Extracto
linteus Phellinus (PL) seta posee la propiedad antitumoral. Hemos informado anteriormente de que el tratamiento con PL causada células de cáncer de próstata humanas cultivadas a someterse a la apoptosis. Para estudiar más los mecanismos de la apoptosis mediada por PL, se realizó el ensayo de xenoinjerto, junto con
in vitro
ensayos, para evaluar el efecto de la PL en la génesis y progresión de los tumores formados a partir de la inoculación de PC3 de cáncer de próstata o células DU145. Después de la inoculación, los ratones desnudos fueron inyectados con PL cada dos días durante 12 días. Aunque el tratamiento PL no impidió la formación de los tumores inoculados, la tasa de crecimiento de los tumores después del tratamiento PL se atenuó drásticamente. A continuación, prueba el efecto de PL en los tumores de 12 días después de la inoculación. Después de tumores inoculados alcanzado un cierto tamaño, PL se administró a los ratones por inyección subcutánea. El análisis histoquímica o inmunoquímica mostró que la apoptosis se produjo con la activación de la caspasa 3 en los tumores formados mediante la inoculación de las células DU145 de cáncer de próstata o PC3. Los datos estaban en un buen acuerdo con que a partir de células cultivadas. Por lo tanto, nuestro estudio in vivo sugiere que PL no sólo es capaz de atenuar el crecimiento del tumor, sino también para causar la regresión tumoral mediante la inducción de apoptosis
Visto:. Tsuji T, Du W, Nishioka T, Chen L, D Yamamoto , Chen CY (2010) Phellinus linteus Extracto sensibiliza a las células del cáncer de próstata avanzado a la apoptosis en ratones desnudos atímicos. PLoS ONE 5 (3): e9885. doi: 10.1371 /journal.pone.0009885
Editor Syed A. Aziz, Health Canada, Canada |
Recibido: 3 de diciembre de 2009; Aceptado: 11 Febrero 2010; Publicado: 31 Marzo 2010
Derechos de Autor © 2010 Tsuji et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo con el apoyo financiero de la Fundación JCRT a CYC. Los proveedores de fondos no tiene función alguna en el estudio, la recogida de datos y análisis, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es una enfermedad devastado en los hombres. Aunque las terapias (como la cirugía o la ablación de andrógenos) han mejorado la tasa de supervivencia de los pacientes, la falta de éxito con cáncer de próstata refractario a hormonas se mantiene. Los tumores avanzados son a menudo resistente a los fármacos quimioterapéuticos. Aunque los mecanismos de la resistencia no son claros, se ha postulado que el desarrollo de tumores, como el cáncer de próstata refractario a, está relacionado con la acumulación de alteraciones genéticas o epigenéticas. En Asia, PL es uno de los hongos medicinales bien establecidos que han estado utilizando para el tratamiento de diversos tumores malignos humanos. Los estudios demostraron que la fracción soluble en agua de PL es biológicamente activo, lo que probablemente es polisacárido [1] - [3]. También se ha demostrado que la PL es capaz de suprimir tumores
in vitro
ya sea indirectamente mediante la mejora del sistema inmune del huésped, o directamente mediante la inducción de apoptosis en células tumorales [4] - [6]. Recientemente, se informó de que PL es notablemente eficaz en la inhibición del crecimiento de diversas líneas celulares de cáncer de próstata sin efectos tóxicos sobre las células epiteliales normales de la próstata [7]. Desde PL posee las propiedades anti-tumor, anti-angiogénicos e inmunomoduladores, se ha dibujado amplios intereses en Asia para desarrollarlo para la terapéutica anti-cáncer. Con el fin de desarrollar este hongo medicinal como remedio contra el cáncer de próstata, se requiere una mejor comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes de funciones PL.
