Extracto
La expresión aberrante de las cadherinas y catenina desempeña un papel fundamental en el desarrollo del cáncer de ovario y la progresión. Plakoglobin (PG, γ-catenina) es un parálogo de β-catenina con doble adhesivo y funciones de señalización. Mientras β-catenina ha conocido la función oncogénica, PG generalmente actúa como un supresor de tumores /metástasis. Recientemente, hemos mostrado que PG interactuó con p53 y que su función inhibidora del crecimiento /metástasis puede ser mediada por esta interacción. Se sabe muy poco sobre el papel de PG en el cáncer de ovario. A continuación, se determinó la
in vitro
tumoral /metástasis efectos supresores de PG en líneas celulares de cáncer de ovario con la expresión de p53 mutante y diferentes perfiles de cadherina. Hemos demostrado que la N-cadherina expresión y E-cadherina y PG ES-2 células deficientes eran altamente migratoria e invasiva, mientras OV-90 células que expresan E-cadherina, PG y muy poca /ninguna N-cadherina no lo eran. la expresión exógena de PG o E-cadherina o desmontables N-cadherina en células ES-2 (ES-2-E-cad, ES-2-PG y ES-2-SHN-cad) redujo significativamente su migración y la invasión. Además, la expresión de PG o desmontables N-cadherina se redujo significativamente ES-2 crecimiento celular. Por otra parte, PG interactuó con ambos cadherinas y con el tipo salvaje y mutantes de p53 en las líneas celulares ES-PG-2 normales y de ovario, respectivamente
Visto:. Alaee M, Danesh G, H Pasdar (2016) Reduce el Plakoglobin
in vitro
crecimiento, migración e invasión de células de cáncer ovárico que expresan N-cadherina y p53 mutante. PLoS ONE 11 (5): e0154323. doi: 10.1371 /journal.pone.0154323
Editor: Zhiqian Zhang, la Universidad de Pekín Hospital del Cáncer & amp; Instituto, CHINA
Recibido: 9 de diciembre de 2015; Aceptado: 12 Abril de 2016; Publicado: 4 Mayo 2016
Derechos de Autor © 2016 Alaee et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue financiado por la Fundación canadiense del cáncer de mama, Praderas /TNM (MP, operativo); Fundación Alberta Cáncer (MA, becas para graduados); Mujeres & amp; Instituto de Investigación de Salud Infantil (GD, beca de verano): perfil
Conflicto de intereses:. Los autores declaran no tener ningún intereses en competencia
Introducción
El cáncer de ovario (OVCA), el quinto más frecuente. cáncer en la mujer es la principal causa de las muertes por cáncer reproductivos femeninos en todo el mundo, con una tasa de supervivencia global a cinco años de ~ 45% [1]. La principal forma de OVCA es el cáncer de ovario epitelial (EOC), que representa el ~ 80% de todos los tumores de ovario [2]. COE se clasifican en tipo I y tipo II [3]. Los tumores de tipo I son genéticamente estables de crecimiento, lento, y tienen relativamente buena evolución clínica. Sin embargo, la mayoría de OVCA son de tipo II. Más del 90% de estos tumores albergan mutaciones de p53, son genéticamente inestables, altamente agresivos y tienen pobres resultados clínicos [4-6].
TP53
mutaciones se cree que son un evento temprano en el desarrollo de tumores de tipo II y contribuir a la progresión de la metástasis y la quimio-resistencia [7-12]. p53 es un factor de transcripción y supresor de tumor que desempeña funciones esenciales en la regulación de la proliferación celular, supervivencia, senescencia, la apoptosis y el metabolismo [13]. En respuesta al estrés, p53 activa respuesta al daño del ADN, la detención del ciclo celular y la muerte celular [14,15]. Diferentes modificaciones postraduccionales y las interacciones proteína-proteína regulan la estabilidad y las funciones de p53 [16]. Hemos identificado plakoglobina (PG, γ-catenina) como nuevo socio de interactuar tanto de tipo salvaje (WT) y p53 mutante (MP53) [17,18].
