Extracto
Antecedentes y Objetivo
La expresión alterada de microRNAs (miRNAs) distintivos muchos tipos de cáncer. El estudio de las asociaciones de perfil de expresión de miRNA y el fenotipo del cáncer podría ayudar a identificar los vínculos entre la desregulación de la expresión de los genes miARN y las vías oncogénicas.
Métodos
De perfiles de expresión de 866 miRNAs humanos en 19 y 17 colorrectal se investigó los cánceres de páncreas y en los tejidos normales adyacentes emparejados. Clásica prueba t pareada y análisis aleatorios forestales se aplicaron para identificar miRNAs asociados a tumores específicos de tejido. Se realizó el análisis de redes basado en un enfoque computacional para asociaciones de minas entre los tipos de cáncer y miRNAs.
Resultados
La fusión entre los dos métodos estadísticos utilizados para intersectar los miRNAs expresados diferencialmente en el cáncer de colon y de páncreas permitido la identificación de alteraciones miARN específicos del cáncer. Por análisis de miARN-red, se trazaron las pautas específicas de tejido de miARN desregulación: los miRNAs de conducción fueron
miR-195, miR-1280, miR-140-3p
y
MIR-1246 Hoteles en tumores colorrectales, y
miR-103, miR-23a
y
miR-15b Hoteles en los cánceres de páncreas.
Conclusión
perfiles de expresión de miARN puede identificar el cáncer firmas y biomarcadores específicos de potencialmente útiles para el diagnóstico de cánceres específicos de tejido. ayuda análisis de miARN-red Identificar alterada miARN redes reguladoras que podrían desempeñar un papel en la patogénesis del tumor
Visto:. Piepoli A, F Tavano, Copetti M, T Mazza, Palumbo O, Panza A, et al. Perfiles (2012) miARN expresión identificar a los conductores en colorrectal y cáncer de páncreas. PLoS ONE 7 (3): e33663. doi: 10.1371 /journal.pone.0033663
Editor: Alfons Navarro, Universidad de Barcelona, España |
Recibido: 17 Noviembre 2011; Aceptado: 14 Febrero 2012; Publicado: 30 Marzo 2012
Derechos de Autor © 2012 Piepoli y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Sanidad italiano otorga RC0903GA51, RC1003GA52, RC1103GA47, RC0903CH47, RC1003CH50, RC1103CH46, RC1003BS14 y RC1102BS45 través de la Unidad de Investigación de Gastroenterología, la Unidad de Investigación de Cirugía, y la Unidad de Bioestadística; y la Casa Alivio del Sufrimiento (IRCCS), San Giovanni Rotondo (FG), Italia. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los microARN (miRNA) son pequeñas moléculas de ARN no codificante de proteínas que regulan la expresión de genes principalmente a nivel de la síntesis de proteínas [1]. Representan un sistema altamente conservada evolutivo que controla los procesos celulares fundamentales, tales como el desarrollo, la diferenciación, proliferación, la apoptosis y el metabolismo [2]. La expresión aberrante de miRNAs puede surgir de deleción, mutación, y la metilación de los genes miARN-codificación, muchos de los cuales se encuentra en los sitios frágiles o regiones genómicas con frecuencia eliminados o amplificadas en el cáncer [3]. Sobre la base de estas premisas, se han demostrado para interactuar con los oncogenes potenciales o supresores de tumor [4]. Muchos miRNAs se expresan de una manera específica de tejido, con perfiles expresados diferencialmente en los tejidos, ya sea normales y neoplásicas, y en los tumores con propiedades biológicas distintas. Además, algunas evidencias indican los perfiles de miARN para permitir una identificación fiable del origen celular de los tumores [5].
Clásicamente, la expresión diferencial de miRNAs se ha evaluado, en cuanto contribución única o como la firma de predicción [6 ], [7]. Sin embargo, gran parte del esfuerzo científico se gasta actualmente para dilucidar sus funciones: la mayoría de los miRNAs control de al menos un ARNm, y la mayoría de los ARNm son controlados por más de un [8] miARN. La complejidad detrás de este sofisticado mecanismo puede ser parcialmente aliviado por el conocimiento de los niveles de conservación de cada miRNA. De hecho, gran conservación en amplias distancias filogenéticas ayuda a restringir el rango de funciones que puede desempeñar un miARN para regular el control del desarrollo de las especies y la fisiología.
