Extracto
El cáncer de próstata urinaria miR-205 y (CaP) es el tipo más común de cáncer en hombres en los Estados Unidos, que afecta de manera desproporcionada a los descensos afroamericanos. Mientras que la metástasis es la causa más común de muerte entre los pacientes con CaP, no hay marcadores específicos han sido asignados a la gravedad y biasness étnica de la enfermedad. MicroARNs representan una nueva clase prometedora de biomarcadores debido a su estabilidad inherente y la resistencia. En el presente estudio, se investigó miRNAs potenciales que pueden ser utilizados como marcadores biológicos y /o dianas terapéuticas y puede dar una idea de la gravedad y biasness étnica de CaP. matriz de PCR se realizó en tejidos FFPE PCA (5 caucásica americanos y 5 afroamericano) y miRNAs expresados diferencialmente seleccionados fueron validados por QRT-PCR, en 40 (15 y 25 CA AA) emparejados CaP y los tejidos normales adyacentes. Significativamente miRNAs desregulados también fueron analizados en muestras de orina para explorar su potencial como biomarcador no invasivo para el CaP. De los 8 miRNAs seleccionados para la validación de los datos de la matriz de PCR, miR-205 (
p Hotel & lt; 0,0001), MIR-214 (
p Hotel & lt; 0,0001), el miR-221 (
p Hotel & lt; 0,001) y miR-99b (
p Hotel & lt; 0,0001) fueron significativamente downregulated en los tejidos de CaP. curva ROC muestra que los cuatro miRNAs discriminados con éxito entre el CP y los tejidos normales adyacentes. MiR-99b mostró regulación por disminución significativa (
p Hotel & lt; 0,01) en los tejidos AA CaP en comparación con los tejidos de CaP CA y podría estar relacionado con la agresividad asociada con la población de AA. En la orina, el miR-205 (
p Hotel & lt; 0,05) y miR-214 (
p Hotel & lt; 0,05) fueron significativamente downregulated en pacientes con CaP y puede discriminar a los pacientes con CaP de individuos sanos con 89 % de sensibilidad y 80% de especificidad. En conclusión, el presente estudio mostró que el miR-205 y miR-214 se downregulated en el CaP y pueden servir como potenciales biomarcadores moleculares no invasivo para CaP
Visto:. Srivastava A, H Goldberger, Dimtchev A, M Ramalinga , Chijioke J, Marian C, et al. (2013) Perfiles de microARN en el cáncer de próstata - El potencial diagnóstico de la orina de miR-205 y miR-214. PLoS ONE 8 (10): e76994. doi: 10.1371 /journal.pone.0076994
Editor: Rakesh K. Srivastava, la universidad del centro médico de Kansas, Estados Unidos de América
Recibido: 5 de Julio, 2013; Aceptado: 4 Septiembre 2013; Publicado: 22 Octubre, 2013
Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuido, transmitido, modificado, construido sobre, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la advocación de dominio público Creative Commons CC0
Financiación:. Este estudio fue apoyado por subvenciones del NIH (CA162264 y CA141935) y el programa de la PCRP CDMRP (PC111314). JC es apoyado por suplemento sobre CA162264-02S1. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (CaP) es el cáncer masculino más frecuentemente diagnosticado y la segunda causa principal de la mortalidad oncológica en los hombres en los Estados Unidos [1]. En 2013, se estima que ~238,590 nuevos casos de CaP a ser diagnosticados en los EE.UU., que puede reclamar ~29,720 muertes [1]. (AA) los hombres afroamericanos están desproporcionadamente afectadas con CaP con una tasa de incidencia de dos tercios superior y la tasa de mortalidad dos veces más alta en comparación con los americanos caucásicos (CA) [2]. Debido a sus síntomas no específicos y progresión gradual, CaP se diagnostica generalmente en una etapa avanzada. Sin embargo, si se diagnostica en una etapa temprana del CP puede ser tratado con éxito.
