Extracto
Nuestros estudios previos han demostrado que la eliminación genética de la
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gen causa el cáncer colorrectal en ratones. El presente estudio mostró además que en la primera etapa (& lt; 3 meses) el
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ratones knockout desarrollado espontáneamente una inflamación crónica en el colon y el recto, las características patológicas similares a los de la colitis humana; y en la etapa tardía (& gt; 3 meses) los ratones exhibió cáncer colorrectal, incluyendo un único fenotipo de rectal prolapso (inflamación grave rectal y adenocarcinoma). Por lo tanto, la edad de 3 meses podría ser el punto clave de la transición de la inflamación crónica con el cáncer. Para determinar los mecanismos de la transformación maligna, se realizó matriz miARN en las células epiteliales del colon a partir de los 3 meses
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- /- y
+ /+ ratones. de perfiles de microARN mostró expresión diferencial de miRNAs (es decir, menores o mayores enriquecimientos de expresión) en
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- /- ratones. 15 de ellos fueron validados por PCR cuantitativa. Basándose en la relevancia de citoquinas y el cáncer, 4 (miRNAs miR-138, miR-145, miR-146a, y miR-150) fueron de validación y no se encontraron significativamente downregulated en la colitis humana y tejidos de cáncer colorrectal. La red de los objetivos de estos miRNAs se caracterizó, y con interés, citoquinas asociadas a los genes miARN se incrementaron significativamente en
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- /- ratones. Esta es la primera para revelar la importancia de la expresión aberrante de miRNAs en la transformación dinámica a partir de colitis crónica con el cáncer de colitis asociada. Estos hallazgos arrojan luz sobre revelando los mecanismos de colitis crónica transformación maligna
Visto:. Bao Y, Guo Y, Li Z, Fang W, Y Yang, Li X, et al. (2014) Perfiles de microARN en
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ratones knockout de la colitis asociada a cáncer Modelo revela alteraciones epigenéticas durante la transformación maligna crónica ulcerosa. PLoS ONE 9 (6): e99132. doi: 10.1371 /journal.pone.0099132
Editor: Sergei Grivennikov, el Fox Chase Cancer Center de los Estados Unidos de América
Recibido: 25 Febrero, 2014; Aceptado: 11-may de 2014; Publicado: 18 Junio 2014
Derechos de Autor © 2014 Bao et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por la subvención de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvención#91229115 y 81272251), una subvención para el equipo innovador de Ciencia y Tecnología del Ministerio de Educación, la provincia de Henan, China, y el Fondo de Investigación Médico (# 100820 y 505011) y el Fondo de inicio de la Universidad médica de Xinxiang, china. El trabajo también fue apoyado en parte por los proyectos innovadores de Estudiantes del Colegio Nacional de China (# 201310472005 a la XL, 201310472012 a BX, y al 201310472016 ZL). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es la tercera enfermedad maligna común y la segunda causa principal de muerte relacionada con el cáncer [1]. Similar a otros tumores malignos, los factores genéticos contribuyen mucho a la formación de CRC, pero, sólo alrededor del 20% de los casos de CCR se puede atribuir a la historia genéticamente familiarizado [2] - [4]. De hecho, la mayoría de CCR esporádico están fuertemente ligados a los factores ambientales, por el cual las mutaciones más a menudo en la poliposis adenomatosa coli (APC) gen supresor de tumores conducir a la destrucción de la APC /GSK3 /Axin complejo y activación de la vía /β-catenina [ ,,,0],2], [5], [6] la activación aberrante de la vía /β-catenina Wnt no sólo promueve la proliferación de las células epiteliales intestinales, pero también induce la detención a medida que avanzan hacia el final de la cripta y evitar derramar o apoptosis de células transformadas. La canónica "vía genética al cáncer colorrectal" ha sido bien estudios. Los mecanismos emergentes de la formación de cáncer colorrectal por factores ambientales están asociados con la inflamación crónica, llamada colitis asociada a cáncer colorrectal (CAC) [7] - [10] Con los cambios de dieta y estilo de vida en China, CRC aumentos de las tasas de incidencia rápidamente que cualquier otro cáncer en los últimos años [11], y bastante cantidad de casos de CCR están vinculados a la enfermedad inflamatoria crónica del intestino (IBD). Es aceptable que CAC es precedida por clínicamente detectable IBD [8], [12], tales como la enfermedad de Crohn (CD) o colitis ulcerativa (UC). Epidemiología y estudios clínicos han sugerido que la UC aumenta el riesgo CAC hasta en un 18-20%, mientras que el CD de hasta un 8% después de 30 años de enfermedad activa [13] - [15]. En modelos de ratones, la inyección única de carcinógeno azoximetano (AOM) da lugar a múltiples tumores del colon, solamente cuando se combina con colitis crónica inducida por dextrano sulfato de sodio (DSS), mientras que cuando la inflamación está ausente toma múltiples inyecciones de AOM y un mayor tiempo para la formación de tumores [16], [17]. Estas observaciones clínicas y experimentales señalan clara y precisamente CAC como el cáncer clásica inflamación impulsada. Sin embargo, a diferencia de APC /vía /β-catenina vía, los mecanismos subyacentes del cáncer asociado con la colitis, y en particular, de la colitis transformación maligna, no están nada claras, mayormente debido a la falta de un modelo apropiado para la investigación dinámica.