En este estudio, hemos investigado los patrones de expresión de miRNAs en colorrectal (CCR) y el cáncer pancreático (PC) con la intención de identificar las redes de regulación miARN probablemente implicados en las vías oncogénicas mediante la evaluación de las firmas específicas del cáncer a través del análisis de la relación entre los genes miARN perfil de expresión y el cáncer de linajes.
Materiales y Métodos
muestras para selección y extracción de RNA
El tumor primario y los tejidos no tumorales vecinas se obtuvieron a partir de dos cohortes de formación de 19 pacientes con CRC y 17 pacientes de PC, y de dos cohortes de validación de 14 CRC y 21 pacientes de PC .. el estudio se llevó a cabo con la aprobación de los comités científicos y éticos del IRCCS "Casa Alivio del Sufrimiento" Instituto, San Giovanni Rotondo, FG (Italia). Los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito de acuerdo con la ley italiana sobre la privacidad (que prevé la protección de datos personales), por lo que los individuos no pueden ser identificados a partir de los datos o imágenes incluidas en esta publicación, y aprobados por los comités científicos y éticos del IRCCS " Casa Alivio del Sufrimiento "Instituto. Todas las investigaciones clínicas se han realizado de acuerdo con los principios expresados en la Declaración de Helsinki.
Los datos del paciente clínicos, la localización del tumor y la estadificación se muestran en la Tabla S1. Las muestras de tejido fueron de flash congeló en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 ° C hasta la extracción de ácidos nucleicos. Acerca de 150-200 mg de tejidos congelados frescos se utilizan para aislar el ARN total por extracción con fenol (reactivo TRIzol, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, EE.UU.). La concentración de ARN y la pureza fueron controlados por Nano gota Specthophotometer. El Agilent 2100 Bioanalyzer se utilizó para medir la cantidad, la integridad y pureza del ARN pequeños y el ARN total, y sólo ARN no degradado se caracteriza por un número de integridad del ARN & gt; 7 sin signos de contaminación de ADN fue procesada
Mirna. microarrays
perfil miARN expresión se determinó mediante el uso de GeneChip® miARN array (www.affymetrix.com). Esta matriz contiene 46.228 sondas que comprenden 7.815 sonda fija, incluidos los controles, y abarca 71 organismos, tales como humanos, ratones, ratas y perros. El contenido se deriva de la base de datos V.11 Sanger miRBase miARN (15 de abril de 2008, http://microrna.sanger.ac.uk). Probe conjuntos de orientación snoRNAs humanos y scaRNAs se derivan de la snoRNABase (www.snorna.biotoul.fr/coordinates.php) y los archivos Ensembl (www.ensembl.org/biomart/martview~~number=plural), Brevemente, 1,5 g de RNA total se marcó utilizando la matriz 3DNA kit de detección FlashTag ™ RNA Labeling (http://www.genisphere.com), de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. En primer lugar, poli (A) del tizón se realizó a 37 ° C durante 15 min en un volumen de 15 ml de la mezcla de reacción, que contenía 1X tampón de reacción, 1,5 ml de MgCl2 [25 mM], 1 l ATP Mix diluyó 1:500 y 1 enzima PAP l. En segundo lugar, Flash Tag La ligación se realizó a temperatura ambiente durante 30 min mediante la adición de 4 l de 5X Tag flash ligadura Mix biotina y 2 l de T4 ADN ligasa en los 15 l de mezcla de reacción. Para detener la reacción, se añadieron 2,5 l de solución de parada. Se hibridaron muestras, se lavan y se escanearon con un escáner Affymetrix.