A potencial de un medicamento para inducir la apoptosis se ha utilizado ampliamente como una estrategia para el desarrollo de una nueva terapia del cáncer. Se sabe que la apoptosis puede ser desencadenada por una variedad de señales internas o externas. Las caspasas, una familia altamente conservada de las proteasas de cisteína, son efectores apoptóticos clave en las células y desempeñan papeles críticos en la regulación de la apoptosis a través de una reacción de escisión de la cadena [8], [9]. Las caspasas existen como pro-enzimas en el citosol de las células y se activan a través de la proteolisis. Tras estímulos de muerte celular, la caspasa 8, como un iniciador, que desencadena la activación de caspasas efectoras aguas abajo 3 y 7, lo que resulta en la escisión BID y la liberación del citocromo c [10] - [12]. La liberación de citocromo c de la mitocondria al citosol provoca la formación de la apoptosoma, que a su vez desencadena la maquinaria apoptótica intrínseca. PL se ha demostrado que hacer que las células de cáncer de próstata a someterse a apoptosis mediante la activación de cascada de caspasas [6], [7]. Por otra parte, las dosis bajas de doxorrubicina (un medicamento contra el cáncer), junto con bajas concentraciones de PL, tienen un efecto sinérgico en la inducción de la apoptosis en células de cáncer de próstata humano [13].
Anteriormente, se han reportado que PL es capaz de sensibilizar a las células de cáncer de próstata cultivadas a la apoptosis, en el que se activan las caspasas [7]. Nuestro presente estudio, como la continuación de la investigación de la propiedad anti-tumor de PL, demostró aún más la capacidad de PL para inducir la apoptosis en los tumores mediante la inoculación de las células DU145 de cáncer de próstata o PC3 en ratones desnudos. Hemos demostrado que la inyección de PL atenúa drásticamente la génesis de los tumores en ratones desnudos después de la inoculación. Nuestro estudio también demostró que la inyección PL, los tumores formados mediante la inoculación de DU145 o las células PC3 en ratones desnudos se sometió a una regresión, mediante la activación de un procesos apoptóticos.
Métodos
Células y reactivos
Phellinus linteus
polvo se adquirió de Panbio-Tech (Taejon, Corea del Sur) y se disolvió en agua. Después se hirvió durante 5 min, la solución de PL se centrifugó y se recogió el sobrenadante para el estudio. DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco); antibióticos (penicilina y estreptomicina) y tripsina-EDTA se adquirieron de Invitrogen. células PC3 cáncer de próstata humano (American Type Culture Collection) fueron cultivadas en medio DMEM suplementado con suero de ternera fetal inactivado por calor al 10%, 2 mM L-glutamina, 100 une /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina.
se utilizaron (Taconic) en edades de 4-6 semanas:
Ensayo de xenoinjerto
Varón ratones desnudos (Ncr-Foxn1nu NCRNU-mM, CrTac). PC3 células de cáncer de próstata humana (5 x 106) en 100 l de PBS fueron inoculadas en la zona del flanco derecho de cada ratón. Tres ratones sirvieron como control positivo. Para la inhibición de la formación de tumores, 6 ratones fueron tratados con PL (30 mg /kg en 100 l de PBS) inmediatamente después de la inoculación y posteriormente administrados la misma cantidad de PL cada 2 días. Otros 3 ratones fueron tratados con la misma cantidad de control de la solución de hongos Hitachi siguiendo el mismo transcurso de tiempo que el utilizado para PL. Los tamaños de los tumores se midieron cada 4 días con un calibrador y se calculan según la fórmula de Tamayko [14]. Para el seguimiento de la regresión del tumor, después de que los tumores implantados alcanzaron aproximadamente 1,0 cm de diámetro, los ratones se trataron con PL (30 mg /kg) o la misma cantidad de la solución de control de hongos cada 2 días. Diez días más tarde, los ratones fueron sacrificados y los tumores fueron aislados para el análisis de la histopatología o histoquímica.