Plakoglobin es un miembro de la familia del armadillo de proteínas y un paralog de β-catenina [19,20]. A diferencia, β-catenina, que sólo se asocia con las uniones adherentes y posee funciones oncogénicas conocidas, PG es una proteína supresora de tumores /metástasis y participa en la formación de ambas uniones adherentes y desmosomas [19,21]. PG puede conferir el crecimiento /metástasis efectos inhibidores a través de sus interacciones con las cadherinas y la inducción de la inhibición por contacto del crecimiento [19]. Además, puede interactuar con un número de parejas intracelulares incluyendo factores de transcripción [17-19,22-27]. Hemos demostrado que PG interactúa con p53 y su función tumor /metástasis supresor puede, al menos parcialmente, estar mediada por esta interacción [17,18]
.
Un número de estudios han sugerido que la pérdida de cadherina compleja catenina y la activación de la función oncogénica β-catenina juegan papeles clave en la invasión local de células tumorales de ovario y la posterior metástasis [28-31]. Además, la pérdida de heterocigosidad del gen PG (JUP) ha sido reportado en OVCAs esporádicos [32]. Sin embargo, se sabe muy poco sobre el papel de PG en OVCAs. En este estudio, se evaluaron las posibles funciones del tumor /supresores de metástasis de PG en OVCAs, usando la línea celular de ovario de IOSE-364 y Ovča líneas celulares normales OV-90 (PG y E-cadherina positivo, MP53 expresar), ES-2 ( PG y e-cadherina negativos, N-cadherina positivo y MP53 expresar), ES-2-PG (ES-2 transfectantes que expresan PG), ES-2-e-cad (ES-2 transfectantes que expresan e-cadherina) y ES- 2-SHN-CAD (ES-2 células en las que la N-cadherina ha sido derribado). Se examinaron los niveles de PG, localización e interacciones con E y N-cadherina y p53 y se evaluó el crecimiento, propiedades migratorias e invasivas de diversas líneas celulares. Los resultados mostraron que PG interactuó con ambos cadherinas y p53. exógenos expresión de E-cadherina o PG o desmontables de N-cadherina redujo significativamente la migración y la invasión de las células ES-2. Además, la expresión de PG y N-cadherina desmontables pero no la expresión de cadherina E redujo significativamente el crecimiento de las células ES-2.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y condiciones de cultivo
IOSE -364 (en adelante IOSE) se cultivaron en una mezcla 1: 1 de medios M199 y M105 MCDB más 5% de FBS y 1% PSK (penicilina, estreptomicina, kanamicina). OV90 células se mantuvieron en los mismos medios de comunicación M199 y M105 MCDB más 15% de FBS y 1% PSK. ES-2 células fueron cultivadas en medios de McCoy 5A completado con FBS 10% y 1% PSK. ES-2-E-cad y células ES-2-PG fueron cultivadas en ES-2 medios que contienen 400 mg /ml (selección) o 200 mg /ml de G418 (mantenimiento). ES-2-shNcad hormigas transfectar fueron cultivadas en medios ES-2 con 1μg /ml (selección) o 0,5 mg /ml (mantenimiento) puromicina.
La transfección
Los plásmidos que codifican E-cadherina y PG se han descrito [33, 34]. Los cultivos de células ES-2 en 60 mm o 100 mm platos fueron transfectadas a 50-75% de confluencia con 10-25μg de ADN utilizando fosfato de calcio. Veinte horas después de la transfección, las células se enjuagaron con PBS y se dejaron recuperar durante 24 horas en medio de crecimiento completo. Para seleccionar los transfectantes estables, 72 h después de la transfección, se añadieron los medios que contienen 400 mg /ml de G418 (ES-2- PG y ES-2- transfectantes E-cad) a las células y seleccionaron las colonias resistentes durante 3-4 semanas. Los clones resistentes se mantuvieron en 200 mg /ml de G418 y se seleccionaron para PG y E-cadherina expresión mediante ensayos de inmunofluorescencia e inmunotransferencia.
N-cadherina caída
Humano N-cadherina lentiviral shRNA plásmido [35 ] se utilizó para transfectar células Phoenix-anfo utilizando fosfato de calcio. lentiviral partículas recogidas a las 48 y 72 horas después de la transfección se combinaron y se filtraron usando un filtro de unión 0.45μm baja en proteínas. partículas lentivirales se utilizaron para transducir ES-2 células en presencia de polyberene ml 8μg /(Santa Cruz, Canadá). líneas celulares estables resistentes a la puromicina que expresan la cadherina N shRNAs (ES-2-SHN-cad) se aislaron y los niveles de N-cadherina evaluados por inmunoblot e inmunofluorescencia.
