Extracto
Antecedentes
cánceres de ovario y endometrio serosos de alto grado son los tumores malignos del aparato reproductor femenino más letales en todo el mundo. En parte, el hecho de tratar a estos dos cánceres agresivos con éxito se centra en el hecho de que mientras que la mayoría de los pacientes son diagnosticados en base a las estrategias de vigilancia actuales como tener una respuesta clínica completa a su terapia primaria, casi la mitad desarrollará recurrencia de la enfermedad dentro de los 18 meses y la la mayoría morirá de recurrencia de la enfermedad dentro de los 5 años. Por otra parte, hay actualmente utilizado biomarcadores o pruebas de imagen pueden predecir el resultado después del tratamiento inicial. ADN circulante tumoral (ctDNA) representa una poderosa teoría biomarcador para la detección de la enfermedad de otro modo oculto. Por lo tanto, hemos explorado el uso de marcadores personalizados ctDNA tanto como un biomarcador vigilancia y pronóstico en cáncer ginecológico y comparó esto con las herramientas actuales de vigilancia aprobados por la FDA.
Métodos y Hallazgos
tumorales y muestras de suero fueron recogido en el momento de la cirugía y luego a lo largo curso de tratamiento para 44 pacientes con cánceres ginecológicos, lo que representa 22 casos de cáncer de ovario, los casos de cáncer uterino 17, uno peritoneales, tres trompas de Falopio, y un paciente con trompa de Falopio síncrono y el cáncer uterino. mutaciones de pacientes /específicos de tumores se identificaron utilizando todo el exoma y la secuencia génica dirigida y niveles ctDNA cuantificado usando PCR gotita digital. CtDNA se detectó en el 93,8% de los pacientes en los que se diseñaron sondas y los niveles fueron altamente correlacionados con CA-125 en suero y la tomografía computarizada (TC) los resultados del análisis. En seis pacientes, ctDNA detectado la presencia de cáncer, incluso cuando la TC fue negativa y, en promedio, tenían un plazo de ejecución de siete meses predictivo más imágenes de TC. En particular, los niveles indetectables de ctDNA a los seis meses después del tratamiento inicial se asoció con la supervivencia global y libre de progresión notablemente mejorada.
Conclusiones
La detección de la enfermedad residual en ginecológico, y de hecho todos los tipos de cáncer, representa un dilema diagnóstico y un potencial punto de inflexión fundamental en la medicina de precisión. Este estudio sugiere que el uso de biomarcadores ctDNA personalizados en los cánceres ginecológicos puede identificar la presencia de tumor residual, mientras que también la predicción más dinámicamente la respuesta al tratamiento con respecto a los usados actualmente estudios de suero y de formación de imágenes. De particular interés, ctDNA fue un predictor independiente de la supervivencia en pacientes con cáncer de ovario y de endometrio. reconocimiento más temprano de la persistencia de la enfermedad y /o la repetición y la posibilidad de estratificar en mejores y peores grupos de resultados a través de la vigilancia ctDNA puede abrir la ventana para mejorar la supervivencia y la calidad y la vida en estos tipos de cáncer
Visto:. Pereira E, Camacho -Vanegas O, S Anand, Sebra R, Catalina Camacho S, Garnar-Wortzel L, et al. (2015) personalizada biomarcadores tumorales circulantes de ADN dinámicamente a predecir la respuesta al tratamiento y la supervivencia en los cánceres ginecológicos. PLoS ONE 10 (12): e0145754. doi: 10.1371 /journal.pone.0145754
Editor: Goli Samimi, Instituto Nacional del Cáncer, Estados Unidos |
Recibido: 27 Octubre, 2015; Aceptado: December 8, 2015; Publicado: December 30, 2015
Derechos de Autor © 2015 Pereira et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Estos estudios fueron financiados, en parte, por donaciones de la Iniciativa Varadi de ovario en cáncer (voz), la Fundación Derald H. Ruttenberg y la EM Gordon familia. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción malignidades
ginecológicos serán diagnosticados en más de 94.000 mujeres en los EE.UU. y dará lugar a cerca de 29.000 muertes sólo en este año [1]. El desarrollo de biomarcadores más sensibles y precisos será fundamental tanto para la detección temprana de la enfermedad y la vigilancia más eficaz en el entorno de post-tratamiento. Por ejemplo, en el cáncer epitelial de ovario, la hembra neoplasia maligna del tracto reproductivo más letal en todo el mundo, la mayoría de las mujeres se presentan con enfermedad en estadio avanzado que será gestionado por la resección quirúrgica seguida de la combinación de platino y la quimioterapia basada en taxanos. Engañosamente, el uso de tecnologías de detección de corriente, 80% de estos pacientes parecen tener una respuesta clínica completa a la terapia primaria. De hecho, más de la mitad desarrollará recurrencia de la enfermedad dentro de los 18 meses. Por lo tanto, un período de tiempo crítico para iniciar un tratamiento más agresivo más temprano y mejorar la supervivencia es potencialmente perdido para siempre. El biomarcador de suero única actualmente disponible en tumores malignos ginecológicos, CA-125, carece de la sensibilidad y especificidad de la respuesta al tratamiento de vigilancia y detección temprana de recurrencia [2,3]. modalidades de imagen, como la tomografía computarizada (TC) se utilizan comúnmente para la vigilancia de las enfermedades, sino también carecen de sensibilidad y, a menudo no son concluyentes o retrasado en la demostración de progresión de la enfermedad [4,5].