epitelios intestinales están protegidos por una capa de mucina secretada por las células caliciformes contra daños mecánicos y químicos, potentes causas de la inflamación, y la más abundante mucina intestinal secretada está codificada por el
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gen [18]. Estudios previos han demostrado que la disminución del número de células caliciformes y la reducción de
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expresión se observa con frecuencia en la colitis ulcerosa y el carcinoma colorrectal [19]. La importancia de
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en la homeostasis intestinal se refleja por alteraciones de la proliferación celular, la migración y la apoptosis en el intestino del ratón sobre la eliminación genética de la
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de genes [20], y lo más importante,
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ratones -deficiency (
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- /- ratones) desarrollan espontáneamente intestinal pequeños y grandes, y rectal, tumores [20]. Estudios mecanísticos han demostrado que la tumorigénesis está asociada con la activación de la inflamación crónica, y no está asociada con Wnt /β-catenina de señalización [20]. Sin embargo, la inflamación aumenta la tumorigénesis intestinal en ratones mutantes Apc mediante la introducción de
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la deficiencia de los ratones [21], y la pérdida de p21WAF1 ciclina dependiente inhibidor de quinasa mejoran la formación de tumores intestinales en
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- /- ratones [22], nuestro estudio mostró además que
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ratones deficiencia desarrollan espontáneamente colitis crónica en su edad temprana (& lt; 3 polillas), cuya histopatología fue similar a la colitis ulcerosa en pacientes. Después de 3 meses, el
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- /- ratones desarrollan tumores de colon y rectal. Por lo tanto, la edad de 3 meses podría ser el punto clave en el que la colitis crónica progresa a cáncer colorrectal, es decir, la colitis transformación maligna, y el
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ratones podría ser uno de los modelos mejor ingeniería de cáncer asociado a colitis dinásticamente estudiar el mecanismo de la transformación maligna de la colitis crónica
Para revelar los mecanismos moleculares de la colitis transformación maligna, se aislaron las células epiteliales del colon desde el
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-. /- ratones y se realizaron perfiles de miARN. Encontramos la expresión diferencial de miRNAs en el punto clave de la transformación maligna. Algunos miRNAs se caracterizaron en la colitis humana y tejidos de cáncer colorrectal. Curiosamente, los miRNAs downregulated fueron consistentes con las alteraciones en los ratones, y vinculados a los aumentos de citocinas, lo que sugiere las alteraciones epigenéticas pueden desempeñar un papel crítico durante la colitis transformación maligna.
Materiales y Métodos
Ética declaración:
el cuidado y uso de animales fueron aprobados por el Comité de cuidado y uso de animales Institucional de la Universidad médica de Xinxiang y la Universidad de Illinois en Chicago, y la recogida de muestras humanas y el uso fueron aprobadas por la Junta de Revisión Institucional de Xinxiang Médico Universidad. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito
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modelo de ratón y Patología Caracterización:.