Histopatología o inmunohistoquímica analiza
tumores aislados se fijaron en solución de paraformaldehído neutral tamponada con fosfato-4% (pH 7.4). Las muestras histológicas fueron seccionadas y teñidas con hematoxilina /eosina (H & amp; E) (. De Santa Crutz Biotec), TUNEL o anticuerpos correspondientes
Análisis estadístico
Medios y desviaciones estándar de los resultados de. los experimentos se calcularon. Las desviaciones estándar se muestran como barras de error en las cifras. Se utilizó la prueba t de Student y un
p
valor de & lt; 0,05 fue considerado significativo
Resultados
PL atenúa las células DU145 o PC3 para formar tumores en ratones desnudos
Los estudios han sugerido que PL poseen una propiedad anti-tumor [1], [6], [7]. Hemos demostrado que PL no sólo es capaz de iniciar la apoptosis en varias líneas celulares de cáncer de próstata malignos, pero inducir G
1 detención en las células epiteliales de próstata normales [6], [7], [13]. A fin de probar el efecto antitumoral de PL, se empleó el ensayo de xenoinjertos. Después de las células PC3 de cáncer de próstata humanas inoculado en ratones desnudos por vía subcutánea, PL se inyectó simultáneamente en los ratones. Después, se inyectó la misma cantidad de PL a los ratones cada dos días. Doce días más tarde, las fotos de los ratones con tumores fueron tomadas (fig. 1A, panel superior) y las diapositivas montadas con los tejidos tumorales fueron teñidas con HE (fig. 1B, panel inferior). Los tumores en los ratones tratados PL eran mucho más pequeñas que en los ratones de control, y mostraron un patrón distinto de tinción HE.
A. DU145 o las células PC3 se inocularon por vía subcutánea en ratones desnudos. Doce días más tarde, las fotos de los ratones portadores de tumores inoculados fueron tomadas (panel superior). Los tumores fueron aislados de PL tratados o ratones de control. Las diapositivas montadas con los tejidos tumorales se prepararon y se tiñeron con HE tinte (panel inferior). B y C. Un grupo de 6 ratones fueron inyectados con PL (30 mg /kg) en agua del día 0 y, posteriormente, administrada cada 2 días. Otro grupo de 3 era como los controles. Una semana más tarde, cuando el tumor inoculado comenzó a formarse, los tamaños de los tumores se midieron cada 4 días.
También midieron los diámetros de los tumores inoculados, una semana más tarde después de la inoculación, cuando todo el ratones comenzó a mostrar la señal de la formación de masas de tumor sólido. Las mediciones se tomaron cada cuatro días durante 12 días (Fig. 1B y C). En el día 12, los líos tumorales de control de la inoculación de dos líneas celulares fueron aproximadamente más de 2 pliegues más grandes que los tratados por PL. Para excluir la posibilidad de toxicidad mostrada por PL, el peso (Fig. 2A) y el consumo de agua (Fig. 2B) de los ratones fueron medidos y comparados. Los ratones tratados-PL tenía un peso o el consumo de agua similar al de los controles, lo que sugiere que PL no tenía un efecto secundario en los ratones tratados o no tratados. A fin de determinar si el tratamiento PL tenía ningún efecto tóxico en los ratones, los hígados también se aislaron a partir de los animales. La tinción histoquímica con HE colorante mostró que las estructuras de hígado de ratones tratados con PL fueron similares como la aislada de los ratones de control (datos no mostrados). Ambos hígados parecían sanos sin ninguna evidencia de degeneración, fibrosis, apoptosis o necrosis. El estudio in vivo sugiere que PL es capaz de atenuar la velocidad del crecimiento de los tumores inoculados en ratones desnudos.
A y B. Después se formaron los nódulos tumorales, el peso corporal (A) y el consumo de agua (B) de cada ratón con o sin tratado con PL se midieron. Las barras de error representan la desviación estándar del 3-6 de los ratones.