La cantidad absoluta de ADN libre de células (cfDNA) en el suero del paciente como marcador de la presencia de la enfermedad en tumores malignos ginecológicos fue explorada por primera vez hace más de 10 años [6,7]. Con el advenimiento de nuevas tecnologías de secuenciación y técnicas analíticas, la capacidad de detectar ADN específico de tumor (ctDNA), a menudo referida como la "biopsia líquida" circulante, ha evolucionado. La medición de ctDNA ha demostrado ser un reflejo exacto de la presencia de la enfermedad y la evolución del tumor en varios tipos de cáncer incluyendo cáncer de mama, pulmón, colon, y cánceres de estómago [8-12]. Estudios previos en tumores malignos ginecológicos han evaluado principalmente la presencia de ctDNA en un solo punto de tiempo usando lavados pélvica, ascitis, suero y plasma [13-15]. Como prueba de principio de estudio para demostrar la capacidad de rastrear serie de enfermedades, hemos utilizado recientemente un evento de fusión específico de tumor para demostrar la presencia continua de ctDNA y enfermedad residual por lo tanto mínima, en un solo paciente durante un período de cuatro años en la cara de las mediciones de CA125 en varias ocasiones normales [16]. Aparte de esto, los estudios longitudinales que correlacionan niveles ctDNA con la carga tumoral y el curso clínico de los cánceres ginecológicos son insuficientes. No obstante, la naturaleza dinámica, sensible y específica teórica de ctDNA como biomarcador sugiere un gran potencial para revolucionar nuestro enfoque a la vigilancia de tumores en los cánceres ginecológicos.
A continuación se describe una tubería rápida y eficiente que las parejas mutación puntual específico de tumor la identificación y detección de ctDNA basada en PCR digital de las gotas. Hemos probado esta tubería para detectar y controlar el estado del tumor en 44 mujeres con cánceres ginecológicos. En concreto, el uso de una combinación de secuenciación del exoma (WES) y el panel de la secuenciación de genes dirigida, hemos recopilado los perfiles de mutación del tumor para una cohorte de pacientes con cáncer de ovario y endometrio. paneles derivados de los pacientes de biomarcadores ctDNA se generaron y se sometieron a pruebas de PCR gotita digital, que se validó para ser capaz de detectar una sola copia de ctDNA por muestra de suero. Los resultados se compararon ctDNA contra la corriente de biomarcadores en suero, CA125, la TC aprobado por la FDA y el estado quirúrgico /clínico conocido de los pacientes. Este es el primer estudio que demuestra en los cánceres ginecológicos que ctDNA puede detectar la presencia de cáncer antes que otras modalidades de ensayo que actualmente recomendados y que ctDNA niveles al completarse la terapia primaria son un predictor independiente tanto libre de progresión (SLP) y supervivencia global ( OS).
