediata por el cual perfiles mutación sistemática podría ser iniciada para guiar el diseño de ensayos clínicos, así como el uso de agentes dirigidos existente a través de muchos tipos de cáncer.
En resumen, este estudio representa la primera aplicación a gran escala de la plataforma OncoMap para el perfil de mutación del tumor en el ámbito clínico y de archivo. Por tanto, estos resultados dan vida a un marco en el que el perfil del tumor sistemática podría surgir como un medio ampliamente viables para guiar la estratificación de pacientes para la terapéutica del cáncer racionales. A pesar de la complejidad inherente de cáncer, que incorpora el creciente conocimiento de las bases moleculares del cáncer en ambos estudios epidemiológicos moleculares a gran escala y, en última instancia, toma de decisiones clínicas en última instancia, debería acelerar el advenimiento de las terapias contra el cáncer más eficaces.
Apoyo información
Métodos S1.
de perfiles mutaciones genéticas del cáncer críticos en muestras de tumores clínicos
doi:. 10.1371 /journal.pone.0007887.s001 gratis (0.07 MB DOC)
Tabla S1.
OncoMap 3 centrales de cebadores de PCR y la sonda de extensión secuencias
doi: 10.1371. /journal.pone.0007887.s002 gratis (XLS 0.13 MB)
Tabla S2.
KRAS
secuencias de cebadores de PCR usados G12 para generar amplicones de Sanger y secuenciación de Illumina
doi:. 10.1371 /journal.pone.0007887.s003 gratis (0.03 MB XLS)
figura S1.
Rendimiento de OncoMap en el ADN congelado y FFPE derivado de fresco. curvas características de operación del receptor (ROC) se representan por (panel izquierdo) fresco congelado y derivan FFPE (panel derecho) ADN, ensayos contra OncoMap KRAS unidireccionales, a partir de datos de Illumina como una verdad-conjunto (ver Métodos S1).
doi : 10.1371 /journal.pone.0007887.s004 gratis (0.06 MB PPT)
Reconocimientos
agradecemos a Nicholas WYHS, Benjamin Ebert y Sewit Tekki de conocimientos técnicos; Suely Marie para proporcionar muestras de carcinoma. secuenciación de Sanger se completó a Agencourt Bioscience Corporation, la secuenciación de Illumina en el cofactor de la genómica.