Todos los datos de microarrays MIAME son conformes y los datos en bruto ha sido depositado en ArrayExpress (número de E-MTAB-752 de los perfiles de expresión de genes miARN cáncer de colon y E- MTAB-753 para el cáncer pancreático miARN perfiles de expresión).
estimación cuantitativa de los genes miARN mediante transcripción inversa en tiempo real el ensayo de PCR
reacción en cadena de polimerasa cuantitativa en tiempo real (qPCR) de miRNAs se realizó a través TaqMan MicroARN ensayo (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) con el sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7700. Un protocolo de dos etapas requiere la transcripción inversa con un cebador-miARN específico, seguido de una PCR en tiempo real con sondas TaqMan. Los ensayos se dirigen sólo miRNAs maduros, no sus precursores. En breve, revertir reacciones de la transcriptasa contenían 10 ng de muestras de ARN, 50 nM de horquilla cebador RT, tampón 10X RT, 0,25 mM de cada uno de los dNTP, 3,33 U /l MultiScribe RT y 0,25 U inhibidor de RNasa /l (todos comprados a partir de cDNA Archivo kit de Applied Biosystems) se realizaron en un volumen final de 15 l y se incubaron en el ciclador termal durante 30 minutos a 16 ° C, 30 min a 42 ° C, 5 min a 85 ° C y después se mantiene a 4 ° C. La mezcla de reacción de PCR incluyó 20 l 1,3 l producto de RT (1:15 DILUCIÓN), 10 l de 2X TaqMan PCR Universal Master Mix (NoUmpErase UNG) y 1 l de 20X TaqMan MicroARN ensayo (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) . Las reacciones se incubaron en una placa óptica de 96 pocillos a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos y 60 ° C durante 10 min. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.
Análisis estadístico
características basales de los pacientes se informaron como media ± desviación estándar (SD) o frecuencias y porcentajes para las variables continuas y categóricas, respectivamente.
Para cada una de las dos cohortes de entrenamiento, datos del chip de microARN se normalizaron utilizando el algoritmo robusto gama Multi-media (RMA) [9]. Con el fin de identificar miRNAs expresados diferencialmente entre los tejidos normales y tumorales emparejadas, se siguieron dos enfoques. En primer lugar, un t pareada prueba clásica para controlar la tasa de falso descubrimiento (FDR) permitió la clasificación de miRNAs en función de sus valores de p. En segundo lugar, se aplicó al azar forestal (RF) el análisis [10] para detectar miRNAs con la mejor capacidad para discriminar tumor de los tejidos normales emparejados. A RF es un clasificador que consiste en un conjunto de clasificadores con estructura de árbol. Según esta técnica, 100.000 árboles se construyeron para clasificar los tejidos. El conjunto de aprendizaje utilizadas para el cultivo de cada árbol era un .632+ remuestreo bootstrap de las observaciones. Los árboles se dejaron crecer a su tamaño completo y sin poda. La mejor división en cada nodo fue seleccionado de un subconjunto aleatorio de miRNAs. Las observaciones que dejan de salida (es decir, "fuera de bolsa" observaciones) fueron entonces predijeron para obtener la tasa de error de clasificación del árbol considerado. capacidad predictiva del clasificador se evaluó la agregación de los índices de error de árboles individuales. Por otra parte, el marco azar forestal nos permitió estimar la importancia de una variable al ver cuánto aumentará el error de clasificación, cuando "fuera de bolsa" de datos para esa variable se permutan mientras que todos los demás permanecerán sin cambios. La métrica de importancia utilizado fue el descenso medio de la Precisión (MDA). La MDA se construye mediante la permutación de los valores de cada variable del equipo de prueba, la grabación de la predicción y comparándola con la predicción de prueba no-permutado de la variable. Por lo tanto, es el incremento en el porcentaje de veces que un conjunto de ensayo se clasificó erróneamente cuando se permutó la variable. Seguimos Strobl et al. [11] Para evitar posibles sesgos en la selección de variables: árboles de clasificación se construyeron usando submuestreo sin sustitución y la adopción de un esquema de permutación condicional [12]. Se obtuvo una clasificación de miRNAs de acuerdo a la importancia variable medida. Por último, las dos clasificaciones miARN, uno del análisis clásico y uno de los análisis de RF, se fusionaron para obtener una lista de miRNAs expresados diferencialmente. Las correlaciones entre los genes miARN expresión se estimaron mediante el coeficiente de Spearman. Un valor de p & lt; 0,05 se consideró la significación estadística. Todos los análisis se realizaron con SAS versión 9.1 (SAS Institute, Cary, NC, EE.UU.) y R para el análisis al azar forestal (
randomForest
paquete).
