Extracto
Photoimmunotherapy (PIT) es un nuevo tratamiento contra el cáncer que combina la especificidad de los anticuerpos para combatir tumores con la toxicidad inducida por los fotosensibilizadores tras la exposición a infrarrojo cercano (NIR) la luz. Se realizó PIT en un modelo de carcinomatosis peritoneal cáncer gástrico difusión y el control de eficacia con
in vivo
imágenes de fluorescencia de GFP en.
in vitro
y
in vivo
experimentos se llevaron a cabo con un,, línea de HER2 que expresan GFP-expresión de células de cáncer gástrico (N87-GFP). Un conjugado formado de un fotosensibilizador, IR-700, conjugado con trastuzumab (tra-IR700), seguido por la luz NIR se utiliza para la PIT.
In vitro
PIT se evaluó mediante la medición de la citotoxicidad con tinción muerto y una disminución en la fluorescencia de GFP.
In vivo
PIT se evaluó en un modelo de carcinomatosis peritoneal diseminada y un xenotrasplante flanco usando mediciones del volumen del tumor y la intensidad de fluorescencia de GFP.
In vivo
efectos antitumorales del PIT fueron confirmados por reducciones significativas en el volumen del tumor (en el día 15, p & lt; 0,0001 frente al control) y la intensidad de fluorescencia de GFP (modelo flanco: en el día 3, PIT tratados vs. control de p & lt; 0,01 y el modelo diseminada peritoneal: al día 3 PIT tratados frente a control, p & lt; 0,05). Los efectos citotóxicos
in vitro
mostraron ser dependiente de la dosis de luz y provocó la ruptura celular necrótica que conduce a la liberación de GFP y una disminución en la intensidad de fluorescencia
in vitro.
Por lo tanto, la pérdida de la fluorescencia de GFP sirve como un biomarcador útil de la necrosis celular después de la PIT
Visto:. Sato K, Choyke PL, H Kobayashi (2014) Photoimmunotherapy de cáncer gástrico carcinomatosis peritoneal en un modelo de ratón. PLoS ONE 9 (11): e113276. doi: 10.1371 /journal.pone.0113276
Editor: Irina Lebedeva V., Universidad de Columbia, Estados Unidos de América
Recibido: 2 Julio, 2014; Aceptado: 21 Octubre 2014; Publicado: 17 Noviembre 2014
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Disponibilidad de datos:. Los autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el programa NIH intramural y JSP beca de investigación. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El carcinoma gástrico causa más de 740.000 muertes relacionadas con el cáncer en todo el mundo por año, especialmente en Asia [1] - [3]. La mayoría de los pacientes con cáncer gástrico se presentan con enfermedad metastásica localmente avanzado, recurrente o que impiden la cirugía curativa que es administrado principalmente por el tratamiento no curativo [1]. carcinomatosis peritoneal y metástasis de hígado son manifestaciones que amenazan la vida comunes de cáncer gástrico en la etapa avanzada [1], [4]. carcinomatosis peritoneal también se produce en los ovarios, apendicular, colon, páncreas y cáncer gástrico. El pronóstico es universalmente pobres y los tratamientos locales son, invariablemente, sin éxito con altas tasas de recurrencia y morbilidad asociadas con ascitis y obstrucción intestinal. La terapia sistémica también es por lo general sin éxito. Por lo tanto, se necesitan nuevos métodos de tratamiento de la carcinomatosis peritoneal.
Photoimmunotherapy (PIT) es un tratamiento específico del cáncer de nueva célula diana que emplea un conjugado anticuerpo fotosensibilizador (APSC), seguido de infrarrojo cercano (NIR) exposición a la luz. Un APSC consta de un anticuerpo específico de cáncer de células monoclonal (mAb) y un fotosensibilizador, IR700, que es un derivado de sílice-ftalocianina conjugado covalentemente al anticuerpo. El APSC se une moléculas diana en la membrana celular y luego se provoca necrosis celular casi inmediata después de la exposición a la luz NIR a 690 nm.
In vitro
estudios han demostrado PIT ser altamente específico de células, por lo tanto, las células que no expresan inmediatamente adyacentes a las células diana no muestran efectos tóxicos [5]. Las células tratadas con PIT se someten a expansión de volumen rápida conduce a la ruptura de la membrana celular, la extrusión del contenido celular en el espacio extracelular, y necrosis irreversible [6] - [8]. Nuestros resultados y otros demuestran que la citotoxicidad inducida por PIT no totalmente dependen de las especies reactivas del oxígeno o la existencia de oxígeno singlete inactivadores [9]. Además, la citotoxicidad inducida por PIT es principalmente dentro de la membrana celular en lugar dentro de las mitocondrias como ocurre con PDT.