pruebas realizadas rutinariamente para la detección precoz del CaP incluyen el examen rectal digital (DRE) y el antígeno (APE) específico de la próstata. la prueba de PSA no es específico, ya que los niveles elevados de PSA debido a la hiperplasia benigna de próstata (HBP), infección y /o inflamación crónica puede conducir a resultados de confusión [3] - [4]. Baja especificidad (la prueba de PSA) y una baja sensibilidad (DRE) de estas pruebas restringe su significado diagnóstico [5]. Aunque los ensayos clínicos abogan por que la prueba de PSA facilita enormemente el diagnóstico precoz del CP, si este procedimiento de detección disminuye significativamente la mortalidad por CaP sigue siendo una cuestión de debate [6] - [7]. Un reciente meta-análisis concluyó que el cribado de rutina, ya sea con un DRE o PSA no ofrece ningún beneficio y no influye en la mortalidad CaP [8]. Para superar estos inconvenientes, se han propuesto biomarcadores adicionales incluidos los derivados de PSA tales como la velocidad de PSA total (VPSE total) y diferentes formas moleculares de PSA como PSA libre, BPSA, pro-PSA y PSA intacto [9]. Otros biomarcadores basado sangre tales como la calicreína glandular humana 2 (hK2), activador del plasminógeno uroquinasa (uPA) y su receptor (uPAR), factor de crecimiento transformante beta 1 (TGF-β1); interleucina-6 (IL-6) y su receptor (IL-6R) se han estudiado solo o en combinación con PSA y sugerido para el diagnóstico, la estadificación, pronósticos, y seguimiento de cáncer de próstata [10]. Sin embargo, debido a la heterogeneidad de esta enfermedad, biomarcadores pronósticos adicionales se necesitan con urgencia para una mejor predicción de la progresión de la enfermedad que puede ayudar en la toma sobre el momento de la biopsia y la necesidad de tratamiento de decisiones clínicas.
Los microARN (miRNA) son pequeñas (18 a 24 nucleótidos), altamente conservadas, las moléculas de ARN no codificantes que regulan la expresión de genes post-transcriptionally [11] - [12]. estudios computacionales sugieren que más del 60% de las transcripciones de genes de mamíferos están regulados por miRNAs [13] - [14]. MiRNAs desempeñan un papel regulador clave en los procesos celulares, incluyendo divergentes del ciclo celular, la proliferación, la diferenciación y la apoptosis [15]. Estudios recientes han implicado a varios miRNAs en el desarrollo y progresión de varios cánceres humanos y también como posible biomarcador para el diagnóstico y pronóstico del cáncer [16] - [19].
Teniendo en cuenta la heterogeneidad de los tejidos de cáncer, captura por láser micro disección (LCM) ofrece un enfoque atractivo para aislar poblaciones de células definidas a partir de FFPE especímenes [20]. LCM en combinación con la tecnología de QRT-PCR se ha utilizado para la medición precisa de la expresión de los genes de las muestras FFPE. En el presente estudio, hemos utilizado LCM y se realizó de perfiles de miARN en el cáncer de próstata y los correspondientes tejidos normales adyacentes para identificar miRNAs asociados con el desarrollo del CaP. El miRNAs identificados fueron validados en conjuntos de muestras de mayor tamaño. Para poner a prueba su potencial diagnóstico no invasivo, también se evaluó la expresión de miRNAs candidatos en un conjunto independiente de muestras de orina de pacientes con CaP.
Materiales y Métodos
muestras de pacientes
Todas las muestras de los pacientes obtenidos fueron des-identificada para proteger la confidencialidad del paciente y tenía la Universidad de Georgetown IRB-aprobación y consentimiento. Todas las muestras de tejido se obtuvieron de GU /LCCC Histopatología & amp; Tejido recurso compartido (http://lombardi.georgetown.edu/research/sharedresources/htsr/) y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de todos los participantes de la muestra de orina. En pocas palabras, fijado en formol-40, bloques (FFPE) muestras de tejido en parafina procedentes de la prostatectomía radical que consiste en 15 americanos caucásicos (CA) y 25 Afroamericanos (AA) se obtuvieron a partir Lombardi Histopatología y tejidos recurso compartido (HTSR) entre 1997-2002. Las muestras de orina de 36 pacientes con CaP (18 CA y 18 AA) y 12 años de edad y origen étnico emparejado donantes sanos (6 CA y 6 AA) se obtuvieron a partir del Programa de Cáncer de Próstata Cyberknife Georgetown University Hospital entre 2009 y 2012.
Laser capturar microdisección (LCM)
hematoxilina y eosina (H & amp; e) manchadas diapositivas de archivo FFPE bloques fueron revisados por un patólogo certificado por la junta, para la identificación de los focos que CaP así como el tejido normal adyacente. LCM se realizó en el sistema de microscopio láser captura Arcturus con 5000 a 6000 pulsos de láser para cada muestra para capturar 30.000 a 50.000 células de CaP focos y el tejido normal adyacente. Las células capturadas se congelaron inmediatamente a -80 ° C hasta su uso posterior.