Métodos
de inscripción del paciente y la recogida de muestras
Cuarenta y cuatro pacientes con ginecológicos, tumores malignos fueron matriculados y aprobados para su participación después de obtener el consentimiento informado por escrito adecuado como parte de nuestra Junta de Revisión Institucional (IRB): aprobado programa de genómica del cáncer ginecológico en la Escuela de Medicina de Icahn en el Monte Sinaí (Tabla 1). Las muestras tumorales se recogieron en el momento de la cirugía. Las muestras de sangre se recogieron en el momento de la cirugía y de nuevo con cada extracción de sangre en todo el curso clínico del paciente. tejido tumoral quirúrgica fue inmediatamente se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido después de la cosecha y el suero se recogió en BD Vacutainer SST II tubos de avance (BD Diagnostics, Franklin Lakes, NJ). Dentro de cuatro horas después de la recogida, las muestras de sangre se centrifugaron durante 10 minutos a 12.000 g). El suero se transfirió a un tubo Falcon de 15 ml y se centrifugó a 1,200g durante 10 minutos adicionales para eliminar los desechos celulares restante. Los datos clínicos se extrajo de las historias clínicas de los pacientes e incluyeron variables demográficas, localización del tumor inicial, histología, grado, estadio, CA-125 niveles y regímenes quimioterapéuticos. Los datos relativos a los procedimientos quirúrgicos, los sitios de enfermedad metastásica, y recidivas tumorales, también se recogieron. Todos los pacientes con cáncer de endometrio o de ovario fueron elegibles para la inscripción si las muestras necesarias de acuerdo con el protocolo del estudio y los datos clínicos pertinentes estaban disponibles:. CA-125 niveles, los resultados de la tomografía computarizada (TC), los resultados quirúrgicos y regímenes de quimioterapia
DNA Extraction Protocolos
tumor ADN genómico fue extraído de aproximadamente 25-50 mg de tejido utilizando la sangre DNeasy Tissue Kit y (Qiagen, GmbH, Hilden) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. DNA de la línea germinal se extrajo de la sangre entera usando el ArchivePure DNA Kit (5 Prime) según el protocolo de purificación de ADN de sangre total, proporcionado por el fabricante. La cuantificación de ADN genómico se realizó mediante fluorometría por Qubit. Libre circulante (cfDNA) se extrajo a partir de 1 ml de suero utilizando el Kit de ácidos nucleicos circulantes (Qiagen, GmbH, Hilden) y se eluyó con 105 l de DNasa y RNasa libre de agua.
Identificación de mutaciones somáticas
perfiles de mutaciones tumorales se identificaron personalizados para el tumor de cada paciente por cualquiera de secuenciación del exoma (WES) o un enfoque de secuenciación de genes diana. En ambos ensayos, se secuenciaron ADN genómico (gDNA) a partir de tejido tumoral y un control normal para identificar variantes genéticas (SNVS y pequeños indeles) específicos para el tumor sólo (mutaciones somáticas). Toda la secuenciación se realizó en el Departamento de Genética y Genómica en la Escuela de Medicina de Icahn en el Monte Sinaí. bibliotecas de todo el genoma se prepararon a partir ADNg utilizando el kit de ADN NEBNext Biblioteca Prep (New England Biolabs, Ipswich, MA), enriquecida con las bibliotecas del exoma utilizando el sistema de captura de la versión 3.0 SeqCap EZ Exoma humana Biblioteca (Roche NimbleGen, Madison, WI) , que abarca aproximadamente 64 Mb del genoma donde las variantes pueden ser llamados; secuenciación de extremo emparejado (2x100 lee nt) se realizó sobre Illumina HiSeq 2500 (Illumina, San Diego, CA) en cualquiera de alto rendimiento o el modo rápido de ejecución. secuenciación del gen diana se realizó utilizando iones AmpliSeq
TM Grupo cáncer hotspot v2 (Life Technologies, Carlsbad, CA) utilizando la tecnología de secuenciación Ion Torrent PGM para ~ 1000 a la cobertura de 3000X. El Ion AmpliSeq
TM cáncer hotspot Grupo v2 interroga a 50 oncogenes y genes supresores de tumores a través de 207 amplicones (que cubren 21.820 nt donde variantes pueden ser llamados). Basado en la experiencia, candidatos mutaciones somáticas se triaged para el desarrollo de la sonda Taqman si fracción alelo mutante era ≥ 8% y se pasa revisión manual mediante la inspección de las alineaciones de lectura primas en la herramienta genoma navegador IGV, entonces validado para generación final de la sonda por secuenciación directa Sanger de tumor ADN y su ADN genómico emparejado de células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Puesto que los datos WES proporcionado un mayor número de candidatos mutaciones somáticas que era práctico para validar, se dio prioridad a los candidatos con mayor fracción alélica y una mejor calidad variante llamada.
