Extracto
Antecedentes
Phyllanthus
es una planta medicinal tradicional que se ha utilizado en el tratamiento de muchas enfermedades como la hepatitis y diabetes. El principal objetivo del presente trabajo fue investigar los posibles efectos citotóxicos de los extractos acuosos y metanólicos de cuatro
Phyllanthus
especies (
P.amarus, P.niruri, P.urinaria
y
P.watsonii
) contra las células de cáncer de piel y de próstata.
Metodología /Principales conclusiones
Phyllanthus
planta parece poseer propiedades citotóxicas con inhibitoria semimáxima valores de concentración (IC
50) de 150 a 300 g /ml de extracto acuoso y 50 a 150 mg /ml de extracto metanólico que se determinaron usando el ensayo de reducción MTS. En comparación, los extractos de plantas no mostraron ninguna citotoxicidad significativa en la piel normal humana (CCD-1127Sk) y de próstata células (RWPE-1). Los extractos parecían actuar al causar la formación de una "escalera" fragmentación clara de ADN apoptótico en gel de agarosa, muestra células TUNEL-positivas con una elevación de la caspasa-3 y -7 actividades. El nivel de lactato deshidrogenasa (LDH) fue inferior al 15% en las células de cáncer tratados-
Phyllanthus.
Estos indican que
Phyllanthus
extractos tienen la capacidad de inducir la apoptosis con efectos mínimos necróticas. Además, el análisis del ciclo celular reveló que
Phyllanthus
indujo una detención de la fase G1 /Ir en células PC-3 y una detención de la fase S en las células MEWO y estos fueron acompañados por la acumulación de células en el sub-G1 ( apoptosis) de fase. Las propiedades citotóxicas se pueden deber a la presencia de compuestos de polifenol, como elagitaninos, galotaninos, flavonoides y ácidos fenólicos encontrado tanto en el extracto de agua y metanol de las plantas.
Conclusiones /Importancia
Phyllanthus
planta ejerce su efecto de inhibición del crecimiento de una manera selectiva hacia las células del cáncer a través de la modulación de ciclo celular y la inducción de apoptosis a través de la activación de caspasas en células de melanoma y cáncer de próstata. Por lo tanto,
Phyllanthus
puede tener origen para el desarrollo de un agente anticanceroso potente inductor de apoptosis
Visto:. Tang YQ, Jaganath IB, Sekaran SD (2010)
Phyllanthus
spp. Induce Inhibición del crecimiento selectivo de células de cáncer humano MEWO PC-3 y mediante la modulación de ciclo celular y la inducción de la apoptosis. PLoS ONE 5 (9): e12644. doi: 10.1371 /journal.pone.0012644
Editor: Niyaz Ahmed, Universidad de Hyderabad, India
Recibido: 25 Junio, 2010; Aceptado: August 17, 2010; Publicado: 8 Septiembre 2010
Derechos de Autor © 2010 Tang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue financiado por la Beca de Investigación de Postgrado, Universidad de Malaya (UM PS183 /2009B) (www.um.edu.my) y Malasia Agrícola y el Instituto de Investigación para el Desarrollo (MARDI) (53-02-03-1002) (www.mardi.gov .mi). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer es un nombre dado al grupo de enfermedades que se derivan de un crecimiento incontrolado, la propagación de una célula anormal y puede ocasionar la muerte. Es extremadamente difícil de tratar debido a varios tipos distintos de tumores que exhiben diferentes respuestas al tratamiento y no todos los agentes contra el cáncer efectivamente dan una respuesta positiva en todos los casos [1]. Algunos han sido reportados para exhibir toxicidad para las células normales, acompañadas de efectos indeseables, tales como vómitos, náuseas y alopecia. Por lo tanto, los agentes anticancerígenos ineficaces han dado lugar a altas tasas de mortalidad en pacientes con cáncer [2]. El melanoma es un tipo de cáncer de piel que surge de los melanocitos, una célula de bronceado productoras de pigmento. La incidencia de melanoma y su tasa de mortalidad son altas en poblaciones de piel clara en todas partes del mundo, como Australia, EE.UU. y el Reino Unido [3] - [4]. El cáncer de próstata es la segunda causa principal de muerte por cáncer después del cáncer pulmonar en todo el mundo [3]. Actualmente, no existen tratamientos eficaces tanto para el melanoma y el cáncer de próstata, y como tal se requiere una intensa investigación para obtener nuevos fármacos anticancerosos para estos cánceres.