Análisis de inmunotransferencia
confluentes placas de cultivo de 100 mm se enjuagaron con PBS frío y solubalized en tampón de muestra SDS (10 mM Tris-HCl pH 6,8, 2% (w /v) SDS, ditiotreitol 50 mM, EDTA 2 mM, PMSF 0,5 mM, 1 mM de NaF, 1 mM de Na
3Vo
4). Igual cantidad de proteínas celulares totales se separaron por SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (BioRad, Canadá). Las membranas se incubaron en anticuerpos primarios específicos durante la noche a 4 °
C seguido de los anticuerpos secundarios apropiados a temperatura ambiente (Tabla 1). Las membranas fueron escaneados utilizando un sistema de imágenes de infrarrojos Odyssey CLx.
Se establecieron
inmunofluorescencia
cultivos de células confluentes en cubreobjetos de vidrio y se lavaron con PBS frío que contenía 1 mM de cada uno de NaF, Na
3Vo
4 y CaCl
2. Las células se fijaron con 3,7% de formaldehído durante 20 minutos y se extrajeron con tampón de CSK (NaCl 50 mM, sacarosa 300 mM, 10 TUBOS mM pH 6,8, MgCl 3 mM
2, 0,5% de Triton X-100, PMSF 1,2 mM, y 1 mg /ml de DNasa y RNasa; [17]) durante 10 minutos. Los cubreobjetos se bloquearon con 4,0% de suero de cabra y 50 mM NH
4Cl
4 en PBS que contenía 0,2% de BSA durante 1 hora. Los cubreobjetos se incubaron a continuación en los anticuerpos primarios específicos para 1 hora, seguido de los anticuerpos secundarios durante 30 minutos a las concentraciones indicadas en la Tabla 1. Los núcleos se contratiñeron con DAPI (1: 2000). Los cubreobjetos se montaron en Elvanol que contiene 0,2% (w /v) parafenilendiamina (PPD) y vistos usando una lente objetivo 63x de un microscopio confocal Zeiss.
inmunoprecipitación
cultivos se hicieron crecer hasta la confluencia en placas de 100 mm y se enjuaga con PBS frío que contiene 1 mM NaF, Na
3Vo
4 y CaCl
2. Las células se extrajeron en 1 ml de tampón de lisis (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% desoxicolato de sodio, 0.7μg /ml de pepstatina, 1 mM Na
3Vo
4, 1 NaF mM, y cóctel inhibidor de la proteasa) durante 20 minutos en un agitador a 4 ° C. Las células se rasparon y se centrifugaron a 48000xg durante 10 minutos. Los sobrenadantes se procesaron para la inmunoprecipitación con anticuerpos p53 y PG (Tabla 1) y 40 l de agarosa proteína G perlas noche a la mañana en una mecedora-rotador a 4 ° C (Thermo Fisher Scientific, Canadá). Las muestras se centrifugaron a 14000xg durante 2 minutos, las perlas se retiraron y los sobrenadantes se procesaron para una segunda inmunoprecipitación durante 3 horas. Los granos de las dos inmunoprecipitaciones se combinaron y se lavaron tres veces con el tampón de lisis. Los complejos inmunes se solubilizaron en 60 l de tampón de muestra SDS, se separaron mediante SDS-PAGE y se procesaron para inmunotransferencia como se describió anteriormente.
Crecimiento, migración y la invasión de ensayo
Para ensayo de crecimiento in vitro, 3x10
4 células de ES-2, ES-2-e-cad, ES-2-PG y ES-2-SHN-cad células se sembraron en una placa de 24 pocillos. A la 1, 3, 5 y 7 días después de la siembra, los cultivos se trataron con tripsina y se contaron las células. Cada punto de tiempo representa el promedio de tres experimentos independientes.