cuantitativa en tiempo real el ensayo de PCR (qPCR) se utilizó en las cohortes de validación externa para confirmar microARN resultados de la matriz, los cuales fueron evaluados utilizando el método y los valores predeterminados de umbral comparativa ciclo umbral (CT). expresiones relativas de los genes miARN se calcularon por 2
-ΔΔCt fórmula [13] utilizando U6 pequeños ARN nucleares (RNU6B) como control de normalización. Desde el 2
-ΔΔCt valores transformados no se distribuyen normalmente, las comparaciones se hicieron usando la no paramétrica de Wilcoxon firmado prueba de los rangos con el fin de evaluar la significación estadística de la regulación hacia arriba o hacia abajo. Para los análisis de validación qPCR, se consideró que un tamaño de muestra de 14 sujetos para proporcionar una potencia del 90% (con un alfa de dos caras = 0,05) para detectar una sobre regulación de al menos 2 o una regulación a la baja de a lo sumo 0,5 de la expresión de cada uno de los genes miARN en términos de 2
-ΔΔCt utilizando la no paramétrica de Wilcoxon firmado prueba de rangos y 1 como la hipótesis nula.
el análisis de redes
Para cada uno de los dos cohortes de formación de una la red no dirigido y ponderado se construyó, donde los nodos y los bordes representan miRNAs y sus correlaciones (cuando es significativo), respectivamente. Por lo tanto, los bordes no están orientados desde correlación es simétrica, y ponderados con el coeficiente de Spearman. El espesor de los bordes refleja la magnitud de los pesos. Con el fin de profundizar los nodos críticos de ambas redes de CRC y PC, tomamos prestado algunos de los métodos de las ciencias sociales, y evaluamos los siguientes
centralidad
medidas:
grado
,
intermediación
y
coeficiente de agrupamiento
[14], [15] para cada red. Por último, los miRNAs se han clasificado en consecuencia.
Todas estas medidas (o indicadores) se basan en el recuento de enlaces o caminos más cortos. En detalles, vamos a definir un camino desde que, con el conjunto de nodos, como una secuencia alternante de nodos y bordes, que comienzan con y terminando con, de tal manera que cada borde conecta su precedente con su vértice subsiguiente. Hemos establecido la longitud de un camino que sea la suma de los pesos inversas de sus bordes. La idea es que los miRNAs altamente correlacionados minimizar la distancia entre los nodos o, desde otro punto de vista, los dos nodos más cercanos son tanto más se están correlacionados. Por lo tanto, se calcula la distancia entre dos nodos y, por escrito, ya que la longitud mínima de cualquier vía de conexión y por dentro. Por definición, para cada.
Grado
central se basa en la idea de que los nodos importantes son los que tienen el mayor número de enlaces a otros nodos en el gráfico. A menudo se interpreta en términos de la participación inmediata de los nodos en las relaciones establecidas a través de la red. Deje que sea el peso de la arista, que conecta el nodo con el nodo, la centralidad de grado de un nodo es, con el conjunto de aristas, según la cual el es el valor más alto grado, el más importante (a nivel mundial correlacionados) es el nodo .
betweenness
centralidad mide la influencia que un nodo tiene sobre la correlación indirecta entre nodos vecinos no. Intermediación, en su versión básica, se calcula como la fracción de caminos más cortos entre pares de nodos que pasan a través del nodo de interés. Su expresión matemática es, donde es el número de rutas más cortas a partir de, y es el número de rutas más cortas a partir de que pasan por un vértice. Vértices que se producen en muchos caminos más cortos entre otros vértices tienen una mayor intermediación, y luego más alta relevancia en correlaciones indirectas.