La alta mortalidad en pacientes con cáncer ha llevado a muchos investigadores a la fuente para el potencial compuestos terapéuticos basados en productos naturales [2]. las plantas a base de hierbas y medicinas derivadas de plantas se han utilizado como fuente de agentes anticancerígenos potenciales en las culturas tradicionales en todo el mundo y se están convirtiendo cada vez más popular en la sociedad moderna [5]. Los posibles agentes contra el cáncer de productos derivados naturales son conocidas por poseer varios compuestos bioactivos tales como la roscovitina de rábano rojo y flavopiridol de
Amoora rohituka
, un árbol tropical que ha demostrado enormes efectos en el tratamiento de cánceres [6] - [8].
la planta del género
Phyllanthus
pertenece a la familia
Euphorbiaceae
y se ha informado que tiene efectos farmacológicos tales como la actividad antiviral contra la hepatitis B y relacionados virus de la hepatitis [9] - [12], la actividad anti-bacteriana [13], [14], la actividad anti-hepatotóxico o hígado protector de [15] - [19], así como anti-tumorales y anti-cancerígenos propiedades [16 ], [20]. Además, también se ha exhibido propiedades hipoglucemia [21], [22]. Aunque las plantas del género
Phyllanthus
ha demostrado ser beneficioso para la salud humana, pero su eficacia contra el cáncer no se ha aclarado completamente.
Uno de los retos en el tratamiento del cáncer es el cáncer que posee la capacidad para evadir la apoptosis (o muerte celular programa) que conduce a su ineficacia como un fármaco citotóxico para matar las células cancerosas. El proceso de apoptosis es un mecanismo importante de la muerte celular en respuesta al tratamiento citotóxico y su inducción es un modo muy deseable para un agente contra el cáncer [23]. ciclo celular es un proceso que actúa como una clave para controlar el crecimiento y la proliferación de una célula. La interrupción del proceso del ciclo celular causará un desequilibrio entre la proliferación celular y la muerte celular (apoptosis), que posteriormente conducen al desarrollo del cáncer. Por lo tanto, el ciclo celular puede servir como diana para agente contra el cáncer para detener la proliferación incontrolada de las células cancerosas y para iniciar a someterse a la apoptosis [24]. Los efectos citotóxicos de
Phyllanthus
extractos acuosos (metanol) y en la inhibición del crecimiento contra el melanoma de la piel y las células de cáncer de próstata en su ciclo celular podría explicar en parte su modo de actividad. El objetivo del presente estudio fue determinar el efecto citotóxico de
Phyllanthus
extrae en la proliferación de células de cáncer de próstata y la piel y también para investigar la relación de estos efectos antiproliferativos con la apoptosis probable y la modulación del ciclo celular.
resultados
la actividad citotóxica de los extractos acuosos y metanólicos de
Phyllanthus
especies
En este estudio, hemos investigado los efectos citotóxicos de los extractos acuosos y metanólicos brutos de cuatro diferentes
Phyllanthus
especies,
P.amarus, P.niruri, P, urinaria, España y
P.watsonii
, en dos cánceres humanos (Mewo y PC-3) así como las líneas de células normales (CCD-1127Sk y RWPE-1). Las propiedades citotóxicas de la
Phyllanthus
extractos se determinaron utilizando el MTS [3- (2-il-4,5-dimetiltiazol] -5--carboximetoxifenil 3) -2- 2H ((4-sulfofenilo) sal -tetrazoliuminner) ensayo de reducción. El principio detrás de este ensayo se basa en la capacidad de reducción de una sal de tetrazolio soluble, mediante la enzima de deshidrogenasa mitocondrial de las células viables, en un producto de formazán soluble de color que puede ser medido espectrofotométricamente. La concentración inhibidora semimáxima (IC
50) valor se determina a partir de la curva dosis-respuesta construida y se establece como un parámetro para la citotoxicidad.
