Extracto
Antecedentes
soluble guanilato ciclasa (SGC) desempeña un papel central en el óxido nítrico (NO) mediada por la transducción de señales en los sistemas cardiovascular, nervioso y gastrointestinal. RNA splicing alternativo ha surgido como un mecanismo potencial para modular la expresión y la actividad de sGC. C-α1 sGC es una forma alternativa de empalme que es resistente a la degradación de proteínas inducida por la oxidación y demuestra la distribución subcelular preferencial para el medio ambiente oxidada de retículo endoplásmico (ER).
Metodología /Principales conclusiones
aquí mostramos que el empalme de C-α1 sGC puede ser modulada por H
2O
2 en el tratamiento BE2 neuroblastoma y células humanas de adenocarcinoma de células MDA-MD-468. Además, se muestra que la H
2O
2 el tratamiento de células MDA-MD-468 disminuye selectivamente los niveles de proteína de PTBP1 y factores /B1 empalme hnRNP A2 identificados como reguladores de empalme potencial del gen α1 por
in silico El análisis
. Además, demuestran que la baja regulación de PTBP1 por H
2O
2 se produce a nivel de proteínas con regulación variable observada en diferentes células de cáncer de mama.
Conclusiones /Importancia
Nuestro datos demuestran que H
2O
2 regula empalme de ARN para inducir la expresión de la subunidad C-α1 sGC resistente a la oxidación. También informamos que H
2O
2 tratamiento altera selectivamente la expresión de los principales reguladores de empalme. Este proceso podría desempeñar un papel importante en la regulación de la adaptación celular a condiciones de estrés oxidativo
Visto:. Costa GJ, Zhu W, Thomas A, Martin E, F Murad, Sharina IG (2012) Peróxido de Hidrógeno Altera Empalme Soluble de guanililciclasa y selectivamente modula la expresión de empalme reguladores en células de cáncer humano. PLoS ONE 7 (7): e41099. doi: 10.1371 /journal.pone.0041099
Editor: Marcelo G. Bonini, Universidad de Illinois en Chicago, Estados Unidos de América
Recibido: 16 de noviembre de 2011; Aceptado: 21 de junio de 2012; Publicado: 20 Julio 2012
Derechos de Autor © 2012 Cote et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el NIH subvenciones SR1 HL088128 y 3R01HL088128 y AHA central del sur de afiliados 09GRNT2060182 subvención-en-Ayudas a la EM y los fondos de puesta en marcha departamentales a ESTÁ Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el empalme alternativo amplía la diversidad transcriptoma [1], [2] y permite que las células cumplen los requisitos de un entorno extracelular siempre cambiante. estresantes comunes tales como choque térmico, carencia de aminoácidos o la toxicidad del etanol se han demostrado para regular splicing alternativo [3], [4]. El estrés oxidativo a menudo persiste en microambiente celular cuando hay un desequilibrio en la producción y eliminación de especies reactivas de oxígeno (ROS). Este desequilibrio se asocia con una plétora de condiciones patológicas incluyendo la carcinogénesis, trastornos cardiovasculares y la neurodegeneración [5], [6], [7], [8], [9]. La evidencia reciente indica que el corte y empalme alternativo puede estar influenciada por cambios en el equilibrio oxidativo. Hipóxicas e hipoxia /reoxigenación condiciones, que alteran ROS homeostasis, se han demostrado para modificar el empalme de un número de genes en tejidos normales y líneas celulares de cáncer [10], [11], [12], [13], [14]. Por otra parte, los datos emergentes indican que las ROS también puede alterar la abundancia de factores de empalme o modificar su actividad. Las bajas concentraciones de peróxido de hidrógeno (H
2O
2), una molécula de ROS en todas partes, se han demostrado para inducir la fosforilación del factor de empalme hnRNP C que conduce a la modulación de su unión al ARN afinidad [15]. El aumento de expresión de hnRNP-C también se encuentra en hiperplasia de la íntima y la aterosclerosis, que se propone que se asocia con aumentos en H
2O
2 niveles producidos por el endotelio vascular activado [16].