PL tratamiento provoca la regresión del crecimiento en los tumores inoculados por las células de cáncer de próstata
A continuación, probamos el efecto de PL en el tumores existentes. Cuando los tumores inoculados alcanzados con el tamaño de 1.0 cm de diámetro, PL se inyectaron en los ratones cada dos días para un total de diez días. Los tumores fueron aislados y se prepararon para el análisis histopatológico o immunohistochemitry. La tinción reveló que los tumores aislados de PL- o el ratón de control fueron bien circunscrita con tejidos conectivos (Fig. 3A). La muerte celular parece ocurrir en los tumores tratados con PL de la inoculación de dos líneas celulares de cáncer de próstata diferentes con muchas vacuolas no teñidas, que estaba ausente en los tumores de control. A fin de determinar si la apoptosis se produce en los tumores tratados con PL, se realizó un análisis de inmunohistoquímica utilizando tinción TNUEL (para detectar roturas de la cadena de ADN) (Fig. 3B). Las diapositivas de los tumores tratados-PL estaban fuertemente teñidas con la tinción de TUNEL, pero sólo unos pocos TUNEL tinción de células positivas se detectaron en los tumores de control. Los porcentajes de la TUNEL células teñidas positivamente se midió en el control y tumores PL-tratados (datos no mostrados). Más de 30% de las células en el tumor tratado con PL había roto cadena de ADN y muy pequeño porcentaje de las células de los tumores de control (aproximadamente 5%) teñidas positivamente. La tinción inmunohistoquímica utilizando el anticuerpo anti-caspasa 3 también se realizó para detectar la expresión de la caspasa 3 (Fig. 3C). Un gran número de las células de tumor tratado con PL formado por la inoculación de células PC3 se hicieron reaccionar con el anticuerpo. En comparación, sólo unas pocas células en el tumor de control expresaron un alto nivel de la caspasa 3. Resultados similares se obtuvieron a partir de los tumores formados por la inoculación de células DU145 (datos no mostrados). Por lo tanto, los resultados indican que la muerte celular se produjo en el tumor tratado con PL es a través de la apoptosis.
A. Los tumores se prepararon para tinción con hematoxilina y eosina. B y C. Las diapositivas montadas con los tejidos tumorales se tiñeron con el agente de TUNEL (B) o anti-caspasa 3 de anticuerpos (C).
A fin de probar la capacidad de PL para inducir la apoptosis, DU145 y células PC3 se trataron con PL a 1 mg /ml o 2 mg /ml durante 48 h. análisis de Anexina V se llevaron a cabo (Fig. 4). Después de ser tratado con PL, sobre 15% de las células tratadas con PL sufrió apoptosis, en una manera dependiente de la dosis. Una tinción de línea de base de Anexina V se observó en los tumores de control. Curiosamente, las células PC3 eran más sensibles a PL que las células DU145. En general, la
in vitro
datos es consistente con la obtenida a partir de los experimentos con animales.
Las células fueron tratadas con 1 mg /ml o 2 mg /ml durante 48 h, y posteriormente se tiñeron con las barras de error anexina V. representan la desviación estándar de 3 experimentos independientes.
Discusión
Anteriormente, hemos demostrado que induce PL células cancerosas de próstata cultivadas a someterse a la apoptosis [7], [13 ]. Aquí, usando el ensayo de xenoinjerto, mostramos que PL es capaz de provocar una respuesta apoptótica
in vivo
para bloquear el crecimiento de los tumores formados por la inoculación de cáncer de próstata humano DU145 o las células PC3. El análisis de tinción histoquímica puso de manifiesto que la mayoría de las células en los tumores aisladas a partir de ratones tratados con PL son apoptóticas, que se manifiesta por manchado positivamente con TUNEL y se hace reaccionar con un anticuerpo anti-caspasa 3. La aparición de apoptosis también se demostró en células DU145 o PC3 cultivadas después del tratamiento con PL para 48 de una manera dependiente de la dosis. Por lo tanto, nuestro estudio, el uso de
in vivo, así
in vitro
ensayos, inidcates que el tratamiento PL inicia cascada de caspasas para inducir la apoptosis en células de cáncer de próstata, que proporcionan una fuerte evidencia de la posibilidad de PL como un remedio contra el cáncer de próstata.