Tabla 1 muestra la comparación de IC
50 valores para ambos extractos acuosos y metanólicos de crudo de los cuatro
Phyllanthus
especies tanto en el cáncer humano líneas celulares (MEWO y PC-3) y normal (CCD-1127Sk y RWPE-1). El resultado revela la presencia de efectos citotóxicos de
Phyllanthus
especies tanto en melanoma de la piel y las células de cáncer de próstata, donde el respectivo IC
50 valores de
se determinaron Phyllanthus
extractos. En comparación, la planta no mostró efectos citotóxicos significativos sobre las células humanas normales, mientras que, los medicamentos contra el cáncer estándar (5'Fluorouracil y doxorrubicina) mostraron fuerte efecto citotóxico de los
Phyllanthus
extractos, pero exhibe toxicidad de la normalidad las células (Tabla 1). Entre los cuatro
Phyllanthus especies vegetales
,
P.urinaria
mostraron fuerte efecto citotóxico, seguido por
P.watsonii, P.niruri
y
P.amarus
. Además, el IC
50 valores de los extractos de metanol de
Phyllanthus
especies eran notablemente más bajos que los extractos acuosos de ambos células de cáncer que indican que el extracto de metanol es más citotóxico que el extracto acuoso.
identificación de polifenoles en el
Phyllanthus
especies
El metanol y los extractos solubles en agua obtenidos de diversas especies de
Phyllanthus
se sometieron a análisis por HPLC (High Performance Liquid Chromatography) junto con matriz de fotodiodos (PDA) y detección MS-MS que permite la identificación de compuestos de polifenol (Tabla 2). Doce compuestos principales se identificaron sobre la base de sus tiempos de retención, los espectros de UV, y los espectros de masas de los padres y patrones de fragmentación secundaria. Los compuestos detectados fueron el ácido gálico, galloylglucopyronside, digalloylglucopyronside, trigalloylglucopyronside, tetragalloylglucopyronoside, corilagen, geraniin, rutina, quercetina glucósido, quercetina diglucósido, quercetina ramnósido, y ácido caffeolquinic.
fragmentación del ADN
una de las características bioquímicas en el proceso de apoptosis es la formación de la fragmentación del ADN nuclear, que muestra la presencia de fragmentos de ADN escalera típicos de 180 - 200 pares de bases y múltiplos de los mismos en un gel de agarosa. En contraste, la escisión aleatoria de ADN en las células necróticas producirá una mancha difusa sobre la electroforesis de DNA. Por lo tanto, se utilizó ADN método de electroforesis en gel para determinar el posible modo de muerte celular causada por
Phyllanthus
extractos. La Figura 1A muestra la presencia de fragmentos de ADN producidos por el tratamiento de células MEWO con
Phyllanthus
extractos y un patrón similar se observó con el fármaco estándar (5'Fluorouracil) como control positivo. No se observó la formación de escalera en las células no tratadas. Estos fenómenos se observaron también en la línea celular PC-3 para ambos extractos como se muestra en la Figura 1B. Por lo tanto, esto indica que ambos extractos de
Phyllanthus
eran capaces de inducir apoptosis o muerte celular programada en células MEWO y PC-3 en respuesta a los efectos citotóxicos de
Phyllanthus
.
carril 1 -4: acuoso y carril 6 - 9: extractos de metanol para
P.amarus, P.niruri, P.urinaria
y
P.watsonii
, en el orden. Carril 5 y 10: 1 marcador kb de ADN, Lane 11: medicamentos estándar, donde A) 5'Fluorouracil para MEWO y B) doxorrubicina para células PC-3. Carril 12:. Células no tratadas
ensayo de TUNEL y el índice apoptótico
TUNEL (terminal desoxinucleotidiltransferasa dUTP nick fin de etiquetado) ensayo es una técnica para permitir la detección de células apoptóticas mediante el etiquetado de la libre final de ADN de apoptosis con un marcador que puede ser visualizado bajo microscopio de luz. Como se muestra en la Figura 2, se observaron células apoptóticas como células de color marrón en
Phyllanthus
extractos tratados con MEWO (Figura 2A, punta de flecha) y células de cáncer de PC-3 (Figura 2B, punta de flecha), su apariencia fueron similares a las células apoptóticas que estaban presentes en los controles positivos, apoptótica-inductor medicamento contra el cáncer (5'Fluorouracil y doxorrubicina), mientras que las células viables se tiñeron de color azul. Esto confirma aún más que
Phyllanthus
extractos fueron capaces de inducir la apoptosis en células de melanoma de piel y cáncer de próstata. Las poblaciones de la muerte celular se pueden calcular y expresar de forma matemática, conocida como índice apoptótico. A partir de la figura 2C, el porcentaje de muerte celular (apoptosis índice) del tratado con Mewo y células PC-3 se incrementaron notablemente hasta un 50% en comparación con el grupo control a las 72 horas de tratamiento con
Phyllanthus
extractos. Además, el porcentaje de
Phyllanthus
extractos de células apoptóticas inducidas estaba cerca de los medicamentos contra el cáncer (5'Fluorouracil y doxorrubicina) con diferencia sólo el 8%.