ciclasa soluble ciclasa (sGC) es una enzima clave de la óxido nítrico (NO) vía de señalización y juega un papel importante en cardiovascular, neuronal y funciones gastrointestinales [17]. proteína sGC activa es un heterodímero que contiene hemo ferrosos compuesta de subunidades alfa y beta, que se activa en respuesta a la unión de NO a su resto hemo. Se propone la oxidación Heme a ser uno de los mecanismos responsables de la atenuación de NO /cGMP señalización en condiciones de estrés oxidativo [18]. El inhibidor de sGC específica 1H- [1], [2], [4] oxadiazolo [4,3, -a] quinoxalin-1-ona (ODQ) se oxida sGC hemo ferroso a la forma férrica para suprimir la unión de NO. La exposición de células y tejidos a ODQ desencadena la degradación de sGC debido a la desestabilización de sGC heterodímero a través de la ubiquitinación y la degradación proteasomal específica [18]. Hemos identificado previamente una nueva isoforma empalmados alternativamente de sGC, C-α1, que es completamente funcional a pesar de una extensa deleción en N-terminal [19]. Sorprendentemente, forma de empalme C-α1 fue significativamente más resistentes a la degradación de proteínas inducida por el tratamiento con ODQ [19] y tenía una localización celular diferente en la diferenciación de las células madre de la α1 canónica sGC [20]. Estudios recientes realizados por Kraehling et al. reveló que, a diferencia de la α1 canónica sGC isoforma, la isoforma C-α1 tiende a localizarse en el medio ambiente más oxidado del retículo endoplásmico (ER) dentro de la célula [21]. Estas observaciones nos han llevado a proponer que la expresión de la isoforma de la proteína C-α1 alternativa puede ser inducida por el estrés oxidativo como parte del mecanismo de adaptación para preservar la actividad de sGC en condiciones oxidantes.
En este estudio, hemos examinado si splicing del gen de sGC α1 puede ser modulada por ROS, en concreto, por el tratamiento con H
2O
2. Se encontró que el H
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2 induce la expresión de C-α1 transcripción y la proteína C-α1 en células de cáncer humano que expresan α1 /β1 sGC. En un esfuerzo para comprender mejor el mecanismo de regulación, se examinaron los niveles de expresión de varias proteínas de unión de ARN potencialmente implicados en el empalme de la variante de empalme C-α1. Nuestros estudios muestran que H
2O
2 de tratamiento disminuye selectivamente la expresión de α1 putativo sGC empalme reguladores PTBP1 y hnRNP A2 /B1. Por otra parte, se demuestra que la degradación H
2O
2 inducida de PTBP1 difiere en varias líneas celulares de cáncer de mama. A nuestro entender, este es un primer informe que demuestra que H
2O
2 inducida por el estrés oxidativo afecta splicing alternativo de la GCs y modula selectivamente nivel de proteínas de los principales factores de empalme.
Resultados
H
2O
2 induce la expresión de C-α1 sGC variante de empalme
para investigar si splicing alternativo de GUCY1A3 (α1 sGC gen de la subunidad) se regula en respuesta al estrés oxidativo, se trataron humana MDA468 carcinoma de mama y neuroblastoma líneas celulares humanas BE2 con 1 mM H
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2. células MDA468 y BE2 expresan endógenamente α1 y β1 sGC. El H
2O
2 concentración fue elegido sobre la base de las observaciones anteriores que demuestran que la interacción con las proteínas del suero en medios de cultivo celular, la absorción por las membranas celulares y la neutralización de los componentes enzimáticos de defensa anti-oxidativo celular consumir una porción significativa añadido de forma exógena H
2O
2 [22], [23]. células MDA468 y BE2 demostraron un aumento significativo en la expresión del transcrito alternativa C-α1 sGC en H
2O
2 de tratamiento (Fig. 1 A, B). El aumento relativo de la isoforma C-α1 en comparación con transcripción α1 fue mayor en las células BE2, de acuerdo con nuestros estudios anteriores [19]. Los resultados indicaron que GUCY1A3 empalme se altera para permitir el reconocimiento de sitio de empalme 3 'específico C-α1 en el exón 4 en respuesta a H