se sabe que PL no es tóxico en general [1]. Anteriormente, se informó de que PL, en altas dosis, induce a las células epiteliales de control del pulmón para detener en el G
1 fase del ciclo celular mediante el bloqueo de la expresión de la ciclina D
1 y su interacción con las quinasas del ciclo celular dependiente 4 y 6 [6]. En nuestro estudio actual, los datos de análisis histopatológico demostrar que la inyección de PL en ratones desnudos inoculados con células de cáncer de DU145 o de próstata PC3 no tiene ningún efecto tóxico sobre los ratones, que se manifiesta por que el tratamiento no juega ningún papel en el consumo de crecimiento o de agua de los ratones. Es importante destacar que las muestras de hígado de los ratones tratados son normales sin degeneración o fibrosis. Es posible que, al igual que
in vitro
experimentos, el tratamiento con PL provoca puesto de control controla celular en los tejidos u órganos normales, que no es perjudicial para los ratones. En los tumores inoculados, el mismo tratamiento parece ser mucho citotóxica.
La muerte celular programada es un importante mecanismo para la exclusión de células anormales o cancerosas. La activación de los miembros de la familia de caspasas está en el centro de la apoptosis, lo que representa un punto de intersección de las diversas vías de apoptosis en varios tipos de células cancerosas, incluyendo células de cáncer de próstata. receptores de TNF o Fas /CD95, proteínas mitocondriales (tales como el citocromo c) y granzima son capaces de inducir la muerte celular a través de la activación de la cascada de caspasas [8], [9]. El daño a o estrés en el RE o Golgi ha demostrado ser capaz de desencadenar la apoptosis [15], [16]. Los estudios han demostrado que la respuesta de la proteína desplegada o falta de calcio es responsable de ER-mediada por apoptosis [15]. estrés ER se ha demostrado que causa la translocación de ciertas caspasas a la ER o Golgi y la ejecución de la apoptosis allí. El calcio liberado del ER en tiempos de deficiencia de ATP es un elemento importante en la apoptosis inducida por la lesión por isquemia-reperfusión. Hemos demostrado que el tratamiento PL desencadena la activación de caspasas en células de cáncer de próstata cultivadas [7], [13]. Nuestra
in vivo
estudio indica que el tratamiento PL también es capaz de iniciar la apoptosis a través de la activación de la caspasa 3 que son el efector en reacción en cadena de la caspasa. La investigación de si otras caspasas están implicadas en la inducción de la apoptosis
in vivo
está en marcha.
PL es uno de los hongos medicinales bien establecidos que se han tomado por vía oral como la salud común la promoción de suplemento dietético o un adyuvante para el tratamiento de tumores malignos en Asia desde hace muchas décadas. La extracción de la fracción PL soluble en agua muestra una distribución de peso molecular relativamente homogéneo en HPLC de permeación en gel y se estima en alrededor de 150 a 180 kD desde el tiempo de retención en HPLC de marcadores moleculares pululano [1]. Los principales componentes de PL se han sugerido para ser diversos polisacáridos [1] - [3]. También se ha demostrado que la fracción soluble en agua de PL es capaz de suprimir tumores o bien indirectamente mediante la mejora del sistema inmune del huésped, o directamente mediante la inducción de apoptosis en células tumorales [4], [5]. Sin embargo, todavía no está claro cuales composiciones de polisacárido en PL poseen el efecto anti-cáncer.
En resumen, el uso exitoso de PL para tratar el cáncer de próstata requiere la plena comprensión de los mecanismos de cómo PL media anti- actividades de tumor en los tumores. Nuestro estudio anterior demostró que la PL, a través de la activación de las caspasas, es capaz de inducir apoptosis en células de cáncer cultivadas. En la presente investigación, utilizando un ensayo de xenoinjerto, Además, demuestran que la inyección de PL en ratones desnudos con tumores subcutáneos formados por inoculado con cáncer de próstata DU145 o las células PC3 induce mayoría de las células tumorales inoculadas a perder sus viabilidades. Por lo tanto, nuestro
in vivo
datos apoyan la noción de que el PL, mediante el encendido de una maquinaria relacionada con la supresión tumoral, puede ser desarrollado como una terapia eficaz para el tratamiento de tumores malignos humanos, como el cáncer de próstata refractario.
Reconocimientos
agradecemos al Dr. Hu (Escuela de Medicina de Harvard, MA) para proporcionar reactivos para el proyecto.