Como se informó anteriormente [20] - [22], el
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+/- ratones se backcrossed para generar
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- /- y
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+ /+ y 10 ratones por grupo fueron alimentados con dieta para roedores estándar durante 3 meses o 6 meses. En los puntos finales, los ratones fueron sacrificados, todo el tracto gastrointestinal se abrió y se lavaron con PBS frío y se fijaron en 10% de formalina tamponada. Los tejidos fueron incluidos en parafina, seccionadas y teñidas para la caracterización histopatología
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células de ratón colónica epitelios recopilación, el análisis de ARNm, y la generación de perfiles de miARN:.
Utilización del protocolo publicado por nosotros [23] - [25], se recogieron las células epiteliales del colon de ratón a partir de 3 meses de edad
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+ /+ y
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- /- ratones, respectivamente. Se utilizaron cuatro ratones de cada grupo. Los ARN totales se extrajeron utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) para el análisis de ARNm de citocinas y el análisis conjunto de los genes miARN. Se determinó la calidad y cantidad del ARN mediante electroforesis Bioanalyzer y Gel. los niveles de citoquinas de ARNm se analizaron utilizando Q-RT-PCR. Los cebadores utilizados para el análisis de citoquinas de ratón se enumeran en la Tabla S1
.
La matriz miARN se llevó a cabo en el Centro de Genómica de la Universidad de Chicago (Chicago, Illinois). Affymetrix GeneChip arrays miARN versión 3.0 se utilizó para el perfil de miARN. En resumen, 200 ng de RNA total fueron etiquetados con biotina FlashTag HSR Labeling Kit según el protocolo del fabricante (Affymatrix), y alrededor de 130 ul de tampón de hibridación cóctel Affymatrix (FS450-002) se utilizaron durante aproximadamente 18 horas de acuerdo con el protocolo (Affymatrix) . a continuación, la matriz se escaneó utilizando Affymatrix GeneChip escáner 3000. Los datos en bruto se procesa con la consola de Expresión 1.2.0.20, valor de datos se define mediante la expresión de registro de Señal - RMA-DABG. Los miRNAs con un factor de cambio & gt; 2,0 o & lt; 0,5 y un valor de & lt t-test; 0,01 fueron seleccionados como miRNAs expresados diferencialmente. El diseño experimental detallado, protocolo detallado y análisis de los datos se puede acceder a la Expresión Génica Omnibus (GEO) (Acceso#GSE56577)
Ratón miARN validación cuantitativa mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (QRT-PCR):.
a partir de los grados de los niveles de miRNA cambiado desde el perfil de la matriz de miRNA, 6 de los más upregulated y 9 de los miRNAs más downregulated se validaron utilizando QRT-PCR. Los transcripción inversa (RT) cebadores y cebadores directos y sondas utilizadas para la validación de los genes miARN se enumeran en la Tabla S2. La sonda Taqman universal y cebador inverso universal para QRT-PCR se adquirieron de Tecnologías de ADN integrado (IDT) (Tabla S2).
ARN total de ratón epitelio colónico se poliadenilado con poli (A) polimerasa Tailing Kit (Epicentre ). Brevemente, 10 l de reacción que incluye 1 g de ARN, 1 l de tampón de reacción 10x, 1 l de ATP 10 mM y 1 unidad de poli polimerasa (A) se incubó a 37 ° C durante 30 minutos, seguido de inactivación de la enzima en 65 ° C durante 5 minutos y luego poner en hielo. Después de poliadenilación, la transcripción inversa se realizó en una reacción de 10 l que contiene 1 l de producto de reacción de poliadenilación, 1 l de 0,5 M de cebador RT, 0,5 l de dNTP 10 mM, 1 l de tampón de reacción AMV 10x, y 50 unidades de AMV de alta Rendimiento de la transcriptasa inversa (Promega, Madison, WI). La reacción se incubó a 42 ° C durante 60 min, y luego se terminó por calentamiento a 70 ° C durante 10 min. productos de RT se amplificaron y se detectaron usando un método de S-poli (T), según lo informado por nosotros [26]. Un 20 l de reacción de PCR contiene 2 l de los productos de RT (dilución de 4 veces), 10 l de 2x GoTaq® Hot Start incoloro Master Mix (Promega, Madison, WI), cebador directo 0,2 M, 0,2 M cebador inverso universal y 0,25 M sonda Taqman universal. La reacción de PCR se realizó a 95 ° C durante 30 s, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 10 s y 60 ° C durante 30 s. Los resultados QRT-PCR se analizaron según lo informado por nosotros [27] - [29]. El snoRNA202 se utilizó como control interno
Muestras Humanos Colección:.