2O
2 exposición. A pesar de que en algunos experimentos el nivel de C-α1 se incrementó en ODQ, ni línea celular demostró cambios estadísticamente significativos en el nivel de transcripción C-α1 que sugieren que el tratamiento ODQ por sí sola no es suficiente para afectar la regulación de empalme
:. RT- la detección por PCR de α1 (arriba) y C-α1 (banda inferior) transcripciones sGC después del tratamiento con H
2O
2 (1 mM) o ODQ (20 M), tal como se indica. productos de RT-PCR se separaron en gel de agarosa al 3% y se tiñeron con bromuro de etidio. banda superior representa el mensaje que codifica la proteína α1 canónica (Transcripciones 1-4, 270 pb); banda media es un producto no específica; banda inferior indica la transcripción sGC C-α1 (Transcripción 5, 94 pb). se muestra por triplicado biológicos representativos de tres experimentos independientes. B: Razón (media ± DE) de la abundancia relativa de las transcripciones C-a1 y a1 cuantificadas por densitometría. * P & lt; 0,05 mediante la prueba t de Student. C: la detección de transferencia Western de α1 (arriba) y C-α1 (abajo) las proteínas. células MDA468 fueron tratados con mM H 1
2O
2 como se indica en presencia o ausencia de MG132 (10 M). Las transferencias que se muestran son representativos de cuatro experimentos independientes con resultados similares. D: Relación entre la abundancia relativa de las proteínas C-a1 y a1 cuantificados por densitometría. Los datos se muestran como media ± DE de cuatro experimentos independientes.
A continuación, se evaluó el curso temporal de los cambios en la abundancia de proteínas y α1 sGC C-a1 en respuesta a H
2O
2. Coincidente con aumentos en GUCY1A3 empalme se observó una modulación dependiente del tiempo de α1 y los niveles de proteína C-sGC a1. Como se muestra en la Fig. 1C y D, H
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2 aumentaron el contenido relativo de proteína C-α1 en MDA468 células. Para evaluar la contribución de la degradación del proteasoma dependiente en la regulación de las formas de empalme sGC a1, se realizó el experimento en presencia de MG132, un potente inhibidor del proteasoma de células permeable. Se encontró que el pre-tratamiento con MG132 no afectó la tasa de acumulación de variante de empalme C-α1, o el nivel de la α1 canónica sGC subunidad. Estos datos sugieren que el aumento observado en C-α1 abundancia de proteínas (Fig. 1D) es probablemente debido a una expresión C-α1 aumentada, y no a una degradación selectiva de α1 canónica sGC. Es de destacar que el tratamiento con MG132 también niveles elevados de un polipéptido desconocido reconocido por los anticuerpos anti-a1 con un peso molecular inferior a C-α1 GCs (Fig. 1D). Como queda por determinar la identidad de esta proteína, su intensidad no se incluyó en el análisis de densitometría.
Juntos, nuestros resultados sugieren que H
2O
2 induce preferencial de empalme y la expresión de C-α1 forma de empalme GCs en nuestros modelos celulares.
in silico
análisis identifica potencial a1 sGC (GUCY1A3) empalme reguladores
Para obtener la primera idea sobre los posibles mecanismos de empalme α1 sGC la regulación, se realizó un
in silico
análisis utilizando varias herramientas bioinformáticas [24]. La variante de empalme C-α1 se genera por el uso de una alternativa 3 'del sitio de empalme 179 pares de bases aguas abajo del sitio constitutiva (Fig. 2A, la Fig. S1). sitios de empalme constitutivos y alternativos para el exón 4 de α1 sGC se definieron con la herramienta de la UCSC Genoma Bioinformática y su valor relativo consenso examinadas usando humano Buscador de empalme [25], [26]. El empalme alternativo del exón 4 juega un papel central en la diversidad transcripción GUCY1A3; Además del sitio constitutivo, el exón contiene 2 sitios donantes alternativos y 2 sitios aceptores alternativos (véase la Fig. 2A y la Fig. S1). Con la excepción de la "donante constitutiva 5 del sitio de empalme, la fuerza relativo consenso de todos los sitios resultó ser baja (Fig. S1). Esta es una característica común de los exones