TUNEL análisis de Mewo y PC-3 las células cancerosas después de ser tratados con
Phyllanthus
extrae en un aumento de 100x. células TUNEL positivas (apoptosis) eran observables como células teñidas de color marrón (flecha roja) en) las células PC-3 Mewo y B)
Phyllanthus
Un extractos tratados con células viables y normales se tiñen de color azul como. C) El gráfico muestra el porcentaje de índice de apoptosis (%) de los tratados y tratados (
Phyllanthus
extractos y medicamentos contra el cáncer) Mewo y las células cancerosas PC-3 a partir del análisis de TUNEL.
Phyllanthus
extractos inducida por la caspasa-3/7 activaciones
una activación de las caspasas (aspartato específica de la proteasa cisteína) es uno de los cambios bioquímicos durante la apoptosis. Los niveles de caspasa-3/7 inducida por
Phyllanthus
tratamiento se incrementaron notablemente (3-4 pliegues) en comparación con el grupo no tratado (Figura 3) para ambos extractos de
Phyllanthus
. El nivel de la caspasa-3/7 de medicamentos estándar, 5'Fluorouracil y doxorrubicina en MeWO y células PC-3, respectivamente, fueron de 6 pliegues aumentan en comparación con la del grupo de control y 0,5 veces mayor que
Phyllanthus
extrae después de 72 horas de tratamiento. Todo esto indica que la apoptosis inducida por
Phyllanthus
extractos fue mediado a través de la activación de las caspasas.
El gráfico muestra los niveles de caspasa-3 y -7 en los grupos tratados y no tratados de Mewo y células PC-3 . Las barras muestran la media ± SE
Phyllanthus
extractos inducida por un mínimo efecto necrótico
La necrosis es otra forma de muerte celular que provocará la respuesta inflamatoria de las células circundantes a través la filtración de los contenidos intracelulares. Como se muestra en la Figura 4, el porcentaje de los niveles de LDH produce como resultado del tratamiento con ambos extractos de
Phyllanthus
especie era menos de 10% para las células MEWO y menos de 15% para las células PC-3, en comparación a la de los grupos de control después de 72 horas de tratamiento. El efecto necrótico de extractos de metanol fue más pronunciada, donde se observó que es de 4% más alto que el extracto acuoso de
Phyllanthus
especies. Esto sugiere que los
Phyllanthus
especie posee efectos necróticos mínimos y melanoma de la piel era menos propenso a mostrar el efecto necrótico que las células de cáncer de próstata. En contraste, el nivel de LDH inducido por el control positivo (5'Fluorouracil y doxorrubicina) fue 25% más alta que las células no tratadas y 18% en la variación con el
Phyllanthus
células tratadas a las 72 horas de tratamiento.
el gráfico muestra el porcentaje de los niveles de LDH en
Phyllanthus
-extractos Mewo tratadas y células de cáncer de PC-3 fueron más altos que el grupo no tratado después de 72 horas de tratamiento. Las barras muestran el porcentaje medio ± SE
Phyllanthus
extractos inducir la detención del ciclo celular, seguido por apoptosis
Para determinar la fase del ciclo celular que es inhibida por
extractos de Phyllanthus
planta, tanto Mewo y las células PC-3 fueron tratados en sus respectivos IC
50 valores de 24, 48, 60 y 72 horas, y luego analizadas por citometría de flujo. La cinética de la distribución del ciclo celular de los grupos tratados y no tratados de MEWO y células PC-3 se muestran en la Figura 5 y 6, respectivamente. Los cambios en la distribución de las células tratadas en diferentes fases del ciclo celular eran observables por 24 horas después de haber sido tratado con
Phyllanthus
extrae de las líneas celulares de cáncer de ambos.