El
coeficiente de agrupamiento
es una medida del grado en el que los nodos en un gráfico que tienden a el grupo junto, o en otros términos, que cuantifica los nodos debido a la medida en que sus vecinos han de ser un
camarilla gratis (gráfico completo) con ella. El coeficiente de agrupamiento de un nodo a continuación, viene dada por la proporción de enlaces entre los nodos dentro de su vecindad, dividido por el número de enlaces que eventualmente pudieran existir entre ellos. Sucintamente, se expresa como, donde define los vecinos conectados inmediatamente conjunto de y. Su formulación 'ponderado' se basa en el peso de la
triángulos
ha centrado en los nodos de una red. Se define por Horvath y Zhang [16] como dónde está el peso sobre el borde, y por lo tanto el producto de los pesos de los bordes que forman un triángulo cerrado de nodos. A partir de la definición local de la agrupación coeficiente, nos informan de su formulación promediado por Schank y Wagner [17] para toda la red como el cociente entre la suma de los productos de los coeficientes de la agrupación y una función de peso en general, y la función de peso propio , a saber dónde está la función de peso en general. La función de ponderación se elige generalmente entre las métricas que capturan mejor la topología de la red bajo examen. Un menor
Media de la agrupación coeficiente ponderado
medida indica un nodo más importante en relación a la robustez de la red.
Las redes se han elaborado y se analizaron mediante una herramienta independiente de encargo escrito en C#y construido sobre la biblioteca NodeXL 1.0.1.174 [18].
Resultados
miARN expresión alterada en pacientes con CCR y PC
Se compararon los perfiles de miARN de 36 pares de tumores sólidos y tejidos adyacentes nontumorous en las cohortes de formación (19 CRC y 17 PC) por medio de microarrays de microARN. miRNAs humanos (
tiene miR-
) y los tejidos fueron agrupados por un análisis de agrupación jerárquica (Figura 1). Cada sonda fue trazada con código de color para igualar el nivel de expresión del miARN relación a su nivel medio de expresión a través de las muestras de tejidos de todo el conjunto (azul, bajo, rojo, alto). (Figura 1)
perfiles de miARN de 36 emparejados muestras de tejido de cáncer colorrectal 19 (cuadro naranja) y 17 de cáncer de páncreas (caja verde) de los pacientes se agruparon. Las 36 muestras pareadas están en filas (barras de color) y los 866 miRNAs están en columnas. T, tejido tumoral; . N, tejido normal adyacente
diferencialmente expresado miARN en el CCR y PC
Con el fin de identificar miRNAs expresados diferencialmente en los tejidos normales y tumorales emparejadas, se siguieron dos enfoques: un asociado más clásica t-test para el control de tasa de falso descubrimiento (FDR) y un análisis de RF. Por el primer análisis, 42 miRNAs se expresan diferencialmente en CRC (Tabla 1). Veinticinco de ellos fueron sobreexpresados, con
HSA-miR1246
que muestra el valor de factor de cambio más alto (12,0 veces). En PC, 128 miRNAs fueron expresados diferencialmente (véase la Tabla S2). En particular, de 34 miRNAs con una p & lt; 0,01, 30 mostraron mayores niveles de expresión en el tejido tumoral, con
hsa-miR-23a
presentan el valor más alto factor de cambio (9,3 veces), mientras que 4 miRNAs más se redujeron reguladas (Tabla 2).
para determinar la eventual existencia de ortólogos en otras especies, y para utilizarlos como control metodológico interno, los miRNAs humanos encontró alterada en los dos sólidos los tumores fueron comprobados en otros 71 organismos presentes en la matriz: todos los ortólogos-de regulación de miRNAs humanos (de ahora en adelante,
ha miR-
se hace referencia como
miR
) mostraron una expresión diferencial significativa con el factor de cambio similar en estos organismos (Tabla S3).
Para comprobar la exactitud de la RF, se informó de las actuaciones de clasificación en el tumor discriminar entre tejido normal en la escala multidimensional de las parcelas de la matriz de proximidad estimados (Figura 2) presentan similitudes o diferencias en los datos. Para cada tipo de tumor, las filas de los miRNAs más importantes, de acuerdo con la MDA, fueron derivados (Figura 3, los grupos A y B).
matrices de proximidad de análisis al azar forestal, donde
x
y
y-
ejes son las coordenadas del escalamiento multidimensional. Los sujetos con expresiones miARN similares están representados por puntos cercanos uno a otro, mientras que los sujetos con expresiones miARN diferentes están representados por puntos separados. Rojo = tejido tumoral, Negro = tejido normal adyacente.
media de la disminución en la precisión (MDA) como medida de la importancia de los genes miARN en la clasificación de los tejidos tumorales de las normales estimados por análisis al azar forestal. Se muestran los primeros 42 miRNAs más importantes en el cáncer colorrectal (panel A) y 50 miRNAs en el cáncer de páncreas (panel B).