La extracción de RNA y de perfiles de expresión de genes miARN
La extracción de RNA a partir de células microdissected y muestras de orina se realizó utilizando Recuperar Aislamiento All ™ total de ácidos nucleicos y mirVana ™ miARN kits de aislamiento, respectivamente (Ambion, Austin, TX) según el protocolo del fabricante. El ARN se cuantificó usando NanoDrop ND-1000 espectrofotómetro (Thermo Scientific, Waltham, MA) y Agilent 2100 Bioanalyzer (Santa Clara, CA).
El ARN se convirtió en ADNc usando Megaplex ™ grupos de cebadores y el kit TaqMan miARN transcripción inversa (Applied Biosystems, Grand Island, NY). Una amplia perfiles de expresión de los genes miARN se llevó a cabo utilizando TaqMan Arrays v2.0 MicroARN Una tarjeta humano siguiendo las recomendaciones del fabricante (Applied Biosystems, Grand Island, NY). PCR cuantitativa (QRT-PCR) en tiempo real se llevó a cabo para examinar un total de 377 miRNAs humanos únicos por Applied Biosystems 7900 HT rápida en tiempo real del sistema de detección de secuencias de PCR. Los datos se analizaron con el software del sistema de detección de secuencias (SDS) (versión 2.3, Applied Biosystems, Grand Island, NY). Niveles relativos de expresión de los genes miARN se normalizaron en contra del control endógeno U6 snRNA.
Validación de QRT-PCR
Los niveles de expresión de miRNAs seleccionados se midieron en 40 pacientes con CaP utilizando TaqMan inventariado miARN ensayos (Applied Biosystems, Gran Island, NY) siguiendo las recomendaciones del fabricante, en 7300 Sistema de PCR en tiempo real (Applied Biosystems, Grand Island, NY). En resumen, 10 ng de ARN transcrito fue inversa usando cebadores específicos de tallo-bucle. Las muestras de tejido se normalizaron con el control U6 snRNA estándar interno mientras que, RNU48 se utilizó como control para la normalización de muestras de orina. los controles sin transcriptasa inversa (RT) se utilizaron para descartar la posibilidad de contaminación de ADN genómico potencial. Los microARN con los valores umbral ciclo de ≥38 (CT) fueron excluidos del análisis. Todas las muestras se sometieron a transcripción inversa y QRT-PCR de forma simultánea para reducir al mínimo los errores introducidos por las variaciones en la eficiencia de la reacción.
Minería de datos, identificación de destino y Pathway Analysis
La expresión de miRNAs seleccionados fueron analizados en Gene Expression Omnibus (GEO) en la base de datos 'R' de GEO2R [21]. Los objetivos de mRNA de miRNAs expresados diferencialmente se identificaron utilizando el software en línea y bases de datos tales como TargetScan [22], PicTar [23] y miRDB [24] seguido de objetivos adicionales verificado experimentalmente a partir miRTarBase [25]. Las posibles interacciones gen-gen y la agrupación funcional entre los objetivos de miRNAs, se ha realizado mediante Ariadna Pathway Studio 9.0.
Análisis estadístico
Los datos de la matriz microARN-A v2.0 tarjeta humanos primas se analizó estadísticamente por el software Integromics RealTime StatMinier versión 4.0, y el software R /Bioconductor versión 2.9.2. El 2
-ΔΔCt método [26] se utilizó para pre-procesamiento y doble cálculos de cambio. miRNAs expresados diferencialmente entre los tejidos de CaP y el tejido normal adyacente se identificaron utilizando Limma paquete [27], que emplea el modelo bayesiano empírico para lidiar con el tamaño de muestra pequeño en comparación con la relativamente mucho mayor número de miRNAs. El
p-
valores se ajustaron utilizando Benjamin-Hochberg falso descubrimiento (FDR) de corrección [28].