Para los ensayos de migración celular, 2 × 10
5 células se resuspendieron en 0,5 ml de medio libre de suero y se colocaron en la cámara superior del transwell insertos (3μm poro, de 6,5 mm de diámetro; BD Biosciences, CA, EE.UU.). medios normales que contienen 10% de FBS se añadió a la cámara inferior y se incubaron los cultivos durante 16 horas a 37 ° C. Los insertos se transfieren a continuación a nuevos platos y se aclararon con PBS para eliminar las células unidas por la ONU. Los insertos se fijaron con 3,7% de formaldehído (en PBS) durante 2 minutos, permeabilizadas con 100% de metanol durante 20 minutos y se tiñeron con tinción de Giemsa durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de la tinción, las membranas se observan bajo un microscopio invertido usando una lente objetivo 20x y fotografiado.
Para ensayos de invasión de Matrigel, las células se mueren de inanición en medio libre de suero durante 24 horas antes del ensayo. Para cada línea celular, 5 × 10
4 células en 0,2 ml de medio libre de suero se sembraron en el compartimiento superior de cámaras de invasión recubiertas con Matrigel (8 micras de poro de membrana PETE; BD Biosciences). Se añadió medio acondicionado de fibroblastos (0,8 ml) a las cámaras inferiores y las placas se incubaron durante la noche a 37 ° C. Después de 16 horas, las membranas se recuperan y se procesaron como se describe para el ensayo de migración. membranas montadas fueron vistos bajo una lente objetivo de 20x de un microscopio invertido y fotografiada.
Las células /invadidos migraron fueron contados en 5 campos al azar para cada membrana mediante el programa contador de células ImageJ. Los números para cada línea celular se promediaron y se normalizaron a los de la línea normal de las células o las células no transfectadas y los histogramas de los padres construido. Los histogramas representan la media de al menos 3 ensayos independientes para cada línea celular.
El análisis estadístico
Los valores se presentan como media ± desviación estándar. Las diferencias estadísticas entre los grupos se evaluaron mediante pruebas t de Student.
P-valor
. & Lt; 0,05 fue considerado significativo
Resultados
Expresión de proteínas de marcadores epiteliales y mesenquimales y p53 en diversas líneas celulares Ovča
Proteína expresión de e-cadherina, N-cadherina, plakoglobina, citoqueratinas, vimentina y p53 en IOSE, ES-2 y células OV-90 se detectó usando el análisis de inmunotransferencia (Fig 1). células IOSE tenían muy poca, o ninguna, E-cadherina y expresaron N-cadherina y PG. Estas células también expresan citoqueratinas, vimentina y p53. Estas observaciones fueron consistentes con los resultados anteriores indican que las células normales de OSE muestran ambos marcadores epiteliales y mesenquimales [36]. Por el contrario, OV-90 células que expresan MP53 [37] no tenía detectable N-cadherina, los bajos niveles de vimentina y altos niveles de marcadores epiteliales incluyendo E-cadherina, PG y citoqueratinas. ES-2 células, que también expresan MP53 [38, 39], muestran un fenotipo mesenquimal más, carecía de E-cadherina y PG y expresó N-cadherina, vimentina y niveles muy bajos de citoqueratinas.
lisados de células totales de IOSE-364, se procesaron ES-2 y OV-90 células para el análisis de inmunoblot utilizando N-cadherina, e-cadherina, plakoglobina, vimentina, citoqueratinas y anticuerpos p53. La igualdad de las cargas se confirmaron mediante el procesamiento de los mismos lisados con anticuerpos actina.
Niveles y localización de E-cadherina, N-cadherina y plakoglobina en líneas celulares normales y carcinoma de ovario
Distribución subcelular y el potencial de co-localización de E- /N-cadherina con PG fueron examinados por doble tinción de inmunofluorescencia (Fig 2). En las células IOSE, en consonancia con los resultados de inmunotransferencia, los niveles de E-cadherina fueron indetectables mientras que la N-cadherina y PG se expresaron en niveles altos y fueron co-distribuido en la membrana (Figura 2, IOSE). En OV-90 células, los altos niveles de cadherina E y PG estaban presentes y se colocalized en la membrana. También se pudo detectar apenas distribuimos pequeños grupos de células positivas N-cadherina en OV-90 culturas. En estos parches, N-cadherina se colocalized con PG (Figura 2, OV-90). En las células ES-2, no hubo detectable E-cadherina o PG, mientras que expresaron altos niveles de N-cadherina, que se distribuyó por todo el citoplasma (Fig 2, ES-2). Consistentes con la ausencia de PG y uniones adhesivas, las células ES-2 mostraron significativamente menos contacto de célula a célula y su morfología era claramente diferente de las células IOSE y OV-90.