ensayo de PCR Diseño y Validación
Los ensayos TaqMan personalizados fueron diseñados utilizando la herramienta de diseño basada en la web Life Technologies (www.lifetechnologies.com/order/custom-genomic-products). Los ensayos de PCR contenían cebadores no marcados (directa e inversa), además de VIC, TET o FAM etiquetados sondas, que probaron para el tipo salvaje y mutante variantes respectivamente. Los ensayos se validan a continuación por PCR cuantitativa (qPCR) usando TaqMan® Genotipado Master Mix (Life Technologies, Foster City, CA) en un ABI PRISM 7900 HT Sistema de Detección de Secuencia (Applied Biosystems, Foster City, CA). En primer lugar, la especificidad fue establecido mediante pruebas de ensayos sobre el tumor y el ADN genómico PBMC emparejado. Linealidad de cada ensayo a continuación, se estableció comparando cada ensayo frente a una curva estándar preparada a partir de una serie de diluciones en serie de ADN tumoral, que van desde 400 hasta 4000 copias equivalentes del genoma específico de dicho ensayo.
Mutación cuantificación en libre circulante ADN (cfDNA)
Para establecer aún más la sensibilidad, linealidad y los límites de detección más bajos, los ensayos desarrollados fueron analizadas por PCR gotita digital (RainDance Technologies, Billerica, MA) según el protocolo del fabricante. Para este propósito, las diluciones seriadas de ADN tumor, preparados para cada ensayo, y que van desde 2-24 copias se enriquecieron en un fondo de 100.000 copias de ADN genómico de tipo salvaje. Una vez establecido el límite inferior de detección para cada ensayo, se realizó en ddPCR cfDNA extraído de suero y /o plasma del paciente. Twenty l de cfDNA eluido se utilizó para cada reacción de PCR, lo que representa 200 l de suero. El volumen total de reacción de PCR fue de 50 l (la generación de 10 ^ 6 gotas). Las condiciones de PCR fueron las siguientes: 95ºC durante 10 minutos para un ciclo; 95C (15 segundos) y 58C (un minuto) con un paso de 45 ciclos cada uno; y 98C (10 minutos). El producto de PCR se introdujo en el instrumento RainDrop Sense para la cuantificación de tipo salvaje y el número de copias mutantes. Cada muestra se analizó cfDNA por al menos dos repeticiones. Para establecer la reproducibilidad del ensayo y la eficiencia de la extracción cfDNA, de pinchos cada muestra de sangre del paciente con una concentración conocida de ADN Lambda digerido con HindIII del fago (Qiagen, GmbH, Hilden) antes del aislamiento cfDNA. qPCR se utiliza para cuantificar los 125 y 535 pb fragmentos de ADN de las HindIII λ-. Basado en λ eficacia de la extracción de ADN, la eficiencia de recuperación para las extracciones cfDNA utilizados en estos estudios fue de entre 60 y 90%.
Análisis estadístico
Para evaluar la capacidad de ctDNA y CA125 para predecir la presencia del tumor en la TC y en el momento de la cirugía, los parámetros de sensibilidad y especificidad, así como los correspondientes intervalos de confianza del 95% se calcularon utilizando modelos log-binomial que se tenían en cuenta las correlaciones que surgieron a partir de ahí son múltiples mediciones en el mismo paciente a lo largo hora. probabilidades predichas a partir de estos modelos ajustados fueron utilizadas en los modelos de regresión logística para estimar y comparar las áreas bajo las curvas características operativas del receptor (ROC) (AUCs) tanto para ctDNA y CA125. La supervivencia global (SG) y la supervivencia libre de progresión (SLP) se estimaron utilizando el método de Kaplan-Meier y se compararon con la prueba de log-rank, entre los pacientes con niveles de ctDNA que eran o después de la resección quirúrgica presente o ausente y la terapia adyuvante. Todos los análisis estadísticos se realizaron con SAS versión 9.3 (SAS Institute, Inc., Cary, NC). La prueba de hipótesis fue de dos caras y llevado a cabo al nivel del 5% de significancia.