Si bien PIT resulta en una rápida necrosis celular, el volumen total del tumor no puede cambiar durante varios días. Esto se debe a que se necesita por lo menos varios días para los macrófagos para entrar, proceso y dejan el tumor tratado. Por lo tanto, los nuevos métodos, más allá de las mediciones de tamaño, son necesarios para controlar los efectos de PIT. proteínas de fluorescencia (FPS) se utilizan comúnmente para la visualización de procesos celulares [10], [11]. Mientras que la mayoría de los resultados de muerte celular por apoptosis en la preservación de la membrana celular y la retención de la FP haciendo fluorescencia insensibles a la muerte celular [12], [13], en el PIT, la ruptura repentina de las membranas celulares resultados en la extrusión de citoplasmática fps y, por lo tanto, una relativamente rápida lectura de la muerte celular. Una ventaja de FPS para
in vivo
formación de imágenes es que no se requieren inyecciones extrínsecos de agentes (tales como luciferina, en el caso de la bioluminiscencia) y se pueden monitorizar en tiempo real [14] - [18]. Ya que requieren la transfección de genes, que es probable que sólo serían útiles en estudios preclínicos.
En este estudio, hemos examinado la eficacia de PIT en un modelo de ratón de cáncer gástrico peritoneal diseminada in vivo utilizando GFP fluorescencia de imágenes para monitorizar la respuesta.
Materiales y Métodos
Reactivos
, derivado de silicio-ftalocianina, éster de NHS IRDye 700DX soluble en agua y 800 CW éster NHS IRDye se obtuvieron de LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, EE.UU.). Panitumumab, una IgG completamente humanizado
2 mAb dirigido contra EGFR, se adquirió de Amgen (Thousand Oaks, CA, EE.UU.). Trastuzumab, el 95% de IgG humanizado
1 mAb dirigido contra HER2, se adquirió de Genentech (South San Francisco, CA, EE.UU.). Todos los demás productos químicos fueron de grado reactivo.
Síntesis de trastuzumab IR700-conjugado o panitumumab y IR800 conjugado con trastuzumab
La conjugación de los tintes con mAbs se llevó a cabo de acuerdo con un informe anterior [19]. En breve, panitumumab o trastuzumab (1 mg, 6,8 nmol) se incubó con éster IR700 NHS (60,2 mg, 30,8 nmol) o éster CW NHS IRDye 800 (35,9 mg, 30,8 nmol) en 0,1 mol /L Na
2HPO
4 (pH 8,6) a temperatura ambiente durante 1 hr. La mezcla se purificó con una columna Sephadex G50 (PD-10; GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE.UU.). La concentración de proteína se determinó con el kit de ensayo de proteínas Coomassie Plus (Thermo Fisher Scientific Inc, Rockford, IL, EE.UU.) mediante la medición de la absorción a 595 nm con la espectroscopia (8453 valor del sistema; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU.). La concentración de IR700 o IR800 se midió, respectivamente, por absorción a 689 nm o 774 nm con espectroscopia de confirmar el número de moléculas de fluoróforo conjugados con cada mAb. La síntesis se controla de manera que un promedio de cuatro moléculas IR700 y dos moléculas IR800 se une a un único anticuerpo. Se realizó SDS-PAGE como un control de calidad para cada conjugado como se informó anteriormente [19]. Abreviamos IR700 conjugado con trastuzumab como tra-IR700, al panitumumab como pan-IR700 y IR800 conjugarse con trastuzumab como tra-IR800.