El porcentaje de
Phyllanthus
células extractos tratadas en a) Sub-G1, B) Ir /G1, C) S, y D) G2 /M fases de células Mewo a diferentes intervalos de tiempo (24, 48, 60 y 72 horas) de tratamiento . Las barras muestran el porcentaje medio ± SE
El porcentaje de
Phyllanthus
células extractos tratados en A) Sub-G1, B) Ir /G1, C) S y D) G2 /M fases de las células PC-3 en diferentes intervalos de tiempo (24, 48, 60 y 72 horas) de Barras de tratamiento muestran el porcentaje medio ± SE
Como se ve en la Figura 5,
Phyllanthus
extractos mostraron crecimiento de detención en la fase S en células Mewo de 24 horas y se mantuvo evidente después de 72 horas de tratamiento y esto fue acompañado por una acumulación de células en el sub-G1 (células de la apoptosis) en fase acuosa para ambos y extractos metanólicos. El porcentaje de células apoptóticas aumentó de una manera dependiente del tiempo de 1,8% a las 24 horas a 6,1% a las 72 horas en comparación con los grupos de control (Figura 5A). Mientras tanto, el porcentaje de células en la fase S de las células MeWO tratadas fue elevada a 15% por encima de los controles a las 72 horas de tratamiento (Figura 5C). Además, el porcentaje de células en Go /G1 y G2 /M fases disminuyó con el tiempo tras el tratamiento con
Phyllanthus
extrae debido al hecho de que las células tratadas se han detenido en la fase S y posteriormente acumulado en Sub-G1 (apoptosis) de fase (Figura 5B y 5D). Sin embargo, la potencia de
Phyllanthus
extrae para inducir la detención de la fase S no fue tan fuerte como el fármaco estándar (5'Fluorouracil), con una diferencia de 22,1% a las 72 horas después del tratamiento.
para las células PC-3,
Phyllanthus
detención del crecimiento exhibido en la fase Go /G1 a las 72 horas después del tratamiento con una acumulación de células apoptóticas en la fase sub-G1 para ambos extractos acuosos y metanólicos. El porcentaje de células apoptóticas aumentó de 3,4% a las 24 horas hasta 7,4% a las 72 horas en los grupos no tratados (Figura 6A). El porcentaje de células PC-3 tratadas en /G1-fase Go fue del 13,7% a las 24 horas y esto aumentó a un 18,8% a las 72 horas por encima de los grupos no tratados (Figura 6B). Sin embargo, el porcentaje de-PC tratado-3 células en el S y G2 /M fases disminuyó con el tiempo de tratamiento (Figura 6C y 6D) debido al hecho de que trataron células PC-3 fueron detenidos en Go fase /G1 y posteriormente acumulan en fases sub-G1. Mientras que la doxorrubicina mostró una detención en la fase G2 /M en células PC-3 a las 24 horas y se mantuvo evidente después de 72 horas de tratamiento.
Discusión
El hombre ha utilizado las plantas ampliamente para el tratamiento de diversos tipos de enfermedades desde la antigüedad [7]. las plantas a base de hierbas y medicinas derivadas de plantas han sido ampliamente utilizados en las culturas tradicionales en todo el mundo y han ganado popularidad en la sociedad moderna como alternativas naturales para producir nuevos compuestos terapéuticos potenciales para la lucha contra las enfermedades [5]. El sesenta por ciento de medicamentos contra el cáncer disponibles de hoy en día se originó a partir de productos naturales, y sus derivados (incluidos los antibióticos). Esto ha resultado en una mayor confianza en los productos naturales como fuentes importantes para el desarrollo de agentes anticancerígenos eficaces [7].