Resultados
Características clínico-patológicas de los pacientes y sus tumores
Cuarenta y cuatro pacientes sometidos a tratamiento para ginecológico el cáncer se inscribieron para este estudio y su tipo de cáncer y la información clínico-patológico se muestra en la Tabla 1. ADN derivado de un tumor, el ADN de la línea germinal, ctDNA y estaban disponibles para todos los pacientes de datos clínicos. Todos los tumores de ovario eran histología serosa de alto grado con la excepción de un tumor mesodérmico mixto maligno. Aunque la mayoría de los cánceres de endometrio eran de alto grado, los subtipos histológicos fueron variadas. A los efectos de nuestros tumores serosos análisis de alta calidad de la trompa de Falopio, el peritoneo y ovario fueron agrupados juntos como carcinomas serosos de alto grado de la pelvis (HGSC). La mayoría de los tumores secuenciados se recogieron en el momento de la cirugía primaria (n = 40), mientras que cuatro muestras de tumores eran de recurrencias.
Identificación de variantes genómicas somáticas y el desarrollo de ensayos personalizados ddPCR
Una visión general de nuestro análisis de tuberías ctDNA personalizada se muestra en la figura S1. Usando una combinación de agua y saneamiento ambiental y la secuenciación del panel dirigido, primero tuvo como objetivo identificar mutaciones significativas específicas de tumor para el desarrollo de las gotitas digitales ensayos basados en PCR (ddPCR). Ocho tumores fueron secuenciados utilizando los datos de WES Illumina secuenciación de extremo emparejado recogidos en el HiSeq 2500 y 36 fueron secuenciados utilizando el Panel de hotspot cáncer Ion AmpliSeq ™ v2 dirigida utilizando el secuenciador Ion Torrent PGM. Todos los tumores fueron secuenciados utilizando WES tumores de ovario. Las muestras de suero estaban disponibles ya sea de la cirugía primaria o secundaria para todos los pacientes. sueros longitudinales estaban disponibles para 23 pacientes. ctDNA fue extraído de un total de 228 puntos de tiempo individuales con un promedio de 7.8 puntos de tiempo por paciente (fig 1). Se identificaron
mutaciones candidatos para 36 pacientes (S1 Tabla). De las mutaciones descubiertas mediante el panel específica, el gen era el más mutado TP53 (23/36 pacientes; 66%), que siempre se produjo en alto grado la histología serosa tanto para los tumores de ovario y endometrio. También se han detectado mutaciones, aunque a frecuencias más bajas, en PTEN, PIK3CA, MET, KRAS, BRAF y FBXW7. mutaciones múltiples candidatos fueron identificados por 16 pacientes. Todas las mutaciones candidatos fueron confirmados por secuenciación de Sanger de los tumores respectivos
.
En total, 52 ensayos únicos, de 55 diseñado, fueron validados para la sensibilidad, especificidad y linealidad usando PCR cuantitativa (qPCR), que representa a 32 pacientes para se podrían realizar estudios cuantitativos que ctDNA. La solidez de los diferentes ensayos generados para cada uno de los pacientes se demostró mediante una serie de diferentes métricas. Para los 52 ensayos, el coeficiente de correlación de la linealidad, R
2, fue superior a 0,99 (media, 0.9988, S2A figura). Se establecieron los límites inferiores de detección para cada ensayo personalizado por medio de ADN tumoral con púas del paciente respectivo con mutaciones conocidas y probadas usando 2-24 copias mutantes en un fondo de 100.000 copias de tipo salvaje de su ADN de la línea germinal. Sobre la base de estas pruebas, la sensibilidad para discriminar entre el tipo salvaje y mutante secuencia para todas las sondas utilizados en este estudio oscilaron entre 0,01% y 0,002%. La cuantificación de copias mutantes tumorales específicos en cfDNA fue altamente correlacionado en réplicas ddPCR (Pearson r: 0.9938, S2C figura). También hubo una alta correlación lineal entre la fracción alélica según lo determinado por ddPCR y específica de secuenciación (Pearson r: 0,95). Y esta correlación fue estadísticamente significativa p = 4.47E-15 (Fig S2D)
La estimación de la sensibilidad y la la especificidad de ctDNA para predecir el tumor presencia
a continuación, se evaluó la capacidad de los ctDNA recogido en serie para detectar la presencia clínica de tumor. Al mismo tiempo, también comparó la prueba aprobada por la FDA se utilizan actualmente, CA-125. Para establecer una verdad motivo relativo de la presencia del tumor, se utilizó hallazgos de imagen y CT en el momento de la cirugía. Aunque son relativamente imprecisos, esto nos permitió identificar una serie de hallazgos importantes. Los datos que comparan ctDNA y los niveles de CA-125 a la presencia de tumor en la TC estaba disponible a través de 53 puntos de tiempo para 23 pacientes.