Todos los QRT-PCR experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con el MIQE (información mínima para la publicación de experimentos de PCR cuantitativa en tiempo real) directrices [29]. Cada reacción de amplificación se realizó por triplicado, y se utilizó el valor medio del umbral de tres ciclos para su posterior análisis. Los datos se presentan como medias ± SE y P value≤0.05 fue considerado estadísticamente significativo. Se utilizó la prueba T de Student no paramétrica para comparar dos grupos (cáncer frente a no-cáncer), y todas las estadísticas se ajustaron utilizando la corrección de Holm-Bonferonni para comparaciones múltiples. Todos los diagramas de cajas representan los niveles de miRNA en relación con U6 snRNA, transformados en cantidades utilizando la fórmula 2
-ΔCt [30].
características operativas del receptor (ROC) se construyeron y el área bajo la curva (AUC) se estimó para estudiar la viabilidad de la utilización de los miARN particulares para discriminar pacientes con CaP de los controles sanos. Se utilizó regresión logística para construir las curvas ROC utilizando miARN niveles de expresión. Todo el análisis estadístico se realizó utilizando GraphPad Prism v6 (La Jolla, CA).
Resultados
perfiles de expresión de miRNAs en el cáncer de próstata Los tejidos
La evaluación de los cambios en la expresión de los genes miARN tejidos con CaP y fluidos biológicos ofrecen una herramienta prometedora para la identificación de biomarcadores específicos que pueden ayudar en el diagnóstico y pronóstico del CP. Inicialmente, se utilizó la microdisección por láser capturado (LCM) para capturar la región de cáncer de los tejidos y las correspondientes contrapartes normales adyacentes de muestras FFPE de pacientes sometidos a prostatectomía radical. de perfiles de expresión de microARN se realizó en 10 pacientes con CaP Gleason (GS) 6-7 (5 AA y 5 CA). El cáncer y las regiones normales adyacentes fueron identificados por el BVSK patólogo. Las células capturadas de varias regiones del cáncer de cada paciente se agruparon para reflejar la heterogeneidad del CP y población de pacientes; contraparte de tejidos adyacentes normales sirvieron como control sin cáncer. Se realizó el análisis de perfiles de miARN y encontramos que la mayoría de los miRNAs se downregulated en tejidos de cáncer, con la excepción de miR-367, miR-758 y miR-190 que resultaron ser upregulated (Tabla 1). Para la validación, se seleccionaron los 3 miRNAs upregulated (miR-367, miR-758 y miR-190) y 5 miRNAs downregulated (miR-205, miR-214, miR-212, miR-221 y miR-99b) en función de su papel publicado en la biología del cáncer. De perfiles de datos de todos los 10 pacientes (5 CA y 5 AA) se ha presentado a la base de datos GEO (número de acceso GSE48430).
Validación de miRNAs por RT-PCR cuantitativa
La 8 seleccionados miRNAs fueron validados en el tumor LCM-diseccionado y el tejido normal adyacente de 40 pacientes, incluyendo los 10 pacientes utilizados para miARN perfiles. La Tabla 2 muestra las características clínico-patológicas de los pacientes. Los resultados QRT-PCR de 40 muestras de pacientes (15 CA y 25 AA) los especímenes reveladas disminución de la expresión de miR-205 (
p Hotel & lt; 0,0001), el miR-214 (
p Hotel & lt; 0,0001), el miR-221 (
p Hotel & lt; 0,001) y miR-99b (
p
. & lt; 0,0001) en el tejido canceroso en comparación con el tejido no canceroso adyacente (figura 1A) . A pesar de que el miR-212 mostró una tendencia a la regulación a la baja en el CaP en comparación con el tejido normal adyacente, la diferencia no fue estadísticamente significativa (
p = 0,061
). No hubo diferencia significativa en la expresión relativa de miR-758 y miR-190 en el tejido tumoral en comparación con sus homólogos normales adyacentes y los niveles de miR-367 no pudo ser detectado después de 38 ciclos (datos no mostrados). Por lo tanto, el miR-212, miR-758, miR-190 y miR-367 se excluyeron del estudio adicional
(A) Validación de miRNAs por QRT-PCR:. Diagramas de cajas que representan el nivel de expresión de tejido de cuatro miRNAs en 40 tejidos FFPE CaP y sus tejidos normales adyacentes apareados. Los niveles de expresión de los miRNAs se normalizan a U6 snRNA como control endógeno. Estadísticamente se determinaron diferencias significativas mediante la prueba t de Student para datos independientes. Detectamos disminución significativa en la expresión de miR-205 (
p Hotel & lt; 0,0001), el miR-214 (
p Hotel & lt; 0,0001), el miR-221 (
p
& lt; 0,001) y miR-99b (
p Hotel & lt; 0,0001) en los tejidos de CaP en comparación con los tejidos normales adyacentes. * indica p
Restaurant & lt; 0,0001 y ** indica
p Hotel & lt; 0,001. característica de operación (B) del receptor (ROC) análisis de la curva: curva ROC para cuatro miRNAs se hicieron para diferenciar el CaP de los tejidos sanos. El área bajo la curva ROC (AUC) para cada miARN transmite su precisión para la diferenciación de los tejidos con CaP y tejidos normales en términos de sensibilidad y especificidad.