Comparación de los métodos de detección de la firma miARN
Cuando los resultados con la prueba t de RF y se fusionaron, se encontró una coincidencia significativa entre los miRNAs detectado en cualquiera de CRC y los tejidos de PC. Por la intersección de los miRNAs con p & lt; 0,001 en el análisis de la prueba t (Tabla 1) con los que tienen la más alta de la MDA en el análisis de RF (Figura 3A), la expresión de 24 miRNAs se alteró significativamente en el CCR (Figura 4). Por un enfoque analítico similar (Tabla S2, y la Figura 3B), 23 miRNAs se alteraron significativamente en PC (Figura 4).
En ambos tejidos un solapamiento significativo entre los miRNAs detectado fue encontrado por la fusión de t-test y RF resultados. Se obtuvieron un grupo de 24 miRNAs, cuya expresión se modificó significativamente en los tumores colorrectales, que corta la lista de los primeros 42 miRNAs con mejores valores de p, a partir del análisis de la prueba t, con las personas con mayor MDA, a partir del análisis de RF. De la misma manera, se seleccionaron 23 miRNAs con expresión alterada en los tumores pancreáticos. * P & lt; 0,001; § RF & gt; 4,3; ** P & lt; 0,05;#RF & gt;.
0,94
Como se muestra en la Figura 4, la expresión de los genes miARN fue muy específico de tejido; de hecho, la mayoría de miRNAs con expresión alterada en CRC no se expresaron differentiallly en el tejido tumoral pancreática. La expresión alterada de sólo dos genes miARN fue compartida por el CRC y el PC:
miR-145
apareció de 2,2 veces las reguladas (p & lt; 0,001) en el CCR, y 5,7 veces sobre-regulado (p & lt; 0,01) en PC, mientras que
MIR-1280
era 2,1 veces sobre-regulado (p & lt; 0,001) y 2,3 veces las reguladas (p & lt; 0,05) en los cánceres temprana y tardía, respectivamente (véase el cuadro 1, la Tabla 2 y la Tabla S2).
correlaciones miARN y el cáncer de miR-red
a continuación tratamos de verificar la interrelación de miRNAs seleccionados previamente expresado en cualquiera de los tejidos CRC y PC por medio del Spearman coeficiente de correlación método
para CRC, diferentes grados
Red de correlación se encontraron resultados para los 24 miRNAs que muestran expresión alterada:.
miR-106a
no estaba correlacionado en absoluto, mientras
miR-195
exhibió el mayor número de lazos y fue tomado como un nodo raíz con 9 bordes (
grado
15.86); Se detectaron 8 enlaces para
miR-28-3p gratis (
grado
15,66), y 7 enlaces para
MIR-1280 gratis (
grado
13.79) ,
MIR-1246 gratis (
grado
13.05), y
miR-140-3p gratis (
grado
12.12) (Figura 5, panel A) . Los últimos 3 nodos también estaban interconectados con
miR-28-3p
, que mostró un alto valor de intermediación. Para esta última medida, se observó el valor más alto para
MIR-1246
nodo en el que se producen muchos caminos más cortos entre otros vértices (Tabla S4). Otra importante nodo estuvo representado por
miR-18a
con 6 relaciones, 3 de ellas establecida con varios miRNAs pertenecientes a la
miARN 17-92a
clúster. Cuando se midió el grado de agrupamiento ganglionar (c
lustrado coeficiente
), el
miR-378, miR-10b
y
miR-31
que parecía ser un
cliqu
e con vértice en
miR-28-3p
. Para verificar la robustez de la red, se calculó el
ponderada media de la agrupación coeficiente
, y se evaluó la contribución de un miARN a la compacidad global de la red. Se observó que las puntuaciones más bajas para
MIR-1280, miR-195
y
miR-140-3p
cuales eran los vértices del grafo completo (Figuras 5, panel A y la Tabla S4).
los puntos verdes representan los nodos correspondientes a 24 miRNAs de la red CDN y 23 miRNAs de red de PC. Los bordes caracterizan las correlaciones significativas, cuyo espesor refleja coeficientes de correlación de Spearman (azul y bordes verdes se utilizan para las correlaciones positivas y negativas, respectivamente). En la red de CRC, como se muestra en el panel A, m
iR-195, miR-28-3p, MIR-1280, miR-18a
y
MIR-1246
exhiben el más alto
rango
grado ponderado. No hay correlación se encuentra para
miR-106a
.