La sensibilidad y la especificidad de ctDNA para predecir la presencia de tumor en la TC fue emparejado 0,91 [0,73-0,97] y 0,60 [0,31 a 0,83], respectivamente (Tabla 2). Se obtuvieron resultados similares para la CA-125 y escaneo CT (Tabla 2). La baja especificidad de ctDNA fue sorprendente para nosotros y así hemos examinado esto en mayor profundidad. Se encontró que la discrepancia a ser el resultado de una falta de concordancia entre las pruebas en seis pacientes. En concreto, los seis pacientes tenían niveles detectables de ctDNA pero los resultados negativos de imágenes CT plazo de dos semanas de la extracción de sangre ctDNA. El interrogatorio de su historia completa reveló que los seis pacientes fueron encontrados más tarde a tener tumores de cirugía demostrado que no habían sido detectadas por la exploración CT. Por otra parte, el análisis de los datos del paciente reveló que, en promedio, ctDNA predijo recurrencia aproximadamente 7 meses. (Rango: 1-11 meses) antes de la TC (figura 2)
En este ejemplo representativo, el aumento de los niveles en ctDNA 137 pacientes los niveles preceden a un aumento en los niveles de CA-125 por seis meses y la identificación positiva antes de la fecha de crecimiento del tumor que requiere la resección del intestino siete meses más tarde. La TC no es específico y el paciente fue llevado a la sala de operaciones para cirugía exploratoria, que reveló la presencia de un tumor.
niveles
CA-125 y ctDNA se compararon con la presencia de tumoral en el momento de la cirugía a través de 30 puntos de tiempo para 21 pacientes. Cuando se compara con la presencia de tumor en la cirugía, ctDNA tenía una sensibilidad de 0,81 [0,60 hasta 0,92] y una especificidad de 0,99 [0,81-0,99]. En comparación, la sensibilidad y especificidad de CA-125 fue de 0,82 [0,61-0,93] y 0,64 [0,17-0,94], respectivamente. Las áreas bajo las curvas ROC se calcularon para ctDNA y CA-125 y fueron 0,91 [0,83-0,99] y 0,70 [0,44-0,95], respectivamente. Aunque estos resultados sugieren que ctDNA podría ser una prueba de diagnóstico más preciso que la CA-125, la diferencia en las curvas ROC no fue estadísticamente significativa (p = 0.3575) [Tabla 2]
Niveles. CtDNA siguientes Tratamiento inicial son predictivos de diferencias de supervivencia
a continuación evaluó si los niveles ctDNA después de la terapia adyuvante y la resección quirúrgica tenía importancia pronóstica. Pre y niveles ctDNA post-tratamiento se analizaron para 10 pacientes y se compararon con SLP y la SG. estado clínico actual, muerto de la enfermedad (DOD), vivo con la enfermedad (AWD) y sin evidencia de enfermedad (NED), estaba disponible para todos los 10 pacientes (Tabla 3). niveles indetectables de ctDNA después del tratamiento inicial adyuvante se asociaron con tanto mejora de la SSA (p = 0,0011 Kaplan Meier) y OS (p = 0,0194; la figura 3). La mediana de la SLP diferencia fue de poco más de 2 años (seis meses frente a 32 meses). Los cuatro pacientes con post-tratamiento promedio de los niveles de ctDNA ≥ 10 copias /ml son el Departamento de Defensa, mientras que el paciente con ctDNA = 5 copias /ml, que también tenían intrigante niveles muy bajos de ctDNA pre-tratamiento, es AWD. De los cinco pacientes con niveles indetectables ctDNA post-tratamiento, ninguno de ellos ha muerto de su enfermedad, tres son AWD y dos son NED. Dos de los pacientes que ya han sobrevivido más allá de 5 años. Hemos observado diferencias de supervivencia basada en los valores previos al tratamiento ctDNA
análisis de (panel izquierdo) libre de progresión de Kaplan-Meier y la supervivencia global (panel derecho) entre individuos con niveles indetectables. (CtDNA = 0; líneas azules) y ctDNA detectables (≥ 1; líneas rojas). Las diferencias significativas en la supervivencia libre de progresión (p = 0,001) y la supervivencia global (p = 0,0194) entre los grupos indetectables y detectables.