alternativamente procesados que está pensado para facilitar la regulación de la serina-arginina ricos (SR) y las proteínas de ribonucleoproteína nuclear heterogénea (hnRNP) [2]. El, splicing alternativo /herramienta que empalma del arco iris de TEA Laboratorio Europeo de Biología Molecular [27], se utilizó para analizar el exón relevante y secuencias de intrones proximales de los posibles reguladores SR y hnRNP del exón 4 de empalme. Hemos generado una visión compuesta de los sitios de unión del regulador usando los valores derivados de las proteínas SR y hnRNP individuales (Tabla S1). Este análisis identificó una distribución relativamente uniforme de sitios de unión a lo largo de SR exón 4 y las regiones flanqueantes. Al mismo tiempo, el empalme 3 'región del sitio intrón constitutiva mostró un pico densa de sitios de unión hnRNP (Fig. 2A). Un examen más detenido identificado en esta secuencia varias superposición de sitios de unión de hnRNP 2A /B1, proteína polypyrimidine del tracto vinculante 1 (hnRNP I, PTBP1), SRp20, SRp40 y Hu antígeno R (Hur, Elavl1) reguladores de empalme (Fig. S1) . La ubicación de estos sitios sugiere que los correspondientes factores de empalme pueden afectar el uso de ambas canónico sitios de empalme y alternativa, la promoción de la generación de la transcripción de la GCs C-α1
A:. Representación esquemática de GUCY1A3 splicing alternativo de generar C-α1. Se muestra la distribución relativa de los sitios de unión SR y hnRNP predichos. B: análisis de Western de PTBP1, hnRNP2A /1B, Hur y expresión de proteínas SR en el control y H
2O
2-tratada (1 mM, 24 horas) MDA468 células. C: H
2O
2 evaluación dependiente de la dosis de PTBP1 y los niveles de proteína /B1 hnRNP A2 en las células MDA468. Las transferencias Western mostrados son representativos de al menos tres experimentos independientes con resultados similares. D, F: Densitometría análisis de los niveles de proteína /B1 PTBP1 y hnRNP A2 normalizó en β-actina. Los datos se muestran como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes.
H
2O
2 altera selectivamente la expresión de factores de empalme
Es bien sabido que la expresión los niveles y la estequiometría relativa de los factores de corte y empalme modulan splicing alternativo [28]. Por lo tanto, se investigó el efecto de H
2O
2 la exposición en los niveles de proteína de los factores de empalme identificados por nuestro
in silico
análisis como posibles reguladores sGC. Como se muestra en la Fig. 2B, la exposición de las células MDA468 a H
2O
2 se redujo selectivamente el nivel de proteínas de PTBP1 y represores /B1 empalme hnRNP A2. H
2O
2 no afectó el nivel de regulador Hur y los niveles sólo ligeramente alterados de proteína SRp40 de la familia SR de potenciadores de empalme. Tanto PTBP1 y hnRNP A2 /B1 proteínas se redujeron de una manera dependiente de la dosis en células MDA468 (Fig. 2 C, D y F). Nuestros datos indican que la observada H
2O interruptor
2-dependiente en el empalme del gen GUCY1A3 coincide con los cambios en el nivel de los factores de corte y empalme de regulación. Sin embargo, el mecanismo exacto y la contribución de los factores específicos de empalme en la regulación de la GCs empalme queda por determinar.
entendimiento en el mecanismo de H
2O
2 inducida por la degradación de proteínas PTBP1
A continuación se exploró posibles mecanismos de regulación por hnRNP H
2O
2. Elegimos a centrarse en PTBP1 ya que esta proteína de unión al ARN ampliamente estudiado juega un papel importante en varias etapas de procesamiento de ARNm celulares, incluyendo corte y empalme, la regulación de la estabilidad, la localización y la traducción [29]. Por otra parte, PTBP1 ha demostrado ser esencial en la regulación del crecimiento celular y el cáncer de células supervivencia [30], [31], [32]. La capacidad de H
2O
2 para reducir los niveles PTBP1 sugirió que, además, puede jugar un papel en la regulación de la adaptación celular a condiciones oxidantes. Sin embargo, el efecto de niveles elevados de ROS en la expresión PTBP1 nunca ha sido examinado con anterioridad.