IOSE-364, ES-2 y OV-90 células se cultivaron en cubreobjetos y se procesaron para la tinción de inmunofluorescencia doble. E-cadherina (E-cad, rojo) o N-cadherina (N-cad, rojo) y plakoglobina (PG, verde) se utilizaron anticuerpos a las concentraciones indicadas en la Tabla 1. Los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). Bar, 25 micras.
La ausencia de E-cadherina y la expresión de PG y la presencia de N-cadherina contribuyen a las propiedades migratorias e invasivas de las células ES-2
Anteriormente, hemos demostrado que la expresión de PG en células de carcinoma PG-deficientes que carecen de e-cadherina y expresar N-cadherina disminuye su
in vitro
crecimiento, la migración y la invasión [33, 34]. Para examinar si PG tuvo efectos similares en las células Ovča, lo primero que examinó las propiedades de migración e invasión de células IOSE, OV-90 y ES-2. Entonces, expresamos de forma exógena E-cadherina o PG o noqueado N-cadherina en estas células y se evaluaron los cambios en su crecimiento, la migración y la invasión. Como se representa en la figura 3A, OV-90 células mostraron significativamente menor migración y la invasión en relación con Iosé células (8,4% y 0,4%, respectivamente). Por el contrario ES-2 células fueron significativamente más migratoria e invasiva comparar con Iosé células (138% y 196,4%, respectivamente).
(A) Migración (izquierda) y la invasión (derecha) de IOSE-364, OV -90, ES-2 células. Los cultivos se procesaron para los ensayos de migración y la invasión in vitro como se describe en Materiales y Métodos. El número de células migradas /invadidas se normalizó a las de las células IOSE-364. (B) La expresión de E-cadherina, N-cadherina y plakoglobina en ES-2 transfectantes que expresan E-cadherina (ES-2-E-cad) o plakoglobina (ES-2-PG) o N-cadherina shRNAs (ES-2 -shN-cad). Los transfectantes estables se procesaron para la inmunotransferencia utilizando E-cadherina, plakoglobina y anticuerpos N-cadherina. Para confirmar la igualdad de las cargas, los mismos lisados celulares se procesaron con anticuerpos de actina. (C) Distribución subcelular y colocalización de E-cadherina, N-cadherina y plakoglobina en ES-2- E-cad, ES-2-PG y transfectantes ES-2-SHN-cad. Los transfectantes estables se establecieron en cubreobjetos y se procesaron para inmunofluorescencia doble con E-cadherina (E-cad, rojo) o N-cadherina (N-cad, rojo) y plakoglobina (PG, verde) anticuerpos. Los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). Bar, 25 micras.
Exógenos expresión de E-cadherina y PG y la caída estable de N-cadherina en ES-2 transfectantes se confirmó mediante inmunotransferencia (Figura 3B) y los análisis de inmunofluorescencia (Figura 3C). En ES-2-E-cad células (Fig 3B y 3C, ES-2-Ecad), E-cadherina se expresó y se localizan principalmente en la membrana aunque también se detectó en el citoplasma de los transfectantes. Curiosamente, la expresión de PG en ES-2-PG células (Figura 3B y 3C, ES2-PG) condujo a la regulación al alza de la E-cadherina endógena. En estas células, la exógena expresó PG colocalized tanto con N-cadherina y E-cadherina (Fig 3B y 3C, ES2-PG). knockdown N-cadherina reduce los niveles de la endógeno N-cadherina (& gt; 90%). La tinción de estos cultivos con anticuerpos N-cadherina detecta células ocasionales que apenas se tiñeron (Figura 3B y 3C, ES2-SHN-CAD).