características de funcionamiento del receptor (ROC) curvas eran construido para explorar la sensibilidad y especificidad de miR-205, miR-214, miR-221 y miR-99b y evaluar su potencial para ser utilizado como biomarcador para discriminar entre PCA y la enfermedad de individuos libres (fig. 1B). Los resultados sugieren que los cuatro miRNAs pueden discriminar entre los dos grupos con alta precisión; miR-205, AUC = 0,83 (IC del 95% = desde 0,74 hasta 0,91); miR-214 AUC = 0,92 (IC del 95% = 0,86-0,99); miR-221 AUC = 0,75 (IC del 95% = 0,63 a 0,84) miR-99b AUC = 0,86 (IC del 95% = 0,78 a 0,95) (Fig. 1B).
La expresión de miRNAs en conjuntos de datos GEO
la minería de datos se realizó mediante GEO2R para comprobar el estado de miRNAs expresados diferencialmente en los conjuntos de datos disponibles públicamente GEO. Microarrays de datos GSE21036 (Taylor et al.) [31] y GSE36802 (Lin et al.) [32] fueron consultados para la expresión de seleccionados cuatro miRNAs (miR-205, miR-214, miR-221 y miR-99b) de interesar. Apoyando a nuestros datos de tejido, en GSE21036, todos los cuatro miRNAs también se downregulated en los tumores de próstata primarios (n = 99) en comparación con tejidos de la próstata normales (n = 28) (miR-221,
p
& lt; 0,0001 ; miR-205,
p Hotel & lt; 0,0001; miR-99b,
p Hotel & lt; 0,0001; miR-214,
p Hotel & lt; 0,05). Del mismo modo, en GSE36802, se observó regulación a la baja de todos los cuatro miRNAs en tumor primario clínicamente localizado (n = 21) en comparación con benigna CaP (n = 21) (miR-221,
p
& lt; 0,0001; MIR -205,
p Hotel & lt; 0,0001; miR-99b,
p Hotel & lt; 0,0001; miR-214,
p
. & lt; 0,05) (figura 2).
los datos de validación de microARN para 99 pacientes (a) primarias CaP y 28 controles normales y (B) de 21 pacientes cada uno con CaP clínicamente localizado primaria y benigna CaP se obtuvieron de la base de datos NCBI GEO (GEO adhesión no. GSE21036 y GSE36802, respectivamente). Se muestran los gráficos de dispersión de nivel de expresión de miR-205, miR-214, miR-221 y miR-99b en los conjuntos de datos obtenidos de la base de datos GEO.
Pathway Análisis de Redes de miRNAs diferencialmente Modulada
para obtener información funcional sobre el papel de los genes miARN en el CaP y para investigar las posibles interacciones gen-gen entre los objetivos de los cuatro miRNAs, hemos construido una red de interacción utilizando Pathway Studio 9.0. Un total de 98 objetivos de mRNA fueron identificados por (a) objetivos comunes obtenidos a partir de tres softwares (TargetScan, PicTar y miRDB) para todos los miRNAs y 4 objetivos (b) validados para los 4 miRNAs fueron obtenidos por miRTarBase. Añadimos reguladores comunes junto con las interacciones-directa regulación de la expresión génica, la unión proteína-proteína, o promotor. Un complejo de señalización evolucionado a partir de 62 de los 98 objetivos reveló VEGFA, ICAM1, p53, ESR1, SELE y FOS como nodos comunes /cubos de varias interacciones que sugieren vías que transitan regularmente por los genes conectados y candidato a la futura verificación experimental y estudios funcionales (fig. 3). Las 36 dianas de descanso fueron excluidos por el software debido a la falta de conectores comunes. Una segunda vía, construida para identificar los genes miARN objetivos con interacciones directas, sugirió nodos similares /hubs (Fig. 3).