En primer lugar, investigamos si H
2O
2 altera PTBP1 los niveles de mRNA en el estado estacionario. análisis RT-qPCR a cabo con muestras de ARN aislado de MDA468 células tratadas con diferentes H
2O
2 concentraciones encontraron cambios en los niveles de PTBP1 ARNm (Fig. 3C) que indican que PTBP1 es probable que ser controlada a nivel de proteínas. Para examinar el papel de la degradación proteasomal, que supervisó la dinámica de los cambios en la proteína PTBP1 en respuesta a H
2O
2 de tratamiento durante un período de 16 horas en presencia o ausencia de inhibidor del proteasoma MG132. Se encontró que la proteína PTBP1 se redujo de una manera dependiente del tiempo a partir de las 8 horas después de la exposición (Fig. 3 A, B). Curiosamente, la degradación de la proteína no se vio impedido, sino potenciarse mediante tratamiento MG132. Esto fue particularmente evidente en los puntos de tiempo de 16 horas y posteriores (Fig. 3A y datos no presentados). Por lo tanto, mientras que el tratamiento MG132 mostró que el proteasoma no tuvo efecto directo sobre la degradación PTBP1, el hecho de que su inhibición acelera la degradación implica un papel indirecto en la regulación, lo más probable a través de la estabilización de una proteasa o proteína cofactor desconocido. El tratamiento previo de las células MDA468 con cicloheximida (CHX, el inhibidor de
de novo la síntesis de proteínas) también no impidió PTBP1 disminución, lo que indica que H
2O
2 estaba induciendo un pre-existentes la degradación de proteína de la ruta (Fig. 3D). Se ha demostrado previamente que la apoptosis celular conduce a la degradación a través de PTBP1 Capase-3 activación [33]. Por lo tanto, hemos explorado la posibilidad de que la caspasa-3 podría desempeñar un papel en H
2O PTBP1 inducida por 2
disminuye. Sin embargo, se encontró que la adición de la caspasa-3 inhibidor IV (Ac-DMQD-CHO, Calbiochem) no impidió H
2O
2 inducida por la degradación PTBP1 (los resultados no se muestran), indicando que la caspasa-3 no está involucrado en este proceso. Para determinar si otras fuentes exógenas, además de la adición directa de H
2O solución
2, podría afectar a la estabilidad de PTB1, se aplicó la glucosa oxidasa (GO) al medio de cultivo celular. En consonancia con el papel directo de H
2O
2 en la inducción de la degradación PTBP1, la producción en estado estacionario de H
2O
2 por el tratamiento GO reproducen el efecto.
: la degradación PTBP1 se produce en forma dependiente del tiempo y no se vea impedida por MG132 inhibidor del proteasoma. células MDA468 se trataron como en Fig. 1C con 1 mM H
2O
2 en presencia o ausencia de MG132 (10 M). Se realizó análisis de transferencia de Western para visualizar la expresión de PTBP1. β-actina sirvió como control de carga. Se muestran los duplicados biológicos para cada tratamiento; Las transferencias son representativos de tres experimentos independientes con resultados similares. B: Densitometría análisis de los niveles de proteína PTBP1 normalizó en β-actina. Se muestran los promedios de los duplicados biológicos representativos de cada tratamiento. C: H
2O
2 la exposición no afecta los niveles de mRNA PTBP1. MDA468 células fueron tratadas con las concentraciones indicadas de H
2O
2 durante 24 horas. La abundancia relativa de PTBP1 mRNA en muestras se analizó por análisis de RT-qPCR. se muestran Ct media ± SD para triplicados biológicos. D: la degradación PTBP1 depende de la oxidación de tiol y no es rescatado por la inhibición de
novo
la síntesis de proteínas. El análisis de transferencia Western realizado en lisados de células MDA468 tratados durante 24 horas con inhibidor de la síntesis de proteínas cycloxemide (2 mg /ml) y diferentes factores que inducen estrés oxidativo: 1 mM BSO (GSH agotamiento inductor); mM HEDS 1 (inductor de oxidación de tiol) y 0,01 unidades /ml de glucosa oxidasa (aumenta la producción de ROS). Las transferencias Western se muestran son representativos de tres experimentos independientes con resultados similares.