Dieciséis paires de tejidos de cáncer colorrectal humano, colitis tejidos, y su mucosa del colon normal adyacente, se recogieron a partir de noviembre de 2012 a octubre de 2013, desde el primer hospital Afiliado y el hospital central Afiliado Xinxiang, Universidad médica de Xinxiang. Parte de las muestras se rompió en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C para la extracción de ARN y para el análisis de QRT-PCR. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito. La toma de muestras y su uso fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad Médica de Xinxiang
.
La extracción de RNA y QRT-PCR para el análisis de ARNm de muestras humanas fueron similares como se describió anteriormente para el análisis en las células epiteliales del colon de ratón. Los cebadores y sondas utilizados para el análisis de los genes miARN fueron listadas Tabla S2. . SNORD 44 se utilizó como control interno
miARN Objetivos de identificación, funciones biológicas Categorización y análisis de red:
Para identificar los objetivos de los miRNAs, se utilizó el software en línea - David (http: //david.abcc.ncifcrf.gov/) y una lista predicho de los genes miARN conservadas obtenidos de TargetScan (http://www.targetscan.org/), base estelar (http://starbase.sysu.edu.cn/) , Tarbase (http://microrna.gr/tarbase/), y miRBase (http://mirbase.org/index.shtml). Las funciones biológicas de los miRNAs se clasificaron por Gene Oncología (GO). Se propusieron objetivos potentes de la red y la señalización utilizando KEGG (http://www.kegg.jp) y Ensembl (http://www.ensembl.org) herramientas web.
Resultados
Histopatología de la
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modelo de ratón de cáncer asociado a colitis:
trabajos anteriores han demostrado que la eliminación de genes dirigida de la
formación Muc2
gen causado tumores en el tracto gastrointestinal entero, incluyendo duodeno, colon y recto [20], y los
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- /- enfermedades inflamatoria intestinal inducida por DSS ratones son susceptibles a [30]. En este estudio, encontramos que a los 3 meses o más temprano, el
Muc2
- /- ratones desarrollaron espontáneamente una inflamación crónica en el colon y el recto, que acompaña con unos tumores en estos sitios (Figura 1). Como se muestra en la Figura 1A, la mucosa de colon carecía de células caliciformes y exhibió las características de la colitis ulcerosa, como la erosión superficial y infiltraciones intensivos de células inflamatorias a través de la mucosa, submucosa e incluso capa muscular del colon, que era similar a la observada en colitis ulcerosa humana. La colitis crónica se acompaña de un adenoma. A la edad de 6 meses,
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- /- ratones desarrollaron tumores en el colon y el recto, según ha informado [20], pero la inflamación severa todavía se observó en los tumores intra-y-tumores adicionales (Figura 1B). Un único fenotipo fue que
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- /- ratones desarrollaron prolapsos rectales (Figura 1C) que nunca se ha informado anteriormente. Punto de vista histopatológico, el prolapso fue el adenocarcinoma con inflamación severa en los rectos (Figura 1D), que muestran una erosión superficial, la infiltración de células inflamatorias y la invasión de las células cancerosas. Además, la gravedad de la infiltración de células inflamatorias se asoció con la gravedad de prolase rectal, pero no se asoció con la invasión de células de cáncer y la diferenciación en el recto (datos no mostrados)
.