En el presente estudio, ambos extractos acuosos y metanol de cuatro especies de plantas de
Phyllanthus
efectos citotóxicos que aparecen en la piel de melanoma humano (Mewo) y de próstata (PC-3) líneas celulares. Las variaciones en el CI valores
50 de
Phyllanthus
extractos frente a células de melanoma y el cáncer de próstata podría ser debido a los diferentes niveles de compuestos bioactivos presentes en cada
Phyllanthus
especies como la quercetina, ácido gálico y ácido caffeolquinic que se han demostrado poseer efectos anticancerígenos [16], [25] - [27]. Además, los datos obtenidos sugieren que el extracto metanólico de
Phyllanthus
parecía tener efecto citotóxico más pronunciado que el extracto acuoso, indicando los compuestos bioactivos soluble en metanol contenidos en
Phyllanthus ¿Cuáles son probablemente más potente que los compuestos bioactivos acuosas solubles en matar las células cancerosas. Entre los cuatro
Phyllanthus especies y usados,
P. urinaria
mostraron el efecto citotóxico más fuerte. Esto podría estar asociado a su contenido exclusivo de trigalloylglucopyronoside y tetragalloylglucopyronosid. Curiosamente,
Phyllanthus
extractos no causó ningún cambio significativo en la viabilidad celular de las dos líneas de células normales de la piel humana (CCD-1127Sk) y de próstata (RWPE-1). Estos resultados se correlacionan con los estudios realizados por Huang et al. en la que
Phyllanthus
plantas muestran la destrucción selectiva contra las células del cáncer [28]. Este efecto citotóxico selectivo es un criterio importante debido a que los fármacos actualmente disponibles apuntan a las células normales, así y conduce a efectos secundarios.
La vida y la muerte de una célula es controlado por el ciclo celular, que está estrechamente regulada por la ciclina , quinasas dependientes de ciclina (CDK), inhibidores de CDK (CDKI) y otros genes supresores de tumores. De este modo, la desregulación del ciclo celular dará lugar a la proliferación anormal de células con el ADN dañado y evasivas de la apoptosis [29].
Phyllanthus
extractos interrumpió el ciclo celular de las células Mewo en la fase S, lo que implica que podrían haber interferido con la síntesis de ADN, la detención de la progresión del ciclo celular en la fase S y que conduce a la apoptosis. La detención de la fase S por
Phyllanthus
extractos de células Mewo podría ser debido a: (1) la inhibición de enzimas Cdc25 [16], [30] - [32], o (2) la inhibición de la topoisomerasa II de ADN lo que conduce a la activación de caspasas [16], [33]. De este modo, se detectaron altos niveles de caspasa-3 y -7 actividades después del tratamiento 72 horas después de
Phyllanthus
extractos. Sin embargo, la detención de la fase S exhibido por
Phyllanthus
extractos no fueron tan pronunciadas como 5'Fluorouracil, que es un fármaco contra el cáncer de la piel sensible de la fase S, lo que indica que
Phyllanthus
extrae probablemente matar a las células del melanoma en otras formas, además de interrumpir el ciclo celular, tales como las alteraciones en las vías de señalización celular de melanoma, incluyendo FAS vía [34]. Otras investigaciones abordarán el modo de acción de
Phyllanthus
extractos de células de melanoma.
Phyllanthus
extractos ejercieron su detención en el crecimiento de las células PC-3-tratada mediante la acumulación de las células en la fase G1-Go /, lo que implica que
Phyllanthus
extractos pueden interferir con la síntesis de proteínas de células PC-3 así detener su progresión de G1 a la fase S durante su ciclo celular y posteriormente inician la apoptosis. Esto podría ser debido a los efectos inhibidores sobre la proteína MDM2, lo que reduce la proliferación celular e induce la apoptosis por la elevación de p21, Bax y los niveles pRb, así como la reducción de hiperfosforilada Rb y E2F1 [35].