H
2O
2 induce proteínas modificaciones posteriores a la traducción, tales como la oxidación de tioles intracelulares y aniones tiolato. Estas modificaciones son una parte integral de H
2O
2 de señalización que afectan a una variedad de procesos celulares [34]. Se ha demostrado anteriormente que en condiciones oxidantes PTBP1 puede formar dímeros debido a la formación de puentes disulfuro intermoleculares [35]. De hecho, en nuestros experimentos también se detectó la formación de una banda de la proteína de peso molecular reconocido por los anticuerpos PTB1 tras el tratamiento de las células MDA468 con H
2O
2 (los resultados no se muestran).
para evaluar la contribución de la oxidación de tiol a la degradación PTBP1, expusimos MDA468 células para dos compuestos diferentes que alteran el metabolismo de tiol celular. El tratamiento con disulfuro de 2-hidroxietilo (HEDS), un agente que actúa como oxidante específico de tiol, disminuyó significativamente los niveles de PTBP1 (Fig. 3D), lo que indica que la oxidación de tiol directa podría desempeñar un papel importante en la respuesta degradación PTBP1. Para realizar pruebas adicionales si la degradación PTBP1 es inducida por la disminución de la actividad tiol reductor celular en respuesta a H
2O
2, también trataron las células con L-butionina-S, R-sulfoximina (BSO). BSO es un inhibidor irreversible de la biosíntesis de glutatión, disminuyendo piscina glutatión intracelular. Se observó ninguna degradación significativa de PTBP1 en respuesta a BSO, lo que sugiere que una disminución del nivel de GSH no es suficiente para inducir PTBP1 degradación (Fig. 3D). Estos resultados también pueden estar relacionados con la capacidad intrínseca de MDA468 células para compensar la pérdida de GSH inducida por BSO, como se ha informado anteriormente para las líneas celulares con expresión SOD alta [36]. Por lo tanto, la oxidación de los tioles de Cys por H
2O
2 podría iniciar la formación de los dímeros PTBP1 y contribuir a la subsiguiente degradación de la proteína.
H
2O 2 efecto
en la proteína PTBP1 niveles varía en diferentes líneas celulares de cáncer de mama
Para determinar la generalidad de H
2O-2 inducida
degradación PTBP1, probamos líneas de cáncer de mama adicionales, incluyendo: MDA-MD-453, MDA- MD-231 y MCF7. Western blot de H
células
2 tratados con 2O demostrado diversos grados de reducción PTBP1 en las células MDA468, MCF7 y MDA231, pero ningún cambio en MDA453 células (Fig. 4A). Se observó que el hecho de no inducir la degradación PTBP1 en MDA453 células a H
2O
2 concentraciones que provocaban fácilmente disminuciones significativas en MDA468 células (comparar Fig. 4B a la Fig. 2B y C). Estos datos sugieren que el grado de H
degradación
2 inducida por el 2O de PTBP1, pensó prevalente, es todavía bastante línea celular específica. Para explorar si la resistencia a la degradación de proteínas PTBP1 se asocia con una mayor capacidad de las células para sobrevivir el estrés oxidativo, se compararon H
2O
2-citotoxicidad inducida en células MDA468 y MDA453. células MDA468 eran menos resistentes a H
2O citotoxicidad inducida por 2
(IC
50 = 450 ± 60 mM) en comparación con MDA453 células (IC
50 = 660 ± 2 M) (Fig. 5 ). En un intento de vincular directamente a una reducción en los niveles de PTBP1 a H
2 citotoxicidad inducida 2O
se realizó siRNA mediada desmontables PTBP1 en MDA453 células. A pesar de una reducción de más del 50% en PTBP1 mRNA (como se detecta por RT-qPCR), las mediciones de viabilidad celular revelaron solamente una pequeña disminución insignificante en la resistencia a H
2O
2 de tratamiento (Fig. S2). Estos datos sugieren que el nivel de expresión PTBP1 por sí sola no es de importancia crítica para apoyar la resistencia oxidativo en las células MDA435
A:. Western blot la expresión en células de examinar PTBP1 MDA231, MDA453, MDA468 y MCF7 tratados con 1 mM H
2O
2 durante 18 horas. se muestran los duplicados biológicos representativos. B: células MDA453 son resistentes a H
2O-2 inducida
PTBP1 degradación.
Panel superior
: MDA453 células fueron tratadas con diferentes concentraciones de H
2O
2 y los lisados celulares se sometieron a análisis de Western blot con anticuerpos hacia PTBP1 y β-actina. Las transferencias que se muestran son representativos de cuatro experimentos independientes con resultados similares.