A, Colitis y un adenoma en de colon de ratón a la edad de 3 meses. flechas grises señalaron severa infiltración de células inflamatorias, flecha blanca señala un adenoma. B, adenocarcinoma de colon con infiltración de células inflamatorias en la edad de 6 meses. C, prolapso rectal a los 6 meses. . D, Histopatología del prolapso rectal, que muestra la invasión de células de cáncer y la inflamación severa en el recto (mayores de 6 meses) guía empresas
miARN perfiles de la expresión diferencial de los genes miARN en
Muc2
- /- ratones
los estudios recientes han sugerido las importantes funciones de miRNAs en la carcinogénesis. Para investigar si la expresión aberrante de miRNAs están involucrados en la colitis transformación maligna, se aislaron las células epiteliales del colon a partir de 3 meses de edad ratones (4
Muc2
- /- ratones y 4
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+ /+ ratones) y llevado a cabo perfiles de miARN. Se sabe que la interacción entre células estromales y epiteliales juega un papel importante en la conducción de cáncer colorrectal colitis asociada (CAC).
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se sobreexpresa en las células epiteliales del colon, y la deficiencia genética de este gen es suficiente para causar la colitis y el cáncer colorrectal, ejerciendo la importancia de
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en el desarrollo de colitis y CAC. Para determinar el papel de los miRNAs expresadas aberrantemente como resultado de
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ausencia en el inicio de la colitis y facilitar la transformación del cáncer colorrectal, que utilizan las células epiteliales del colon en lugar de las células del estroma o tejidos de todo el colon de matriz miARN. Mirna análisis de perfiles mostró niveles diferenciales de miRNAs, entre ellos 20 miRNAs fueron regulados a la baja de manera significativa y 71 miRNAs fueron significativamente upregulated (Tabla 1) en
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- /- ratones, en comparación con
Muc2
+ /+ ratones (factor de cambio & gt; 2 o & lt; 0,5; T & lt; 0,01, valor p & lt; 0,05, valor q & lt; 0,05). Como muestra en la Tabla S3 y S4 Tabla, la mayoría de los miRNAs han sido reportados para regular sus objetivos y jugar un papel crítico en el cáncer de iniciación, progresión y metástasis, en diferentes tejidos y células. Si bien, algunas funciones biológicas de miRNAs no son claras y justifican investigaciones adicionales
ratón miRNAs validación de QRT-PCR:.
Para evaluar la exactitud de la alteración miRNAs perfilado en colon de ratón células epiteliales, se seleccionaron 15 miRNAs más relevantes para la validación mediante QRT-PCR. Las 6 miRNAs upregulated (MMU-mir-5132-5p, MMU-mir-3104-5p, MMU-mir-669c-5p, MMU-mir-705, MMU-mir-760-3p, MMU-MIR-1962) y las 9 miRNAs downregulated (MMU-miR-146a, MMU-mir-138, MMU-mir-5123, MMU-miR-196b, MMU-mir-5099, MMU-mir-150, MMU-mir-145, MMU-mir -27a, MMU-miR-23a) elegido para la validación también se basa en sus genes objetivo previsto, cuyas funciones son también relevantes para la inflamación y el cáncer. Como se muestra en la figura 2, los cambios de los genes miARN ensayadas por qRT-PCR fueron consistentes con los cambios perfilados por el análisis conjunto de los genes miARN
.
Cuatro ratones en edad de 3 meses a partir de cada grupo de genotipo fueron sacrificados y las células epiteliales de colon eran aislado para la extracción de RNA y análisis de QRT-PCR. Las columnas representaban media +/- SD.
aberrante expresión de miRNAs en la colitis humana, tumor colorrectal y mucosa normal adyacente
Para determinar si los miRNAs expresadas aberrantemente tienen importancia clínica, nos eligió 4 miRNAs para el análisis en tejidos de cáncer colorrectal humano y la colitis. Como se muestra en la Figura 3, en general, el nivel de expresión de miR-138, miR-145, miR-146a y miR-150 se downregulated en aproximadamente 3,37, 3,39, 2,56 y 4,99 veces mayor en el cáncer colorrectal que los del emparejados adyacentes normales mucosa (
p Hotel & lt; 0,0001). Entre ellos, todos los 16 cánceres colorrectales mostraron regulados a la baja de miR-138 y miR-150 niveles (Figuras 3A y 3D), y 15 de los 16 cánceres colorrectales mostraron menores miR-145 y miR-146a niveles de expresión de control normal (Figuras 3B y 3C). Sólo un paciente (Muestra 6) mostró la regulación positiva de miR-145, pero la regulación por incremento no fue significativa (Figura 3B, p & gt; 0,05). Curiosamente, la regulación a la baja de estos miRNAs también se observaron en los tejidos humanos colitis crónica (Figuras 4, p & lt; 0,0001, en comparación con la mucosa normal). A pesar de las observaciones se obtuvieron a partir de muestras pequeñas, las tendencias de la regulación a la baja significativa de miRNAs (miR-138, 145, 146a y miR-150) sugiere fuertemente su importancia clínica de la vinculación con la colitis crónica y el cáncer colorrectal asociado con la colitis, indirectamente, con indicación de su posibles funciones biológicas de la participación en la colitis transformación maligna. De hecho, las funciones de estos miRNAs en la supresión de tumores están siendo objeto de investigación utilizando el sistema de cultivo de células manipuladas
in vitro Opiniones y ratones desnudos portadores de tumores
in vivo
.