Cultivo de células
N87-GFP células que expresan establemente GFP fueron adquiridos de lucha contra el cáncer (San Diego, CA, EE.UU.). La expresión de alto GFP se confirmó en ausencia de un agente de selección con 10 pasajes. Para evaluar la muerte celular específica por PIT, se utilizaron células 3T3 que expresan de forma estable DsRed (3T3 /DsRed) como control negativo [5]. Las células fueron cultivadas en medio RPMI 1640 (Life Technologies, Gaithersburg, MD, EE.UU.) suplementado con 10% de suero fetal bovino y 1% de penicilina /estreptomicina (Life Technologies) en matraces de cultivo de tejidos en un incubador humidificado a 37 ° C en una atmósfera de 95 % de aire y 5% de dióxido de carbono
la microscopia de fluorescencia
Para detectar la localización específica del antígeno de conjugados IR700 y el cambio en la morfología celular después de la PIT, microscopía de fluorescencia se realizó (o IX61 IX81.; Olympus America, Melville, NY, EE.UU.). Diez mil células fueron sembradas en placas de fondo cubierta de vidrio-y se incubaron durante 24 horas. a continuación, Tra-IR700 se añadió al medio de cultivo (sin rojo fenol) a 10 mg /ml y se incubó a 37 ° C durante 6 horas. Después, las células se lavaron con PBS; se añadió yoduro de propidio (PI) (1:2000) o Cytox azul (1:500) (Life Technologies) a los medios de comunicación 30 min antes de PIT para detectar las células muertas. Las células fueron entonces expuestos a la luz NIR y se obtuvieron imágenes en serie. Un día después de PIT, las células se lavaron y se incubaron con medio nuevo después de PIT (0,5 J /cm
2) y se añadió de nuevo PI. Para asegurarse de que la misma región fue fotografiada marcas fueron hechas en cada placa de cultivo para indicar dónde se adquirió la imagen. El filtro se ajusta para detectar la fluorescencia IR700 con un filtro de excitación 590 a 650 nm, y una banda de 665 a 740 nm filtro de paso de emisiones. El análisis de las imágenes se realizó con el software ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/).
Citometría de Flujo
fluorescencia de las células después de la incubación con pan-IR700 o tra-IR700 se midió utilizando un citómetro de flujo (FACS Calibur, BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.) y el software CellQuest (BD Biosciences). Las células (1 × 10
5) se incubaron con cada conjugado durante 6 horas a 37 ° C. Para validar la unión del anticuerpo conjugado específico, se utilizó el anticuerpo en exceso (50 g) para bloquear 0,5 g de los conjugados de tinte-anticuerpo [8].
in vitro PIT
Cien mil células fueron sembradas en placas de 24 pocillos y se incubaron durante 24 hr. Los medios de cultivo se reemplazó con medio de cultivo fresco que contiene 10 mg /ml de TRA-IR700 y las células se incubaron durante 6 horas a 37 ° C. Después de lavar con PBS, se añadió medio de cultivo libre de rojo de fenol. Luego, las células fueron irradiadas con luz láser NIR en el 685 de 695 a la longitud de onda nm (BWF5-690-8-600-0.37; B & amp;. W TEK Inc., Newark, DE, EE.UU.). La densidad de potencia real de mW /cm
2 se midió con un medidor de potencia óptica (PM 100, Thorlabs, Newton, Nueva Jersey, EE.UU.).
Ensayo de citotoxicidad
Los efectos citotóxicos de PIT con tra-IR700 se determinó por tinción con PI de citometría de flujo, que detecta las membranas celulares comprometidas. Para el ensayo de citometría de flujo, las células se tripsinizaron 1 hr después del tratamiento y se lavaron con PBS. PI se añadió en la suspensión de células (final 2 mg /ml) y se incubó a temperatura ambiente durante 30 min, seguido por citometría de flujo.
Estimación de la intensidad de la fluorescencia de GFP in vitro
Cien mil las células se sembraron en placas de fondo cubierta de vidrio y se incubaron durante 12 hr. a continuación, Tra-IR700 se añadió al medio de cultivo (sin rojo fenol) a 10 mg /ml y se incubó a 37 ° C durante 6 horas. Las células se lavaron con PBS y se sustituye con un nuevo medio de cultivo libre de rojo de fenol y el lado inferior de la cubierta de vidrio fue marcada (para determinar la posición de observación). Después de PIT, se incubaron de nuevo las células durante 1 día. Un día después de PIT, se volvieron a observar las células. La intensidad de GFP fue evaluada con píxeles totales con el mismo umbral en el mismo campo [20]. El análisis de las imágenes se realizó con el software ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/).
fluorescencia de las células tratadas también se midió usando un citómetro de flujo (FACS Calibur).