Red de Camino fue construido para ARNm diana comúnmente predichos de miRNAs diferencialmente moduladas (miR-205, miR 214, miR-221 y miR99b), mediante el uso de Pathway Studio 9.0 (A) miARN objetivos previstos comúnmente con los reguladores comunes. (B) que interactúan directamente objetivos.
variación étnica en miARN expresión
afroamericano (AA) los hombres tienen una mayor incidencia de CaP en comparación con los hombres de raza caucásica de América (CA). Nos preguntamos si los niveles de expresión de miR-205, miR-214, miR-221 y miR-99b fueron diferentes entre las dos poblaciones (n = 15 CA; n = 25 AA). Para probar esta comparamos las veces las diferencias de cada miARN en el tejido de cáncer con respecto a su tejido normal adyacente en AA y CA muestras. Como se muestra en la Fig. 4, no hubo diferencias significativas en los patrones de expresión de miR-205, miR-214 y miR-221 entre CA y la población de AA. Sin embargo, una significativa disminución de la expresión (
p Hotel & lt; 0,01) (Fig. 4). MiR-99b de la que se observó en el tejido de cáncer de pacientes con CaP AA en comparación con los pacientes con CaP CA
Box parcelas representan la diferencia veces en los niveles de expresión de cuatro miRNAs en los tejidos de CaP en comparación con su homólogo adyacente normal. Los datos de 15 pacientes 25 Afroamericanos (AA) de raza caucásica de América (CA) y según la evaluación de QRT-PCR se muestran. Los niveles de expresión de los miRNAs se normalizaron a U6 snRNA como control endógeno. Estadísticamente se determinaron diferencias significativas mediante la prueba t de Student para datos independientes.
Detección de miRNAs en muestras de orina
biopsias de tejido son invasivas y no la fuente preferida para los biomarcadores. A continuación exploramos la posibilidad, si el miR-205, miR-214, miR-221 y miR-99b se pudieron detectar de manera no invasiva mediante el análisis de muestras de orina de pacientes con CaP. A partir de un estudio en curso, se seleccionaron 36 pacientes con CaP y 12 años de edad y origen étnico emparejado donantes sanos como grupo control sin cáncer. La Tabla 3 muestra las características de los pacientes con CaP e individuos sanos reclutados en el estudio de muestras de orina. Dado que para los genes miARN perfiles utilizamos muestras de tejido con GS6 y GS7, se obtuvieron muestras de orina de pacientes con GS6 y GS7 como una reflexión de las muestras de tejido. Los cuatro miRNAs (miR-205, miR-214, miR-221 y miR-99b) estaban presentes en concentración detectable en muestras de orina. Se encontró que el urinario de miR-205 (
p Hotel & lt; 0,05) y miR-214 (
p Hotel & lt; 0,05) los niveles fueron significativamente inferiores en el grupo de cáncer en comparación con el grupo control sano ( Fig. 5A). No se observaron diferencias significativas en los niveles de expresión de miR-221 y miR-99b. Para evaluar el potencial de diagnóstico, se construyeron curvas ROC para los 4 miRNAs analizados en las muestras de orina. La curva ROC mostró que el miR-205 y miR-214 pueden discriminar a los pacientes con CaP de mando normal y de AUC: 0,7083 (IC del 95% = 0,54-0,86) y 0,7431 (IC del 95% = desde 0,58 hasta 0,90), respectivamente (Fig. 5B) . Además, el miR-205 y miR-214 si se emplean juntos pueden discriminar a los pacientes con CaP de individuos sanos con una sensibilidad del 89% y especificidad del 80% (Fig. 6). En conjunto, nuestros resultados muestran que miR-205 y miR-214 están presentes tanto en el tejido y la orina de pacientes con CaP, lo que sugiere que la orina podría emplearse para detectar cambios en los niveles de expresión de miRNAs.
(A) diagramas de cajas que representan el nivel de expresión de la orina de cuatro miRNAs (miR-205, miR-214, miR-221 y miR-99b) en la orina de 36 pacientes con CaP y 12 individuos sanos como se evaluó mediante qRT-PCR. Los niveles de expresión de los miRNAs se normalizan a RNU48 como control endógeno. Estadísticamente se determinaron diferencias significativas mediante la prueba t de Student. Detectamos significativa disminución de la expresión de miR-205 (
p Hotel & lt; 0,05), el miR-214 (
p Hotel & lt; 0,05) en la orina de los pacientes con CaP en comparación con los controles sanos. No se observaron diferencias significativas en los niveles de expresión de miR-221 y miR-99b. * Denota
p Hotel & lt; 0,05. Se utilizó característica de operación (B) del receptor (ROC) análisis de la curva de cuatro miRNAs para diferenciar pacientes con CaP de individuos sanos. El área bajo la curva ROC (AUC) para cada miARN transmite su precisión para la diferenciación de los pacientes con CaP y sujetos sanos en términos de sensibilidad y especificidad.