Panel inferior
: análisis de densitometría de los niveles de proteína PTBP1 normalizó los niveles de beta-actina. Se muestran los promedios de los duplicados biológicos representativos de cada tratamiento.
curva de supervivencia se genera en respuesta a H
2O
2 dosis utilizando el método de exclusión tripano y se expresa como% de supervivencia a los controles no tratados . La media ± desviación estándar de tres pasajes independientes realizados por triplicado se muestran, * - p. & Lt; 0,05 mediante la prueba t de Student, en comparación con el control
Discusión
En el presente trabajo se demuestra que el estrés oxidativo inducido por H
2O
2 influencias splicing del gen α1 sGC (GUCY1A3) y selectivamente disminuye el nivel de proteína de PTBP1 y factores /B1 de empalme hnRNP A2. Hemos establecido con anterioridad que las transcripciones GUCY1A3 se someten a corte y empalme alternativo y que el C-α1 sGC empalme isoforma codifica una proteína que es resistente a la degradación inducida por ODQ [19], [37]. ODQ induce la degradación a través de la oxidación del grupo hemo prostético sGC, que desestabiliza la proteína. Un proceso similar se ha propuesto que se produzca en condiciones de estrés oxidativo y de ser responsable de disminución del nivel de proteína sGC en la inflamación vascular [23]. En este estudio se investigó si la GCs empalme puede ser modulada por ROS como un mecanismo potencial para favorecer la expresión de la forma de empalme C-α1 resistente a la oxidación.
H
2O
2 es un ROS ubicua molécula que se produce en las células por las superóxido dismutasas como un metabolito de anión superóxido (O
2-). H
2O
2 es relativamente estable y con carga neutra que le permite a las membranas celulares cruzan fácilmente. Estas propiedades han llevado a la propuesta de que H
2O
2 pueden estar implicados en el estrés oxidativo paracrina de señalización [38], [39]. Por lo tanto, hemos elegido para examinar H
2O
2 como mediador del estrés oxidativo en nuestros estudios realizados sobre el neuroblastoma humano BE2 y líneas de células de adenocarcinoma de mama MDA468. Nuestros datos demuestran por primera vez que una exposición a H
2O
2 aumenta la cantidad relativa de ARNm de C-α1 y la proteína en estas líneas celulares (Fig. 1). Este resultado establece que el empalme C-α1 puede ser modulada por el compuesto fisiológicamente relevante ROS, y sugiere que el empalme puede desempeñar un papel importante en la modulación de sGC propiedades enzimáticas en respuesta a cambios en el equilibrio oxidativo del microambiente. Un estudio adicional en apoyo de esta idea ha sido recientemente informado por Kraehling et al. [21]. En este informe se confirmó de forma independiente los descubrimientos previos de que las formas sGC C-a1 heterodímeros altamente estables y totalmente activo y con β1 sGC. Además, la diferencia en la distribución subcelular de C-a1 y a1 canónica subunidades sGC se ha demostrado utilizando marcado con fluorescencia de proteínas; la isoforma C-α1 se localiza en el entorno más oxidada del retículo endoplásmico. En conjunto, estos datos sugieren que la corte y empalme alternativo del gen GUCY1A3 podría participar en la respuesta celular adaptativa para preservar la función sGC en el estrés oxidativo. Más estudios para evaluar la importancia fisiológica de esta adaptación son necesarias.
Para hacerse una idea de los posibles mecanismos involucrados en splicing alternativo de α1 GCs, se realizó un
in silico
análisis de intrónica GUCY1A3 relevante y exonic secuencias para identificar los posibles elementos reguladores [40], [41]. La distribución del valor de referencia
cis-regulador
secuencias fueron consistentes con un modelo en el que las proteínas SR favorecerían el uso del sitio de empalme canónica, mientras que la unión de hnRNPs, específicamente PTBP1 y hnRNP A2 /B1, bloquearía el reconocimiento del exón 4 constitutiva 3 'del sitio de empalme para promover la producción isoforma C-α1 (Fig. 2A y la Fig. S1). Para poner a prueba nuestro modelo hemos examinado la expresión de factores de empalme antes y después de la exposición a H
2O
2. Si bien la regulación de empalme se logra habitualmente mediante la modulación del nivel de expresión de los factores de regulación [28], el impacto del estrés oxidativo en este proceso no se ha caracterizado previamente. Contrariamente a nuestras expectativas, los datos mostraron que H
2O
2 exposición indujo una reducción selectiva de PTBP1 y hnRNP A2 /B1, y no tenía ningún efecto sobre la expresión de la proteína Hur y SR (Fig. 2). Nuestros resultados experimentales indican una regulación más compleja de la GCs empalme que el previsto por
in silico
modelo. Se necesitan más investigaciones para explicar esta diferencia. Por otra parte, la reducción específica y dramática de dos factores clave de empalme de ARN selectiva sugirió que la baja regulación de los reguladores de empalme podría ser uno de los mecanismos que subyacen a los cambios en el corte y empalme alternativo en respuesta al estrés oxidativo.