animales y tumores
Todo
in vivo
procedimientos se llevaron a cabo en cumplimiento de la Guía para el Cuidado y uso de los Recursos animales de laboratorio (1996), Consejo Nacional de Investigación de Estados Unidos, y aprobado por el Comité de Cuidado y uso de Animales de los NIH. De seis a homocigotos ratones hembra desnudos atímicos de ocho semanas de edad fueron comprados de Charles River (NCI-Frederick). Con el fin de evaluar solamente la célula tumoral directa matando a efecto de
in vivo
PIT, se utilizaron ratones desnudos inmunodeficientes. Durante los procedimientos, los ratones se anestesiaron con isoflurano. Diez millones de células N87-GFP se inyectaron por vía subcutánea en el dorso derecho de los ratones. Con el fin de determinar el volumen del tumor, el mayor diámetro longitudinal (longitud) y el mayor diámetro transversal (anchura) se midieron con un calibrador externo. Los volúmenes tumorales basados en mediciones de calibre se calcularon por la siguiente fórmula; el volumen del tumor = longitud x anchura
2 × 0,5. Los tumores alcanzan aproximadamente 100 mm
3 en volumen fueron seleccionados para el estudio. Para medir la fluorescencia de GFP después de PIT, diez millones de células N87-GFP se inyectaron por vía subcutánea en ambos dorsi de los ratones. Para el modelo de ratón de cáncer peritoneal diseminada, se inyectaron cincuenta millones de células N87-GFP con PBS (en total 300 l) en la cavidad peritoneal.
fluorescencia in vivo de imágenes
In vivo
imágenes de fluorescencia se obtuvieron con una perla Imager (LI-COR Bioscience) para detectar IR700 /fluorescencia IR800 y un Imager Maestro (CRI, Woburn, MA, EE.UU.) para GFP. Para GFP, se utiliza un filtro de paso de banda 445-490 nm (excitación) y un azul filtro de paso largo sobre 515 nm (emisión). El filtro de emisión sintonizable se intensificó de forma automática en incrementos de 10 nm 500 a 600ºC nm para los conjuntos de filtros verdes en la exposición constante (500 ms). Las imágenes de fluorescencia espectrales consisten en espectros de autofluorescencia y los espectros de GFP (tumor N87-GFP), que fueron entonces sin mezclar, basado en el patrón espectral característica de la GFP, utilizando software Maestro (CRI). Las regiones de interés (ROI) se extrajeron de forma manual, ya sea en el tumor en el flanco o sobre la región abdominal, según corresponda a la intensidad de modelo y de fluorescencia se midió [19].
Caracterización del modelo de ratón peritoneal diseminada
ratones con cáncer peritoneal ya sea diseminada (a las 6 semanas después de la implantación de células) o tumores en los flancos (a los 7 días después de la implantación de células) se inyectaron por vía intravenosa con 100 g de TRA-IR700 y tra-IR800. Un día después de la inyección, imágenes seriadas se realizaron con una perla de imágenes para detectar IR700 /fluorescencia IR800, y el Maestro para GFP. Las imágenes de luz blanca de los ratones se obtuvieron con un iPhone5 (Apple Inc., Cupertino, CA, EE.UU.).
En vivo PIT
Con el fin de evaluar el efecto de PIT en el modelo de flanco , los ratones portadores de tumores N87-GFP se asignaron al azar en 4 grupos de al menos 10 animales por grupo como sigue: (1) ningún tratamiento (control); (2) sólo exposición a la luz NIR a 50 J /cm
2 el día 1 y 100 J /cm
2 el día 2; (3) 100 g de TRA-IR700 i.v., sin exposición a la luz NIR; (4) 100 g de TRA-IR700 i.v., la luz NIR se administró a 50 J /cm
2 el día 1 después de la inyección y 100 J /cm
2 el día 2 después de la inyección. Estas condiciones se aplican a la semana durante un máximo de 3 semanas. Los ratones se controlaron diariamente, y se obtuvieron imágenes de fluorescencia empezando 1 día antes de PIT, y volúmenes de los tumores se midieron tres veces a la semana hasta que el diámetro del tumor alcanzó 2 cm, después de lo cual los ratones se sacrificaron con dióxido de carbono. Para imágenes de fluorescencia, los ratones fueron inyectados con 100 g de TRA-IR700 o irradiadas como sigue: (1) la luz NIR se administró a 50 J /cm
2 en el día 1 después de la inyección y 100 J /cm
2 en los días 2 al tumor derecha (2) no hay luz NIR fue administrada al tumor izquierda que sirvió como control. Los controles incluyeron (1) única exposición a la luz NIR a 50 J /cm
2 el día 1 y 100 J /cm
2 el día 2 al tumor derecha; (2) ningún tratamiento para el tumor izquierda
Para evaluar el cáncer peritoneal diseminada, los ratones fueron distribuidos aleatoriamente en 4 grupos de 5 animales por grupo para los siguientes tratamientos:. (1) sin tratamiento (control); (2) sólo exposición a la luz NIR a 50 J /cm
2 el día 1 y 100 J /cm
2 el día 2; (3) 100 g de TRA-IR700 i.v., sin exposición a la luz NIR; (4) 100 g de TRA-IR700 iv, luz NIR se administró a 50 J /cm
2 el día 1 y 100 J /cm
2 el día 2 después de la inyección.