Discusión
Nos demuestran que la medida serie de ctDNA es un biomarcador de vigilancia en los cánceres ginecológicos que es tan sensible y específico como el aprobado por la FDA de biomarcadores en suero CA-125 y puede detectar la enfermedad de recaída meses antes de la TC. Por otra parte, la medición de los niveles de ctDNA en el momento de la finalización del tratamiento inicial, la cirugía de reducción de volumen y la combinación de platino /taxano doblete de quimioterapia, proporciona un nuevo predictor de diferencias en la supervivencia en los pacientes. En concreto, los niveles indetectables de ctDNA se asociaron con tanto mejora la supervivencia libre de progresión y global. En nuestra población de estudio, la diferencia en la SLP fue de poco más de dos años entre las mujeres con niveles detectables y no detectables de ctDNA. Estas diferencias, la detección temprana de la TC y la separación de las mujeres con peor y mejor supervivencia, es sorprendente ya que la base teórica para la vigilancia del cáncer es que los resultados de la detección temprana de mejores opciones terapéuticas y los resultados. Lo que se sabe actualmente es que en la actualidad, y basándose en el examen clínico, CA-125 y mediciones de imágenes, la mayoría de los pacientes con cáncer de ovario después del tratamiento inicial son diagnosticados como tener una respuesta clínica completa. A pesar de esto, más de la mitad de estas mujeres desarrollarán recurrencia de la enfermedad dentro de los 18 meses
.
CA-125 y la TC son las modalidades de vigilancia de uso más frecuente en los cánceres de ovario y endometrio. Aun así, CA-125 se considera opcional y se recomienda la TC sólo como clínicamente indicado por las directrices National Comprehensive Cancer Network (NCCN) [17]. Más del 50% de los pacientes con cáncer de ovario con niveles normales de CA125 después de la quimioterapia, sin embargo, tiene una enfermedad persistente, pero distinguir entre los pacientes únicamente en este biomarcador en este momento no es posible [18]. Para el ~ 50% de los pacientes con enfermedad persistente, el aumento de la sensibilidad y la especificidad proporcionada por un enfoque basado en la genómica podría permitir adicional sub-categorización de pacientes para ayudar a diferenciar la enfermedad y subtipos terapéuticos. CA-125 también se expresa ampliamente en otros tejidos y se eleva en procesos benignos, tales como endometriosis, leiomiomas uterinos, masas anexiales benignas, la inflamación de trompas, enfermedad hepática, insuficiencia cardíaca, la menstruación y el embarazo, lo que limita su utilidad en la vigilancia del cáncer de ovario [ ,,,0],19]. Por último, con una vida media estimada en un rango de 9-44 días [20], CA-125 no puede ofrecer una respuesta rápida a los cambios de volumen del tumor como ctDNA. Por otra parte, mientras que la TC es el método estándar en la evaluación de recurrencia de la enfermedad, en nuestra cohorte había seis casos de formación de imágenes CT negativa con detectable ctDNA en la cara de la enfermedad residual. Por otra parte, y como se señaló anteriormente, un aumento en ctDNA precedida evidencia radiológica de la recurrencia del tumor, en un promedio de 7 meses.
En un número de otros tipos de cáncer, los niveles de ctDNA han demostrado que se correlaciona más estrechamente con los cambios en el volumen del tumor de biomarcadores disponibles [8], habían sido insuficientes actualmente estudios en humanos, sin embargo longitudinales que correlacionan niveles ctDNA con la carga tumoral en tumores malignos ginecológicos. Anteriormente, nuestro grupo informó de la detección de reordenamientos genéticos, específicamente eventos de fusión, y su uso como ensayos ctDNA para controlar retroactivamente un paciente con cáncer de ovario en estadio avanzado [16]. La razón fundamental para iniciar nuestro estudio fue que a pesar de la historia de este paciente de la remisión clínica aparente basado en múltiples estudios clínicos, bioquímicos y radiológicos negativos que tenía múltiples recurrencias. Durante un período de cuatro años, la paciente fue sometida a cirugía primaria citorreducción y quimioterapia, las recidivas tumorales, y múltiples regímenes de quimioterapia. Las muestras de sangre fueron longitudinalmente recogidos y almacenados en nuestro Biobanco como parte de un programa de investigación. Considerando que los niveles de CA125 posquirúrgicas fueron elevados sólo tres veces durante 28 mediciones, la fusión específica ctDNA biomarcador era fácilmente detectable en todas estas mismas muestras de sangre y en las recurrencias tumorales. A pesar de que no se correlaciona directamente con la cantidad ctDNA carga tumoral, la fusión específico de tumor ctDNA seguía siendo detectable en los momentos de la remisión clínica aparente, lo que demuestra la capacidad de ctDNA para detectar la enfermedad oculta en el cáncer de ovario.