jugadas PTBP1 un papel crucial en un número de procesos de regulación post-transcripcional, y su actividad se ha relacionado con la proliferación celular, la apoptosis, la tumorigénesis y la respuesta a la hipoxia [30], [42], [43], [44]. Por lo tanto, se optó por estudiar más a fondo el efecto de H
2O
2 de tratamiento sobre la expresión PTBP1. Nuestros resultados demostraron que H
2O
2 disminuye la expresión PTBP1 de la dosis y dependiente del tiempo de manera (Fig. 2C, F y la Fig. 3A, B). No se observó ningún cambio en PTBP1 nivel de ARNm, lo que indica que la regulación a la baja se produce post-transcripcionalmente (Fig. 3C). Por otra parte, el retraso de varias horas en respuesta a H
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2 de tratamiento sugiere un mecanismo indirecto de PTBP1 baja regulación. Esta conclusión se apoya en la observación de que inhibidor del proteasoma MG132 facilitada, y no inhibido, la disminución inducida por el H 2
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en proteínas PTBP1 (Fig. 3A, B). Debido a la degradación PTBP1 no requiere nueva síntesis de proteínas (que no fue bloqueada por el tratamiento con cicloheximida) nuestros resultados indican que H
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2 puede mejorar potencialmente la degradación proteasomal de algún factor desconocido responsable de la estabilización PTBP1. Dado que H
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2 la exposición se sabe que inducen la apoptosis [45], hemos considerado una degradación mediada por caspasa de PTBP1. Estudios previos han demostrado que es el blanco de PTBP1 Capase-3 durante la respuesta de apoptosis [33]. Sin embargo, el inhibidor de IV no pudo prevenir H
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2 mediada en los niveles de proteína PTBP1 (datos no mostrados). Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que H
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2 probablemente induce la degradación PTBP1 por una diferente de los mecanismos descritos anteriormente.
También es importante señalar que la degradación PTBP1 no se limitó a la adición directa de H
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2 solución a las células. Aplicación de la glucosa oxidasa extracelular (GO), que cataliza la conversión de glucosa en H
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2 y D-glucono-δ-lactona, también indujo una disminución significativa de la proteína PTBP1 en MDA468 células (Fig. 3D) .
La reacción de H
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2 con tioles proteicos (R-SH) y aniones tiolato (RS
-) que se conoce para generar ácidos sulfénicos modificaciones (RSOH) y promover disulfuro la formación de enlaces. Estas proteínas estaban implicados en una amplia variedad de efectos bioquímicos que median la señalización ROS [34], [46]. Curiosamente, la dimerización de moléculas PTBP1 través de la formación intermolecular puente Cys se observó anteriormente en condiciones oxidantes [35]. Exploramos la posibilidad de que la baja regulación de la proteína PTBP1 por H
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2 está mediada por la oxidación de tiol. De hecho, tiol no específica oxidante HEDS compuestos provocó una disminución significativa de los niveles de PTBP1, similar a una directa H
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2 la exposición (Fig. 3D). Por lo tanto, la dimerización a través de la oxidación de cisteína podría proteína diana PTBP1 a la degradación subsiguiente. Delineación de un mecanismo exacto responsable de la degradación selectiva inducida por ROS de este importante regulador puede ofrecer importantes conocimientos adicionales en respuesta oxidativa celular
Anteriormente, la expresión PTBP1 se ha correlacionado con el aumento de la proliferación y el potencial metastásico de las células cancerosas.;