Análisis Estadístico
Los datos se expresan como medias ± SEM desde un mínimo de cuatro experimentos, a menos que se indique lo contrario. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo utilizando un programa estadístico (GraphPad Prism, GraphPad Software, La Jolla, CA, EE.UU.). Para comparaciones múltiples, se utilizó un análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) con post-test (prueba de Kruskal-Wallis con el post-test) y la prueba de Tukey. La probabilidad acumulada de supervivencia, aquí se determina como el diámetro del tumor no llegar a 2 cm, se estimó en cada grupo con el uso del análisis de la curva de supervivencia de Kaplan-Meier, y los resultados se compararon con la prueba de log-rank y la prueba de Wilcoxon. Estudiante de
t
también se utilizó la prueba para comparar los dos
in vitro
estudio; p & lt; 0,05 fue considerado para indicar una diferencia estadísticamente significativa
Resultados
Confirmación del perfil de expresión de células N87-GFP como un objetivo para PIT
Se examinaron las señales de fluorescencia. de pan-IR700 y IR700-tra unido a las células N87-GFP mediante FACS. Después de 6 horas de incubación, ya sea con pan-IR700 o tra-IR700, células N87-GFP mostraron consistentemente mayor brillo con tra-IR700 de pan-IR700 (Fig. 1A). Estas señales fueron casi completamente bloqueado por la adición de exceso de trastuzumab o panitumumab, lo que sugiere la unión específica y confirmando la mayor expresión de HER2 de EGFR [21]. Estos datos sugirieron que HER2 era el objetivo preferible para PIT en células N87-GFP debido a su mayor expresión.
(A) Expresión de HER1 y HER2 en las células N87-GFP se examinó con FACS. HER2 se sobreexpresa más de HER1. La unión específica se demuestra por el bloqueo de anticuerpos. (B) las células N87-GFP se incubaron con tra-IR700 durante 6 horas y se observaron por microscopía (antes y después de la irradiación de la luz NIR; 2 J /cm
2). Se observó la muerte celular por necrosis tras la excitación con luz NIR (después de 30 minutos). Bar = 25 micras. PI tinción mostró el daño de la membrana. (N = 4, * p & lt; 0,001, frente al control no tratado, prueba de la t de Student) daño (C) de la membrana inducida por PIT se midió con el recuento de células muertas mediante la tinción de PI, que aumentó de una manera dependiente de la dosis de luz. (D) células N87-GFP se incubaron con tra-IR700 durante 6 horas y se irradiaron con luz NIR (0,5 J /cm
2). la intensidad de fluorescencia de GFP-disminuida en las células muertas, pero se mantuvo sin cambios en las células vivas en 1 día después de PIT (*). Bar = 200 micras. La línea de negro en la esquina superior derecha fue el marcador para determinar la posición de observación. (E) Intensidad disminución GFP-fluorescencia a 1 día después de PIT se produjo de una manera dependiente de la dosis de luz (pixel total de la fluorescencia de GFP en la misma) (n = 12 campos) (** P & lt; 0,0001, frente al control sin tratar, prueba de la t de Student). la intensidad de fluorescencia (F) en disminución GFP inducida por PIT, medida mediante FACS, confirma una dependencia de la dosis-NIR luz. (N = 4, *** P & lt; 0,0001, frente al control no tratado, prueba de la t de Student)
Microscopía de vitro PIT
Serie microscopía de fluorescencia en las células N87-GFP. se llevó a cabo antes y después de la PIT. Después de la exposición a la luz NIR (cm
2 2 J /) hinchazón celular, la formación de la ampolla y la ruptura del lisosoma se observó, lo que resulta en la extrusión de citoplasma extracelularmente (Fig. 1B). tinción PI mostró daño de la membrana citotóxica aguda causada por PIT. La mayoría de estos cambios celulares se observaron a los 30 minutos de exposición a la luz (Apoyo de vídeo Información de S1 y S2). No se detectaron cambios significativos en EGFR-negativos células 3T3 irradiados con luz NIR, lo que sugiere PIT induce ningún daño en las células no objetivo (Fig. S1).