La cuantificación de miR-205 y miR-214 en conjunto puede mejorar el valor diagnóstico y se puede utilizar para discriminar pacientes con CaP de individuos sanos con una sensibilidad del 89% y 80% de especificidad.
Discusión
las alteraciones en los niveles de expresión de los genes miARN, lo que resulta en la modulación de múltiples vías de señalización, se han vinculado a la iniciación y la progresión del CaP. En el presente estudio, el uso de perfiles de miARN mundial seguido de estudios de validación, se demostró que el miR-205, miR-214, miR-221 y miR-99b se downregulated significativamente en los tejidos de CaP en comparación con sus homólogos de tejido normal adyacente.
Uno de los más estudiados microARN, miR-205, que se muestra como el regulado en varios tipos de cáncer, incluyendo el CP [33] - [34], también fue identificado como downregulated miARN en el CaP en nuestro estudio. miR-205 se ha demostrado que es supresora de tumores epigenetically reprimido en el CaP [35] que ejerce sus funciones de tumor supresor en la próstata humana a través de la baja regulación de múltiples objetivos tales como BCL2 [36], proteína quinasa C epsilon [34] y receptor de andrógenos (AR) [37]. La pérdida de miR-205 también se ha asociado con un mal pronóstico, la resistencia a la apoptosis en CaP y se sugiere a ser una característica de la transición epitelial-mesenquimal [37] - [41]. Otros estudios de expresión serie también han identificado el miR-205 siendo reprimido en el CP [33] - [34], [42] - [43]. la expresión de bajo nivel de miR-205 también es un marcador pronóstico de la cabeza humana y el cuello carcinoma de células escamosas [44] y el locus se ha informado a ser silenciados por hipermetilación del promotor en los tumores de vejiga invasivo [45]. El presente estudio, así como la literatura previa afirma un importante papel de miR-205.
El siguiente miARN expresado de forma aberrante en nuestro estudio fue de miR-214, que se ha demostrado que ser regulados a la baja frecuencia en el cáncer de cuello de útero [46], de ovario cáncer [47] - [48], carcinoma hepatocelular [49] - [51] y colangiocarcinoma [52]. En contraste, la alta expresión de miR-214 se ha asociado con el cáncer de páncreas [53] y con resultado desfavorable en la supervivencia global en el carcinoma gástrico [54]. MiR-214 desregulación no ha sido previamente reportado en el cáncer de próstata. Este es el primer estudio que muestra que el miR-214 se expresa de manera aberrante en el CaP. La regulación a la baja significativa en las biopsias de tejido, así como las muestras de orina de pacientes con CaP introduce el miR-214 como un nuevo jugador en el CaP, que habría que seguir estudiando.
Otra miARN downregulated en nuestro estudio fue de miR-221. Es importante destacar que, miR-221 fue identificado como el más modulada significativamente miARN en los dos conjuntos de datos CaP GEO. MiR-221 está desregulado en varios tipos de cáncer, principalmente como un miARN [55] sobreexpresado - [59]
En el CP, regulación a la baja de miR-221 se ha reportado en TMPRSS2:. ERG por fusión CP positivo y se asocia significativamente con la metástasis y la recurrencia bioquímica [58], [60]. Pocos estudios han informado también un papel oncogénico de miR-221 en el CaP [61] - [62] y el desarrollo y mantenimiento de la resistencia a la castración fenotipo [63] - [64]. Nuestro resultado es uno de los pocos informes baja regulación de miR-221 en los tejidos de CaP y justificar estudios adicionales.
Otra muy importante miARN identificados en nuestro estudio fue de miR-99b. La familia de miR-99 incluyendo el miR-99b se ha asociado con la supresión del CP y el pronóstico [63]. El descenso de regulación de miR-99b también se ha observado en pacientes con cáncer de pulmón [65]. Mir-99b también se ha demostrado que se sobre-expresan en el sarcoma sinovial [66] y se asocia con la presencia de metástasis en los ganglios linfáticos en el cáncer de esófago [67]. Nuestros resultados indican que la baja regulación de miR-99b es más pronunciada en los tejidos de CaP AA en comparación con los tejidos CA PCA (Fig. 4). Los estudios funcionales sobre el miR-99b son limitadas y estas nuevas observaciones exigen nuevas investigaciones sobre el papel de los objetivos de miR-99b. Tomados en conjunto, presentes datos indican que, junto con varios otros factores, la variación de la expresión de miRNAs como miR-99b puede explicar la agresividad étnica de la enfermedad.