Phyllanthus
inducida por la apoptosis en células PC-3 podría estar asociado con elevaciones de la expresión del gen receptor /ligando de Fas Bax y según lo propuesto por Huang et al. [25]. Las elevaciones de la proteína Bax se asocia con la participación de vía mitocondrial (intrínseca) en la apoptosis que implica la reducción del potencial de membrana mitocondrial, libera el citocromo c y, posteriormente, que conduce a la activación de caspasas [36]. Se detectaron altos niveles de caspasa-3 y -7 actividades en las células tratadas con
Phyllanthus
extractos. El /detención de la fase G1 Ir en PC-3 por
Phyllanthus
extractos podría estar asociado a su alto contenido en compuestos de polifenol. Los 12 polifenoles identificados en
Phyllanthus
, se clasifican en cuatro grupos principales, a saber, ácido gálico, galotaninos, flavonoides y ácidos fenólicos con elagitaninos siendo el grupo más abundante de compuesto. Elagitaninos también se encuentran en abundancia en la granada y se han estudiado muy a fondo por sus variados efectos terapéuticos que incluyen sus propiedades supresoras del cáncer [37]. Geraniin, el ellagitannin principal que se encuentra en todos los P
hyllanthus
especies, han demostrado que contribuyen a las detenciones de crecimiento en otros tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de colon [38], [39]. Sin embargo, el fármaco estándar para el cáncer de próstata, doxorrubicina, interrumpe el crecimiento de células cancerosas mediante la detención ellos en fase G2 /M y, finalmente, iniciar la apoptosis mediante una variedad de mecanismos tales como la inhibición de las enzimas topoisomerasa como se ve en otros estudios [40], [ ,,,0],41]
La activación de la caspasa-3 y -7 actividades en las células de cáncer tratadas durante resultados apoptosis en:. (1) inactivación de la enzima poli (ADP-ribosa) polimerasa o PARP, y (2) la activación de caspasa activa DNasa (CAD), causando posteriormente la fragmentación del ADN, que es una de las características de la apoptosis [42], [43]. Por lo tanto, la elevación de estas caspasas después
Phyllanthus
tratamientos permite la aparición de fragmentos de ADN de apoptosis en gel de agarosa, que se confirmó con la presencia de células TUNEL positivas. Por lo tanto, los efectos citotóxicos de
Phyllanthus
extrae en la piel humana (Mewo) y de próstata (PC-3) líneas celulares de cáncer fue mediado a través de un mecanismo de apoptosis con la activación de la caspasa-3 y -7 y esto podría deberse a la presencia de ácido gálico que se encuentra en
Phyllanthus
extractos. El ácido gálico anteriormente se ha demostrado inducir apoptosis a través de la caspasa-3 de activación [44]
.
En el descubrimiento de fármacos a base de productos naturales y desarrollo, necrosis puede ocurrir junto con la apoptosis. Esto se ha demostrado en muchos medicamentos contra el cáncer tales como cladribina, cisplatino, doxorrubicina y 5'fluorouracil, que poseen tanto apoptótica y los efectos necróticos [45], [46]. La LDH son un grupo de enzimas que están presentes en nuestro cuerpo y su nivel anormalmente elevado indica problemas de salud. En las células, LDH se produce principalmente por la mitocondria y juegan un papel importante en la oxidación de lactato, mientras que la reducción de piruvato [47]. En la muerte celular necrótica, integridad de la membrana de plasma se pierde y esto conduce a la filtración de los contenidos citoplásmicos en el entorno extracelular que causa una reacción inflamatoria [23]. Las mediciones de la enzima LDH como indicador de la necrosis, demostraron que
Phyllanthus
además de tener actividad apoptótica, también poseen la capacidad mínima de la inducción de la muerte celular necrótica en tanto MEWO y las células PC-3. Tomados en conjunto, los resultados indican que
Phyllanthus
planta posee doble capacidad de la muerte celular, tal vez debido a la naturaleza cruda de los
Phyllanthus
extractos, en los que todos los compuestos bioactivos potenciales se mezclan entre sí y mayo actuar individualmente o en sinergia, contribuyendo así a esta doble capacidad de la muerte celular 'efectos.
se cree que estos compuestos bioactivos que poseen citotoxicidad hacia las células cancerosas a través de su capacidad para interrumpir el crecimiento de células de cáncer e iniciar a someterse a la muerte celular apoptótica. Aunque los mecanismos detallados o subyacentes de la selectividad de los
Phyllanthus
planta contra las células cancerosas de la piel y de próstata aún no está claro, nuestros resultados han revelado que
Phyllanthus
planta ejerce su inhibición del crecimiento hacia las células del cáncer a través de la modulación ciclo celular y la inducción de apoptosis a través de la activación de caspasas. Se necesitan más purificaciones de
Phyllanthus
extractos y las investigaciones de la vía de la apoptosis para revelar el modo exacto de acción de
Phyllanthus
planta por sus propiedades anti-cáncer.