Evaluación de la migración y la invasión de ES-2 transfectantes mostró una reducción significativa en tanto la migración y la invasión de las células PG-ES-2 ES-2-Ecad y relativos a ES-2 parentales células (Fig 4A, 4B y 4D). la expresión de E-cadherina en ES-2 células reduce la migración y la invasión de estas células en un 39% y 42%, respectivamente. expresión de PG en ES-2 células disminuyó la migración y la invasión de 58% y 44%, respectivamente. El efecto de la caída N-cadherina en la migración fue similar a la de la expresión de PG, es decir, una reducción de 65%, mientras que la invasión de las células ES-2-Shn-cad fue significativamente menor que la de ES-2-E-cad y ES -2-PG células (reducción del 68%) (figura 4A, 4B y 4D).
IOSE-364, OV-90, ES-2 y ES-2 transfectantes (ES-2-e-cad, ES-2-PG, ES-2-SHN-cad) se procesaron para la migración (a) y ensayos de invasión) (B como se describe en Materiales y Métodos. El número de células migradas /invadidas se normalizó a las de las células IOSE-364. (C) Replicar cultivos de células ES-2 y ES-2 transfectantes (E-cad, PG y SHN-cad) se sembraron en una sola célula (3x10
4) densidad. Los cultivos se contaron en el día 1, 3, 5 y 7. Cada punto de tiempo es la media de tres experimentos independientes. (D) Resumen de los cambios en el crecimiento, la migración y la invasión de ES-2 transfectantes. los valores se normalizaron a transfectantes ES-2 células.
p
valores, * & lt; 0,05, ** & lt; 0.001.
También comparó el crecimiento de las células ES-2 con los de ES-2-E-cad, ES-2-PG y ES-2-SHN-cad transfectantes (Figura 4C y 4D). En el día 7, las células ES-2-E-cad mostraron que la tasa de crecimiento similar a la ES-2 células, mientras que las células ES-2-PG y ES-2-SHN-cad mostraron un crecimiento significativamente menor que ES-2 células (21% y 25 % de reducción, respectivamente, (Fig 4C y 4D). Sin embargo, mientras que las células ES-2-SHN-CAD mostraron disminución del crecimiento a lo largo de los 7 días, los cultivos ES-2-PG mostraron disminución del número de células después de días 5, probablemente debido a la inducción de inhibición por contacto sobre la cultura de confluencia (figura 4C).
en conjunto, estos resultados sugieren que la expresión de e-cadherina o PG o desmontables de N-cadherina reduce eficazmente la migración y la invasión de las células ES-2. Sin embargo, única expresión PG o N-cadherina desmontables disminuyó significativamente el crecimiento de estas células.
Interacción de plakoglobina y p53 en líneas celulares de carcinoma de ovario normales y
Hemos demostrado que PG interactuó con ambos WT y MP53 en diversas líneas de células de carcinoma y los dos asociados con los promotores de una serie de p53 diana genes [17, 18, 40] interacciones. de PG con MP53 expresando células de carcinoma conducido a una disminución del crecimiento, la migración y la invasión de estas células. Con este fin, hemos examinado si PG asociado con p53 en células Ovča. extracto total de células de IOSE, ES-2 y células-PG ES-2 fueron procesados para coimmunoprecipitation recíproca (co-IP) e inmunotransferencia con anticuerpos PG y p53 (Tabla 1). En las células IOSE anticuerpos PG coprecipitan p53 y PG (Fig 5). Los anticuerpos usando p53 co-IP recíprocas coprecipitan PG, además de validar la interacción entre PG y p53 en estas células. En ES-2 células que expresan PG exógeno y endógeno MP53, los anticuerpos PG coprecipitado p53 y PG. En el recíproco co-IP de las células ES-2-PG, anticuerpos p53 destruyó a las PG y p53 (Figura 5). En contraste, en ES-2 células sin expresión PG, los anticuerpos p53 p53 precipitan solamente (Fig 5). inmunoprecipitaciones de control con p53 y anticuerpos preinmunes PG no detectaron la proteína, ya sea en el total de lisados celulares (Figura 5B).
Cantidades iguales de extractos celulares totales (TCE) a partir de IOSE-364, ES-2 y ES-2 células -PG se procesaron para la inmunoprecipitación recíproca y secuencial (IP) e inmunotransferencia (IB) utilizando p53 y anticuerpos plakoglobina (a) o anticuerpos preinmunes (B) como se describe en Materiales y Métodos. Los mismos lisados se procesaron con anticuerpos de actina para confirmar la igualdad de las cargas. PG, plakoglobina; Pi, pre-inmune.