, miR-138 se downregulated significativamente en los cánceres colorrectales. B, miR-145 se downregulated significativamente en los cánceres colorrectales. C, miR-146a se downregulated significativamente en los cánceres colorrectales. D, miR-150 se downregulated significativamente en los cánceres colorrectales. Cada columna se puso de pie para un paciente, un total de 16 pacientes. El general se puso de pie para la media de los miRNAs en todos los pacientes. (***
p Hotel & lt; 0,0001, en comparación con la mucosa normal adyacente).
A, miR-138 fue significativamente downregulated en la colitis. B, miR-145 se downregulated significativamente en la colitis. C, miR-146a fue significativamente downregulated en la colitis. D, miR-150 se downregulated significativamente en la colitis. Cada columna se puso de pie para un paciente, un total de 6 pacientes. El general se puso de pie para la media de los miRNAs en todos los pacientes. (***
p Hotel & lt; 0,0001, en comparación con la mucosa normal adyacente) guía empresas
miRNA Target Red Caracterización:.
Dado que los miRNAs modificados tuvieron una gran importancia en
Muc2
- /- ratones y transformación maligna colitis humana, y el miARN seleccionadas mostraron regulación a la baja en la colitis y el cáncer colorrectal, el próximo dilucidado si había algún objetivos comunes de estos miRNAs. Por desgracia, no hay inflamación-común y objetivos asociados con el cáncer para todos los miRNAs 4 (miR-138, 145, 146a y miR-150) se identificaron utilizando herramientas de predicción de genes miARN objetivo. Sin embargo, sí encontramos algunos objetivos comunes de cualquier 3 o 2 de los 4 miRNAs. Como se muestra en la Figura 5 y en la Tabla 2, hubo 21, 13 y 25 objetivos comunes entre el miR-138 y miR-145, miR-146a y miR-150, respectivamente; hubo 16 y 15 comunes entre miR-145 y miR-146a y miR-150, respectivamente; y hubo 7 objetivos comunes entre miR-146a y miR-150. Obsérvese por favor que CCT3 y PAPPA eran los objetivos comunes para el miR-138, miR-146a y miR-150, y ZHX2 era el objetivo común de miR-138, miR-145 y miR-150. Curiosamente, la mayoría de estos objetivos son los oncogenes. GO plazo anotación mostró que todos los objetivos están implicados en procesos fisiológicos celular y el metabolismo, y la regulación de procesos celulares y la regulación de procesos fisiológicos son los términos de GO más enriquecido significativamente. Por lo tanto, cualquier desregulación de estos miRNAs y sus objetivos podría ser suficiente para provocar la iniciación de la inflamación y la inflamación crónica transformación maligna, los estudios sobre los objetivos comunes de dos o más miRNAs en la carcinogénesis es más significativo que el blanco de una sola miARN.
las citoquinas en
Muc2
- /-
células de ratón colónica epiteliales fueron reguladas:
Para validar la precisión del análisis de los genes miARN y su asociación con los ARNm de citoquinas, cuanto más tarde se ve con frecuencia en el cáncer asociado con la colitis, determinamos las alteraciones de citoquinas en colon de ratón. Como se muestra en la Figura 6, en comparación con
Muc2
+ /+ ratón,
Muc2
- /- ratones mostraron significativa regulación de citoquinas (por ejemplo IL-6, Cox2, TNF-a, y IL-1β, etc) en las células epiteliales del colon de la mucosa de colon de apariencia normal (p & lt;. 0.01)
en comparación con
Muc2
ratones + /+,
Muc2
- /- ratones mostraron significativa regulación de las citoquinas (** p & lt; 0,01, comparado con
Muc2
+ /+ ratones). Cuatro ratones en edad de 3 meses a partir de cada grupo de genotipo se sacrificaron y se aislaron las células epiteliales del colon para la extracción de RNA y análisis de QRT-PCR. Las columnas representaban media +/- SD.