MIR-1246
tiene también el más alto
intermediación
rango. En la red de PC, como se muestra en el panel B,
miR-103, miR-23a
y
miR-15b
tiene la más alta
grados Opiniones y están relacionados con las
miR-199a-3p
, así como entre sí formando un cuatro nodos
camarilla
. Además, la eliminación de estos nodos provoca la caída más profunda del rango promedio coeficiente de agrupamiento.
miR-384
exhibe la más alta medida intermediación centralidad.
Veinte de los 23 miRNAs con una desregulación significativa en los tejidos de PC estaban vinculados a otros vértices de la red por un número de aristas que varía de uno a cinco (
grado
: de 8.88 a la 1,92); por sólo 3 miRNAs (es decir,
miR-30d *, MIR-1280
y
miR-493 *
) no se observó correlación significativa (
grado
: 0), ( Figura 5, panel B). En particular, se encontró que el número máximo de vínculos para
miR-103 gratis (
grado
: 8,88),
miR-23a gratis (
grado
: 8,84) y
miR-15b gratis (
grado
: 8,38). Estos 3 nodos principales se derivaban
miR-199a-3p gratis (grado: 6,03) y estos cuatro genes miARN-apareció entre cruzados para constituir una camarilla de cuatro nodos. Se observó que la medida más alta centralidad de intermediación para
miR-384 gratis (
intermediación
: 0,31), que se encuentra a posicionarse críticamente en el medio (por lo tanto, responsables de muchos) correlaciones de rango medio. Verificamos la esencialidad del cuatro nodos
camarilla fotos: por medir la solidez global de la red (en términos de caminos redundancia) después de quitarlo. Hemos calculado el
promedio ponderado coeficiente de agrupamiento
para toda la red, eliminando a su vez un nodo. En particular, después de excluir los nodos de la
camarilla gratis (
miR-103, miR-15b, miR-199a-3p
y
miR-23a)
los rangos más bajos , es decir, se obtuvieron 5,78, 5,85, 6,05 y 6,14, respectivamente. Este hallazgo señala que estos nodos como constituyente funcionalmente relevante y tan considerable de la cohesión de la red (Figura 5, panel B y en la Tabla S4).
Validación qPCR
Entre los miRNAs desregulados en forma significativa el estudio de microarrays, se seleccionaron 18 para su posterior validación por cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR). La selección de estos miRNAs se basa en dos criterios: el resultado del análisis de intersección se ha descrito anteriormente, y /o su implicación en la tumorigénesis de colon o páncreas (según los datos de la literatura). PCR cuantitativa se aplicó para analizar la expresión alterada de los miRNAs seleccionados, así como la del control RNAU6, en el tumor y los tejidos normales tomado de nuevo las cohortes de validación de 14 pacientes con CRC y 21 pacientes de PC.
en comparación con el tejido normal con un perfil de expresión normalizado a 1, en muestras de tumores de los 14 pacientes con CRC se observó una regulación significativa durante 3 miRNAs (
miR-31, miR-21
y
miR 708
), y bajo la expresión en otros 7 (
miR-145, miR-139-5p, miR-486-5p, miR-378, miR-140-3p, miR-143 y
miR-30c
) (Tabla 3). Los restantes 8 miRNAs (
miR-151-5p, miR-155 *, miR-17, miR-199a-5p, miR-23a, miR-30a-5p, miR-455-3p, y miR-let- 7i
) no mostró expresión alterada de manera significativa.
en la cohorte de 21 pacientes de PC, 13 de los 18 miRNAs fueron analizados por qPCR en el tejido tumoral en comparación con las muestras normales. Abajo-expresión se observó sólo para
miR-21
, mientras que se observó un exceso de expresión de 12 genes miARN (
miR-143, miR-145, miR-151-5p, miR-155 *, MIR -199a-5p, miR-23a, miR-30a, MIR, 30c, miR-21, miR-455-3p, miR-708
y
miR-vamos-7i
) y sólo dos eran no desregulada de una manera estadísticamente significativa (
miR-30a y miR-
30c) (Tabla 3).