Evaluación del efecto in vitro PIT
con el fin de cuantificar el efecto de
in vitro
PIT, se realizó un ensayo de citotoxicidad basado en la incorporación de PI, lo que demuestra que la muerte celular aumentó con el aumento de la dosis de luz (Fig. 1C). Sin citotoxicidad significativa se detectó con exposición a la luz NIR o tra-IR700 solo.
Evaluación con la fluorescencia de GFP in vitro después de PIT
Un día después de la exposición a la luz NIR de 0,5 J /cm
2, aproximadamente el 50% de las células mostraron citotoxicidad aguda (Fig. 1C), y la intensidad de fluorescencia de GFP se redujo en gran medida en las células muertas (teñidas con PI positivo), mientras que la fluorescencia de GFP se conserva en las células supervivientes (Fig. 1D). Estos estudios sugieren que GFP se extruye a partir de la célula después de la rotura de la membrana. Con el fin de investigar el cambio en la fluorescencia GFP, se compararon los píxeles totales de GFP en el mismo campo antes y un día después de PIT (Fig. S2). La relación de la fluorescencia de GFP se redujo directamente con la dosis de luz, mientras que no se detectó con disminución de exposición a la luz NIR o tra-IR700 sola (Fig. 1E). Estos resultados fueron confirmados por análisis FACS (Fig. 1F y Fig. S3) y sugieren que PIT conduce a una disminución de la fluorescencia de GFP después de la muerte celular necrótica en 1 día después de PIT de una manera dependiente de la dosis de luz.
en vivo PIT reduce el volumen del tumor en el modelo de xenoinjerto flanco
a continuación, se examinó el efecto del PIT
in vivo
de tumor en el flanco ratones portadores (Fig. 2A). PIT indujo reducciones significativas en el volumen del tumor (n = 10 en cada grupo, * p = 0,0456 & lt; 0,05, prueba de Tukey). Cuatro ratones de cada diez en el grupo PIT se curaron por completo por el tratamiento (Fig. 2B). La supervivencia se prolongó significativamente en el grupo de PIT en comparación con el grupo control (n = 10 en cada grupo, ** p & lt; 0,0001, prueba de rango largo y prueba de Wilcoxon) (Figura 2C).. Estos datos sugieren que el PIT causó una reducción significativa del tumor y la supervivencia prolongada
in vivo
.
(A) en régimen de PIT. (B) conduce a PIT N87-GFP de reducción de volumen tumor en el flanco (n = 10 ratones en cada grupo de tratamiento; * p = 0,0456 & lt; 0,05, frente a APSC), la prueba de Tukey con ANOVA). El tratamiento se indica debajo de la gráfica. (C) repetido PIT conduce a la supervivencia prolongada en ratones portadores de tumores N87-GFP (n = 10 ratones en cada grupo de tratamiento, ** P & lt; 0,0001), prueba de largo rango y la prueba de Wilcoxon). matanza completa del tumor se logró para 4 ratones de 10 en el grupo PIT después de re-tratamiento.
imágenes GFP fluorescencia in vivo después de la PIT en el modelo de xenoinjerto flanco
Con el fin de vigilar
in vivo
PIT, imágenes GFP en tiempo real se realizó en ratones con tumores en los flancos bilateral N87-GFP (Fig. 3A). GFP fluorescencia demostró la carga tumoral y la respuesta al PIT. la fluorescencia de GFP se correlacionó con IR700 de fluorescencia, que disminuyó rápidamente después de PIT (Fig. 3C). formación de imágenes de fluorescencia total (TFI) de GFP en los tumores no tratados (control) y en los tumores que reciben la luz sólo aumentó debido al crecimiento del tumor. En los tumores tratados con PIT, TFI de GFP disminuyó gradualmente en el tumor tratado, mientras que el tumor opuesta en el mismo ratón (iv única, no hay luz) demostró un aumento en la fluorescencia de GFP (Fig. 3B).