Discusión
El estudio actual se caracteriza, además, un modelo de cáncer colorrectal asociado con la colitis (CAC) de
Muc2
- /- ratones, proporcionando evidencia directa de que la inflamación crónica en el colon y el recto podría transformarse malignamente, y revelando los mecanismos potentes, que fue que los genes miARN expresión aberrante en las células epiteliales del colon estaban involucrados en y podría desempeñar un papel crítico durante la transformación maligna de colitis crónica, al interferir genes diana.
Numerosos estudios basados en la evidencia han demostrado que la colitis crónica es una de las causas importantes de cáncer colorrectal, pero los mecanismos subyacentes no están claras, una de las principales razones es la falta de espontánea colitis y modelo de cáncer colorrectal colitis asociada. Actualmente, una variedad de modelos animales genéticamente modificados están disponibles y son muy útiles para una mejor comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a la patogenia de la CAC [31], pero las características patológicas de estos modelos no se han caracterizado de forma dinámica. El presente estudio se caracterizó el
Muc2 modelo de ratón
. El
Muc2
- /- ratones desarrollan espontáneamente una inflamación crónica en el colon y el recto en una etapa temprana (& lt; 3 meses), y después de 3 meses, el progreso inflamación crónica con el cáncer colorrectal. Lo más importante, las características patológicas de la inflamación crónica en el colon y el recto fueron similares como colitis ulcerosa humana, y los miRNAs expresadas aberrantemente implicados en
Muc2
- /- ratón se observó la colitis transformación maligna en la colitis humana y tejidos de cáncer colorrectal. Otra característica única era los prolapsos rectales - cáncer de recto con inflamación severa. Por lo tanto, el
Muc2
- /- ratón podría ser el modelo de roedor apropiado de CAC, y podría ser utilizado como una de las mejores herramientas para dilucidar la causa de la CAC y los mecanismos moleculares subyacentes. La
Muc2
- /-. Ratón también se podría utilizar como un modelo de ratón para la quimioprevención y la terapia para el cáncer colorrectal colitis asociada
miRNAs tienen 19-22 nucleótidos, son una novela clase de pequeños ARN no codificantes que suprimen la traducción y la estabilidad de los ARN mensajeros (ARNm) mediante la unión a orientar mRNAs '3' no traducida regiones (3'-UTR) [32], miRNAs tienen importantes funciones biológicas y pathophysical de participación en el desarrollo, proliferación celular, diferenciación, apoptosis, inflamación y la respuesta al estrés [33] - [35]. evidencias crecientes han sugerido que miRNAs son downregulated o upregulated en los cánceres, en calidad de los supresores de tumores u oncogenes [33], [35], [36], en el que los miRNAs juegan un papel crítico en la tumorigénesis, la diferenciación, la progresión (por ejemplo, migración, invasión, angiogénesis y metástasis) [35] - [37], principalmente al interferir con la expresión de genes diana. El uso de una matriz de miARN, hemos perfilado expresión diferencial de miRNAs en las células epiteliales del colon desde el
Muc2
- /- ratones, y estos miRNAs son upregulated ya sea como oncogenes o downregulated como supresores de tumores por la orientación de los genes en las categorías de metabolismo, ciclo celular, diferenciación, muerte celular, la replicación del ADN, la homeostasis, la transducción de señales, la respuesta a la estimulación, y la inflamación, etc. Entre los miRNAs cambiado marcadamente, los miRNAs downregulated, miR-138, 145, 146a y 150 , fueron validados en los dos tejidos de ratón y humanos, en particular, en la colitis humana y tejidos de cáncer colorrectal, lo que sugiere que suprimen los roles de miR-138, 145, 146 bis y 150 en la colitis transición maligno a través de la interacción con citoquinas y factores inflamatorios.