Discusión
MiRNAs que se expresan diferencialmente en diversos tipos de cáncer pueden participar en las vías de regulación alterados comunes [19]. Por lo tanto, el conocimiento de su red interactuante puede proporcionar una perspectiva de miRNAs alterados y su patrón de desregulación (es decir, la altura o baja regulación). En este estudio, hemos perfilado miRNAs en dos tejidos cancerosos sólidos diferentes, el CRC y el PC, para probar si cualquier "firmas" plausible era detectable. Para este propósito, que inicialmente parecía para miRNAs expresados diferencialmente en los tumores y el tejido normal de los dos linajes diferentes, y posteriormente identificado miRNAs "específicos de tejido" mediante el uso de un enfoque estadístico novela, es decir, el clasificador de RF. Para cada tejido canceroso hemos sido capaces de generar una lista de los miRNAs más específicos como en el liberalizado significativamente. Curiosamente, en las dos listas sólo dos miRNAs se repitieron pero con patrones opuestos de la expresión:
miR-145
y
MIR-1280
. Sin embargo, aunque se reconocen diferentes patrones de la expresión de
miR-145
[20], nada se sabe acerca de
MIR-1280
y su comportamiento en los tumores sólidos.
Un análisis exhaustivo de las redes interactivas de estos miRNAs mostró que sus patrones de desregulación son específicos de tejidos, como se observaron conexiones diferentes (es decir, diferentes patrones de correlación) entre ellos en los dos linajes. Por otra parte, se determinó la miRNAs más críticos y verificamos que eran diferentes en el CCR y en las redes de PC.
Para entender los mecanismos de regulación de los miRNAs vinculados con conexiones significativas en ambas redes, se llevó a cabo una de tres pasos
in silico-
análisis. En primer lugar, que clasificó nodos por medio de índices de centralidad conocidos: ponderados
grado
y
intermediación
. Mientras que el índice anterior proporcionó información sobre el efecto directo ejercido por cada nodo a su vecindario (en nuestro caso, su correlación), este último identificado nodos esenciales para las correlaciones indirectas, es decir, los nodos que se encuentran en vías de correlación y que de alguna manera contribuye a largo alcance correlaciones. En consecuencia, que clasificó nodos con el
coeficiente de agrupamiento
índice, con el fin de medir su grado de cohesión con los vecinos inmediatos. El objetivo fue cuantificar la robustez de las redes, mediante la búsqueda de los nodos que podrían causar problemas en la arquitectura de las redes cuando no se tiene en cuenta. Para este fin, se calculó el coeficiente de agrupación para el conjunto de las redes mediante la eliminación de un nodo cíclicamente con los bordes correspondientes, y mediante el empleo de la
ponderada grado
como función de peso. Por lo general, las redes que carecen de nodos esenciales para la robustez general obtuvo puntuaciones más bajas.
Como último paso, hemos validado nuestro
In silico-
estimaciones por inspección manual de los genes diana y sus vías de señalización. Con estos planteamientos, se observó que la mayoría de miRNAs con los patrones de desregulación similares se asociaron con genes diana comunes y /o vías de regulación (véase el cuadro S5). En particular, en el CCR se encontraron tres nodos principales:
miR-195, miR-18a
, y
MIR-1246
. El primer nodo tenía una alta relación con miRNAs implicados en la vía de señalización MAPK, como se muestra
In silico-
análisis mediante el uso de DIANA-mirPath (http://diana.cslab.ece.ntua.gr/pathways/index_multiple .php), excepto
miR-31 y miR-28-3p
, que pertenecen a la vía EGF. El segundo nodo, el
miR-18a
, incluidos varios miRNAs (
miR-17, miR-19b, miR-92a
) que pertenece al mismo grupo: el
miARN 17- 92a
.