(A) régimen de PIT. Las imágenes de fluorescencia se obtuvieron en cada punto de tiempo como se indica. (B)
En vivo GFP
de fluorescencia en tiempo real de imágenes de tumor en el flanco bilateral ratones portadores en respuesta a PIT. El tumor tratado por PIT mostró disminución de la fluorescencia de GFP después de la PIT. (C) Análisis cuantitativo de la intensidad de fluorescencia de GFP (intensidad /total del tumor) en ratones portadores de tumores N87-GFP mostraron una disminución significativa de la fluorescencia entre el grupo control y el grupo PIT (n = 5 ratones en cada grupo, (* p = 0,0118 & lt; 0,05, frente al control) (* p = 0,0016 & lt; 0,01, frente a la luz NIR) (* p = 0,0012 & lt; 0,01, frente a APSC) (** p = 0,0010 & lt; 0,01, frente al control) (** p = 0,0003 & lt; 0,001, frente a la luz NIR) (** p = 0,0003 & lt; 0,001, frente a APSC) (*** p = 0,0049 & lt; 0,01, frente al control) (*** p = 0,0039 & lt; 0,01, frente a la luz NIR) (*** p = 0,0012. & lt; 0,01, frente a APSC), la prueba de Tukey con ANOVA) guía empresas
la cuantificación de la intensidad total de fluorescencia de GFP reveló que había una disminución significativa después de PIT (n = 5 ratones en cada grupo, * p = 0,0118 & lt; 0,05, ** p = 0,0010 & lt; 0,01, *** p = 0,0049 & lt; 0,01, prueba de Tukey con ANOVA) (Fig. 3C) . Debido a re-crecimiento del tumor, la relación de GFP aumentó de nuevo desde el día 4 después de PIT, aunque era inferior al de otros grupos de control. El tiempo real de imágenes de fluorescencia de GFP y su cuantificación habilitadas comparación en tiempo real de los grupos y mostraron una fuerte correlación entre una mayor fluorescencia de GFP y la progresión tumoral en cada grupo.
Para confirmar este efecto,
ex vivo
análisis se realizó (Fig. 4A). El efecto PIT se confirmó con una disminución en IR700 de fluorescencia (Fig. 4B). Bajo esta condición, la intensidad de GFP
ex vivo
tumores disminuyó después de PIT (Fig. 4B). Estos datos sugieren que la formación de imágenes en directo en tiempo real GFP es consistente con
ex vivo de imágenes. Régimen de PIT
(A). Las imágenes de fluorescencia de
ex vivo
tumores se obtuvieron en cada punto de tiempo como se indica. (B)
Ex vivo
de fluorescencia de imágenes de tumores N87-GFP en respuesta a PIT. cambios de fluorescencia se observan tanto con las buenas prácticas agrarias y la fluorescencia IR700 en respuesta a PIT. imágenes (C) de la fluorescencia se obtuvieron en cada punto de tiempo como se indica. (D)
En vivo
de fluorescencia en tiempo real de imágenes del tumor en el flanco bilateral ratones en respuesta a PIT repetida rodamiento. la intensidad de fluorescencia de GFP-del tumor fue casi eliminado después de la segunda fosa.
Cuando PIT se repite semanalmente, la actividad de fluorescencia de GFP con el tiempo desapareció (Fig. 4C y D), lo que indica la matanza completa del tumor.
Caracterización del modelo peritoneal diseminada con imágenes de fluorescencia
con el fin de determinar la historia natural del modelo peritoneal diseminada, se llevó a cabo en serie de imágenes de fluorescencia
. Los tumores implantados demostraron señal de alta fluorescencia con IR700, IR800, y GFP, todos los cuales co-localizada con la otra (IR800 se utilizó para evitar autofluorescencia intestinal) (Fig. 5). Estos datos sugieren que este modelo de cáncer peritoneal diseminada se puede controlar en ratones vivos mediante fluorescencia de GFP.
En vivo
GFP fluorescencia de imágenes de un tumor en el flanco N87-GFP y el modelo peritoneal diseminada. Colocalización de tra-tra-IR700 y IR800 se confirmó en el tumor diseminada peritoneal con imágenes de fluorescencia. La inyección intravenosa del agente puede llegar a tumores diseminados en la cavidad peritoneal. Para evitar la autofluorescencia en el intestino, tra-IR800 se utilizó, así como tra-IR700.