estudios anteriores han demostrado papeles supresores de tumores de miR-138 en la biología del cáncer. miR-138 inhibe crecimiento de células cancerosas y la tumorigénesis en cáncer de pulmón de células no pequeñas y el cáncer nasofaríngeo por la orientación 3-fosfoinositida dependiente de la proteína quinasa-1 (PDK1) y CCND1 [38] - [40]. En colorrectal y cáncer de ovario, el miR-138 suprime la migración de las células del cáncer y la metástasis a través interferido con TWIST2, SOX4 y HIF1-a [39], [41]. La mayoría de los estudios recientes informaron que downregulated miR-138 sostenido factor inflamatorio activación de NF-kB y promovió la progresión del cáncer de esófago [42], y que miR-138 respuesta a las citoquinas pro-inflamatorias depende de la estabilización de HIF1-α en las células endoteliales microvasculares humanas primarias [43]. miR-145 también es un gen supresor de tumor. miR145 podría tener como objetivo el eje SOX9 /ADAM17 e inhibir las células iniciadoras del tumor y los efectos paracrinos mediadas por IL-6 en cáncer de cabeza y cuello [44]. Por otra parte, microRNA-145 induce la apoptosis con la inducción de ligando expresión (TRAIL) de necrosis tumoral relacionado con el factor inductor de apoptosis, socs7 oncogenes específicos y regulada inducción de interferón-β a través de STAT3 translocación nuclear en las células de cáncer de vejiga [45]. Estudios recientes han informado de que TRAIL suprime quimiocina (motivo CXC) del receptor 4 (CXCR4) mediada por la migración de células de cáncer de mama humano hasta la regulación de la expresión de miR-146a a través de señalización NF-kB [46], y que el miR-146 regula UHRF1 regulador epigenético y modula la invasión y la metástasis del cáncer gástrico [47], que muestra las importantes funciones de miR-146 en la inhibición de la metástasis del cáncer al interferir quimioquinas y el regulador epigenético. En cuanto a miR-150, un buen montón de informes han demostrado su función inhibidora del tumor [48] - [51]. Mientras, que miR-150 interactúa con citocinas en la diferenciación de linfocitos y en la inflamación ha sido estudiado. Por ejemplo, en linfocitos T citotóxicos (CTL), IL-2R y señales inflamatorias actúan a través de Dicer y miRNAs para controlar el programa citolítica y la diferenciación de CTL, en el que miR-139 y miR-150 son downregulated por la inflamación de los CTL, y miR 150 regula la expresión de la cadena α del receptor de IL-2 (CD25) [52]. Además, la producción de IFN-γ es significativamente mayor en los miR-150 ratones knockout [53]. Volver a nuestros hallazgos, que fueron, las citoquinas se incrementaron significativamente (Figura 6) y miR-138, 145, 146a y miR-150 se redujo significativamente en
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- /- de colon de ratón y humano colitis y el cáncer colorrectal, la incorporación con las observaciones publicadas, apoyan firmemente la hipótesis de que los miRNAs citoquinas asociada, miR-138, 145, 146a y miR-150, juegan un papel importante en la transformación maligna colitis crónica a través de interferir con citocinas y factores inflamatorios. Sin embargo, similar a los cambios de las citocinas, como consecuencia de la colitis en colon de ratón, los cambios de la miRNAs podrían también ser una colitis crónica consecuencia y CAC en los tejidos de colon humano. Podría ser posible, pero los datos preliminares de los estudios funcionales en curso utilizando sistemas de cultivo de células manipuladas y vivo modelo de ratón desnudo en haber mostrado el potencial individual o sinérgico de estos miARN (Bao y Yang, datos no publicados), lo que confirma las funciones supresoras de tumores de estos miRNAs . Además, los potentes recursos de los miRNAs alterados en la colitis humana y tejidos CRC no son claras y necesitan más investigaciones, los restults generados a partir de lo que podría aclarar las funciones de causa o efecto de estos miRNAs en el desarrollo de la colitis y el cáncer colorrectal.