Para explorar las redes de señalización reguladas por estos cuatro miRNAs, hemos construyó una vía de sus objetivos previsto comunes usando herramientas bioinformáticas disponibles y objetivos validados en la literatura. La adición de los reguladores comunes, se identificaron los centros de señalización centrales que han sido reportados a jugar un papel importante en la señalización de las células cancerosas que sugiere un papel importante de estos cuatro miRNAs en el CaP (Fig. 3). A continuación, se construyó una red de interacción directa de los genes miARN objetivos sin reguladores comunes. VEGFA, p53, ESR1, FOS y ICAM1 permaneció como cubos centrales [68] - [72]. La mTOR era el único objetivo de miR-99b que se incluyó en la red común. Se identificaron miR-99b como diferencialmente modulada miARN en AA CaP. vía mTOR desempeña un papel importante en el CaP y se ha asociado con una enfermedad agresiva, resistencia a la terapia y el desarrollo de la castración resistente CaP [73]. inhibidores de mTOR también se han evaluado como terapia para CRPC [74]. Asociación de miR-99b con AA CaP es muy significativa y más estudios en nuestro laboratorio se dirigen hacia la caracterización de miR-99b y sus objetivos en representación agresiva fenotipo CaP.
El concepto de usar la orina para la detección de diferencialmente expresado miRNAs como biomarcador es relativamente nuevo. Teniendo en cuenta la idea de que los derivados de tejido patrones de expresión de miRNAs nos pueden ayudar a evaluar los miRNAs como biomarcadores para varios tipos de cánceres en circulación, miRNAs más prometedores observados en nuestro estudio fueron estudiados en la orina de los pacientes con CaP para evaluar su potencial de diagnóstico o pronóstico. De acuerdo con nuestros hallazgos en muestras de tejido, también hemos sido capaces de detectar el miR-205, miR-214, miR-99b y miR-221 en las muestras de orina de pacientes con CaP. Los niveles de miR-205 y miR-214 fueron significativamente más bajos en pacientes con CaP y pueden ser explorados como un biomarcador de diagnóstico no invasivo para el CaP. Aunque la sensibilidad y la especificidad es mayor en el tejido, urinario miR-205 y miR-214 niveles juntos pueden discriminar a los pacientes de individuos sanos con una alta precisión. Para nuestro conocimiento, nuestro estudio revela por primera vez que el miR-205 y miR-214 pueden proporcionar una modalidad no invasiva alternativa para distinguir entre PCa y los individuos sanos y pueden servir como un biomarcador fiable para CaP.
el uso de la orina como una muestra para el marcador del tumor sigue siendo un reto en vista del hecho de que la orina contiene una amplia variedad de biomoléculas incluyendo alta cantidad de nucleasas y RNasas. Sin embargo, debido al pequeño tamaño, miRNAs son más estables frente a la degradación RNasa que aboga por su mérito como biomarcadores [75]. Pocos estudios han examinado el potencial de miRNAs urinarias como marcadores de diagnóstico y pronóstico del cáncer de vejiga, enfermedad renal, cáncer urotelial, carcinoma hepatocelular y carcinoma de células renales [76] - [80]. Aunque los niveles de miARN se han estudiado en diversas enfermedades, ningún estudio exhaustivo para la circulación de miARN en la orina para CaP se ha informado hasta la fecha, con la excepción de Bryant et al [81] - [82]. Significativamente más alta concentración de miR-107 y miR-574-3p se cuantificaron en la orina de los hombres con CaP en comparación con los controles [82]. A lo mejor de nuestro conocimiento, hemos demostrado por primera vez, que el miR-205 y miR-214 se downregulated en el tejido del CP, así como en la orina de pacientes con CaP. Reconocemos la limitación de nuestro estudio que los tejidos y orina obtenidas no eran de los mismos pacientes y nuestro tamaño pequeño de la muestra. Sin embargo, nuestro estudio proporciona una prueba de concepto que desregulados miRNAs en los tejidos pueden ser explorados como biomarcadores no invasivos de orina en el CP. La curva ROC demuestra que el miR-205 y miR-214 en conjunto tienen una capacidad para distinguir entre individuos sanos y pacientes con CaP con una sensibilidad del 89% y 80% de especificidad.