imágenes GFP fluorescencia in vivo después de la PIT en diseminada modelo peritoneal
En tiempo real imágenes de fluorescencia de GFP se llevó a cabo en el modelo peritoneal diseminada antes y después de PIT (Fig. 6A). IR700 de fluorescencia disminuyó después de PIT (Fig. S4). GFP TFI aumentó gradualmente en los grupos no-PIT debido al crecimiento del tumor. En el grupo tratado PIT, GFP TFI disminuyó de 1 día a 3 días después de PIT (Fig. 6B). La cuantificación de la intensidad total de fluorescencia GFP puso de manifiesto una disminución significativa después de PIT (n = 5 ratones en cada grupo, * p = 0,0295 & lt; 0,05, ** p = 0,0355 & lt; 0,05, prueba con post-test de Kruskal-Wallis) (Fig. 6C). Debido a la tumorales re-crecimiento, la relación de GFP aumentó de nuevo a partir de 4 días después de PIT, aunque mantuvo más baja que otros grupos, como se observa con el modelo de tumor en el flanco. Por lo tanto, PIT causada significativa tumor específico efecto tanto en el modelos de tumor peritoneal difundidos flanco y y esto podría ser monitoreada con GFP TFI matar. Régimen PIT
(A). imágenes de fluorescencia de GFP en tiempo real se obtuvo en cada punto de tiempo indicado. (B)
En vivo
en tiempo real de imágenes de fluorescencia en respuesta a PIT. (C) Análisis cuantitativo de la intensidad de fluorescencia de GFP mostró una disminución significativa en el día 3 después de la PIT entre el grupo control y el grupo PIT (n = 5 ratones en cada grupo, (* p = 0,0295 & lt; 0,05 frente a la luz NIR) (** p = 0,0489 & lt; 0,05 frente a control) (** p = 0,0355. & lt; 0,05 frente a APSC), prueba de Kruskal-Wallis con el post-test)
Discusión
Este estudio demuestra que el efecto de PIT se puede controlar con imágenes de fluorescencia GFP. A diferencia de la apoptosis [12], [13], en la que GFP y las proteínas fluorescentes relacionados se convierten debido más brillante al volumen citoplásmico decreciente, durante la muerte celular necrótica con PIT, daño de la membrana conduce a la liberación de los contenidos citoplásmicos incluyendo GFP. Esta característica única de GFP y proteínas fluorescentes relacionadas con los convierte en biomarcadores útiles para el PIT.
En vivo
imágenes de fluorescencia de GFP permite que el proceso completo de la tumorigénesis, el tratamiento, la regresión, la metástasis o recurrencia, a ser detectado en el mismo animal sin procedimientos invasivos [10], [11]. Mediante el empleo de células que expresan GFP citoplasmática, los efectos antitumorales inducidas por PIT podrían ser controlados fácilmente debido a la protuberancia de la GFP a partir de células tratadas.
El concepto de usar la terapia de luz dirigida es más de tres décadas de edad [22]. Debido a la hidrofobicidad de sensibilizadores tradicionales terapia fotodinámica (PDT), la farmacocinética de anticuerpo conjugado agentes de PDT es muy limitada en su capacidad para ofrecer conjugados a la diana. Por lo tanto, sensibilizadores PDT dirigidos con anticuerpos sólo ha tenido éxito en modelos en los que se inyectó el conjugado directamente en el tumor o el peritoneo [23]. Con el fin de entregar un conjugado de anticuerpo-fotosensibilizador (APSC) de forma sistémica, el fotosensibilizador debería ser preferentemente hidrófilo. El fotosensibilizador basado en ftalocianina hidrofílica, IR700DX cuando se conjuga a un anticuerpo se convierte en una APC que se puede administrar por vía intravenosa. Esta forma de terapia, denominada PIT, difiere de la tradicional PDT no sólo en la hidrofilia del fotosensibilizador, sino también en su dependencia de la luz NIR para activar el fotosensibilizador. luz NIR tiene mejor penetración en los tejidos de menor longitud de onda de la luz utilizada en la PDT. Esta nueva generación de APCs demuestra una farmacocinética intravenosa similares a anticuerpos desnudos, lo que resulta en la acumulación de tumor muy específica con la unión no objetivo mínimo y se puede aplicar a un amplio espectro de anticuerpos, lo que permite muchas aplicaciones potenciales en todo el cuerpo.
A pesar quimioterapia citotóxica, el resultado para el cáncer gástrico avanzado etapa sigue siendo pobre. Debido a que, la mayoría de los pacientes con metástasis peritoneales se presentan con síntomas insidiosos tales como falta de apetito, pérdida de peso, sensación de hinchazón, dolor o el diagnóstico de anemia se retrasa a menudo y terapias locales ya no son viables [24]. PIT es un método prometedor para tratar el cáncer peritoneal diseminada. Para llevar a cabo PIT eficaz, el APSC debe ser entregada sistémicamente y la luz se debe aplicar selectivamente al peritoneo. En estas condiciones no hay suministro suficiente de APSCs para dar lugar a la reducción de los tumores diseminados después PIT. Este proceso puede ser monitoreado en tiempo real con
in vivo
GFP fluorescencia de imágenes.
Hay varias limitaciones a este estudio. Debe tenerse en cuenta que no todos los cánceres gástricos expresan HER2 y por lo tanto, TRA-IR700 no pueden ser uniformemente eficaz en el cáncer gástrico diseminada.