En este Este estudio, que ahora demuestran la capacidad de detectar con sensibilidad mutaciones puntuales mediante PCR digital con especificidades incluso más allá de 0,01% a partir de una muestra compleja. El uso de esta tubería, una vez que las sondas ctDNA específicos del paciente se han generado y validado, las pruebas de las muestras de suero se puede completar dentro de horas y se incorpora fácilmente en un programa de vigilancia (S3 Fig). Nuestro enfoque requiere conocimiento previo de alteraciones genéticas específicas de tumor en el tumor de cada paciente. En este estudio, se utilizó una combinación de WES y un panel específico en el que se orienta al 50 oncogenes frecuentemente mutados y supresores tumorales. Este enfoque combinado nos ha permitido generar sondas ctDNA el 82% de las mujeres de nuestro estudio. Como era de esperar, WES identificado mutaciones en 8/8 de las muestras tumorales. El panel de cáncer que utilizamos nos permitió interrogar 207 amplificados a través de 50 oncogenes y genes supresores de tumores en una cobertura muy alta y como resultado la identificación de mutaciones en 28/36 muestras (78%). En el futuro, el uso de paneles de secuenciación se centró específicamente en los cánceres de ovario y endometrio debe permitir la identificación de una plataforma aún más robusto y eficiente.
El objetivo de estos estudios de vigilancia de última generación es la detección de recurrencia de la enfermedad antes para que los pacientes serán candidatos quirúrgicos más óptimos, sus tratamientos de manera más eficaz y personalizado, siempre y cuando sea necesario, triaged para los ensayos terapéuticos. Por el contrario, para algunas mujeres, el uso de biomarcadores basados en ctDNA podría reducir el número de intervenciones innecesarias, como resultado menos durante el tratamiento y evitar el costo financiero y la radiación asociada con los estudios por imágenes CT. En última instancia, ahora que ctDNA se ha demostrado para detectar la enfermedad residual antes y puede distinguir entre las mujeres con peor y mejora de la supervivencia en los cánceres de ovario y endometrio, los estudios clínicos que definen la utilidad de ctDNA como una herramienta de vigilancia en los cánceres ginecológicos ahora pueden ser diseñados.
Apoyo a la Información
S1 Fig. Descripción general del análisis de tuberías ctDNA
doi:. 10.1371 /journal.pone.0145754.s001 gratis (TIF)
S2 Fig. La precisión y la reproducibilidad de ensayo ddPCR en PT208. (TP53 mutación; Chr17: 7.577.539; G & gt; A) para la detección y cuantificación ctDNA
linealidad (A) ensayo se determinó mediante el análisis de diluciones de fracciones alelo tumorales veces en serie. copias mutantes detectados por el sistema ddPCR fueron apoyados por un proyecto de I
2 de 0,99. (B) El límite inferior de detección para este ensayo fue establecido por clavar diluciones seriadas de ADN tumoral en una base de 100000 copias de genoma equivalentes a partir del ADN de la línea germinal del paciente. porcentajes de concentración de mutación fraccionarias oscilaron entre 0.025-0.002 y se analizaron por ddPCR. fracción mutación se detectó un precio tan bajo como 0,002%. (C) Replicar reproducibilidad para la detección ctDNA. La correlación de Pearson entre las réplicas individuales se calcula y se muestra (D) Acuerdo de la determinación de la fracción de alelos mutantes entre la secuencia y ddPCR (Pearson r = 0,99) (p = 4.47E-15)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0145754. S002 gratis (TIF)
S3 Fig. algoritmo de vigilancia ginecológica actual y la propuesta
doi:. 10.1371 /journal.pone.0145754.s003 gratis (TIF)
Tabla S1. mutaciones específicas del tumor candidato identificados por WES y la secuencia específica.
muestras interrogados por WES se destacan con un asterisco.