Materiales y métodos
extractos de plantas y medicamentos estándar
extractos acuosos y metanólicos de cuatro
Phyllanthus
especies (
P.amarus, P.niruri, P.urinaria, y P .watsonii
) fueron proporcionados por el Dr. Indu Bala, Centro de Biotecnología, MARDI. Recién cosechadas muestras de plantas se lavaron, se secaron a temperatura ambiente y luego se liofilizó. Para el extracto acuoso, muestra de planta seca se empapa con agua ultra pura, mientras que se utilizó metanol absoluto durante la preparación del extracto metanólico. Las muestras se homogeneizaron con tampón de extracción y el sobrenadante recogido después de tres rondas de extracción. La doxorrubicina y 5'Fluorouracil fueron los fármacos estándar utilizados como controles positivos en este estudio. Ambas muestras analizadas; extractos de plantas y medicamentos estándares se almacenaron a -20 ° C.
cromatografía líquida de alta resolución acoplada con ionización por electropulverización (ESI) y espectrometría de masas (LC-MS-MS) análisis
Para el agua extraída muestras, se secó 2 ml de sobrenadante en un concentrador de vacío (concentrador 5301 Eppendorf, Alemania) y se volvió a disolver en 20 mg /ml con 30% de metanol antes de ser sometida para el análisis LC-MS-MS. Para aquellas muestras extraídas con metanol, sobrenadante total se evaporó usando un evaporador rotatorio (Rotavapor RII, BUCHI, Suiza) y re-disuelto de nuevo con 20% de metanol. Las muestras entonces se separaron con columna de extracción en fase sólida (SPE) (LiChrolut RP-18 1000 mg /6 ml, Merck Alemania) con fase móvil de 60% de metanol y 70% de metanol. Todos los eluatos se concentraron a 0,5 ml, después se diluyó 8 veces con 40% de metanol antes de ser sometida para el análisis LC-MS-MS.
Las muestras se separaron usando un sistema de HPLC que comprende de una bomba binaria de HPLC, un compartimiento automuestreador inyector y detector de diodos (DAD) (1200 series, Agilent Technologies, Alemania). Las separaciones se llevaron a cabo utilizando una fase inversa C-18, 150 mm x 4,6 mm d.i, tamaño de partícula 5 micras columna Thermo Hypersil GOLD (Thermo Scientific, Reino Unido). La separación se desarrolló utilizando una fase móvil de ácido fórmico al 0,1% en agua (disolvente A) y ácido fórmico al 0,1% en acetonitrilo (disolvente B) con un ajuste de gradiente de disolvente B: 5% (5 min), 5-90% (60 min), 5% (4 min) a un caudal de 1 ml /min. El volumen de inyección se fijó en 20 l y las detecciones eran tanto a 280 nm y 360 nm. Para el análisis de espectrometría de masas, 3200 sistema QTrap LC /MS /MS (appiled Bioscience - MDS Sciex) se utilizó con la fuente de hierro y el voltaje se mantuvo a 500 ° C y -4,5 kV para ionización negativa, respectivamente. Generador de nitrógeno fue fijado para ser operado a 60 psi cortina de flujo de gas, el flujo de gas de la fuente 90 psi y flujo de gas de escape 60 psi. Se eligieron dos tipos de modos de escaneo: mejorar espectrómetro de masas (EMS) y mejorar producto iónico (PAI) para un análisis completo espectros de masas que van desde
m /z 100-1200
El cultivo celular.
Mewo (HTB-65) celular, RWPE-1 de células de melanoma de piel de cáncer de próstata PC-3 (CRL-1435) las células, normal de la piel humana CCD-1127Sk (CRL-2565) y la próstata (CRL-11609) líneas fueron adquiridos de American Type Culture Collection (ATCC). Las cuatro líneas de células se cultivaron con diferentes medios de comunicación, EMEM (Medio de Eagle esencial mínimo) para las células Mewo, medio RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute) para las células PC-3, y el crecimiento de queratinocitos, CC-4455 (Lonza, EE.UU.) para RWPE-1 en las células y DMEM (Dulbecco modificado de Eagle Medium) para las células CCD-1127Sk. El medio de crecimiento se complementó con inactivado por calor 10% de suero fetal bovino (FBS, Gibco). Las células se mantuvieron en el aire humidificado con un 5% de CO
2 a 37 ° C. Las células se recogieron usando tripsina al 0,25% (Hyclone) cuando alcanzan 70-80% de confluencia en frascos de cultivo. Las células que sufren crecimiento exponencial se usaron en todos los experimentos.
detección de citotoxicidad
Las células se sembraron a la densidad celular óptima en placas de 96 pocillos estériles y se incubaron durante la noche para la fijación.