Discusión
En el estudio actual, por primera vez, hemos investigado los
in vitro
tumoral /metástasis efectos supresores de PG en líneas celulares con expresión de EOC MP53 y diferentes perfiles de cadherina. Hemos demostrado que la ES-2 células que expresan N-cadherina y son deficientes en la E-cadherina y PG fueron altamente migratoria e invasiva. Por el contrario, OV-90 células que expresan tanto E-cadherina y PG y muy poco N-cadherina no eran migratorio o invasivo. La expresión exógena de PG o E-cadherina o desmontables de N-cadherina en células ES-2 reduce significativamente su migración y la invasión. Nuestros datos muestran que PG colocalizó tanto con E-cadherina y N-cadherina en los complejos de adhesión. Consistente con estas observaciones, se detectó una reducción significativa en ES-2-PG y ES-2-Shn-cad crecimiento relativo a ES-2 y ES-2-E-cad células. Por otra parte, PG interactuó con p53 en las células WT IOSE y MP53 en transfectantes ES-2-PG.
cadherina se cambia de E a la N-cadherina es un paso crítico en la transición epitelial a mesenquimal (EMT) mediada tumores malignos [41, 42]. EMT lleva al desmontaje de unión célula-célula, la pérdida de la polaridad celular y el aumento de las propiedades migratorias e invasivas [30, 43, 44]. Si bien E-cadherina es un marcador epitelial y un supresor tumoral conocido, N-cadherina es un marcador mesenquimal y su expresión se asocia con un fenotipo más migratorio e invasivo [44, 45]. Las células normales del epitelio superficial del ovario (OSE) expresan una combinación de marcadores epiteliales y mesenquimales. Estas células no tienen E-cadherina, pero expresan N-cadherina, cateninas, vimentina y citoqueratinas [36, 46-50]. De acuerdo con estos informes, las células expresaron IOSE N-cadherina y vimentina, así como cateninas incluyendo PG, y citoqueratinas. El papel exacto de interruptor /N-cadherina E en la iniciación y progresión de los carcinomas de ovario no es muy clara, ya que ambos cadherinas pueden ser expresados en los tumores de ovario de diferentes orígenes y en diferentes etapas [51, 52]. Sin embargo, aunque algunos estudios sugieren que la E-cadherina está regulada positivamente en los derrames Ovča [52, 53], la gran mayoría sugieren que la pérdida o reducción de los niveles de E-cadherina contribuyen a la transición de benigno a borderline lesiones de ovario, a pobremente diferenciado tumores de ovario, y para la invasión y la metástasis locales [28, 47, 54-58]. En consonancia con las actividades supresores de tumores de E-cadherina, regulación a la baja /falta de expresión de E-cadherina, debido a los altos niveles de sus represores de la transcripción Snail, haga girar y ZEB-2 se ha asociado con las propiedades migratorias e invasivas de ES-2 y otra células Ovča [59-71]. Además, E-cadherina suprime el crecimiento y la metástasis a través de la inhibición de la tirosina quinasa del receptor de señalización y PI3K /Akt [72, 73]. De acuerdo con estos estudios, se demostró que las células ES-2-E-cad tenían significativamente más baja migración y la invasión (39% y 42%, respectivamente) en comparación con las células ES-2.
A pesar de N-cadherina es expresado en OSE normales, su expresión se asocia generalmente con un aumento de la migración y la invasión de OVCA [74-76]. los niveles de N-cadherina se han demostrado ser elevados en líneas celulares que expresan Snail y ZEB-1, así como, en los pacientes con mayor grado del tumor y la metástasis FIGO [51, 64, 77]. expresión exógena de MUC4 en las células SKOV3 condujo a la regulación por disminución de E-cadherina, la regulación positiva de N-cadherina y aumento de la motilidad. knockdown N-cadherina en estas células motilidad reducida MUC4 inducida, concurrente con disminución de la actividad de ERK1 /2, Akt y MMP9 [78]. Apoyando a estos estudios, un anticuerpo anti-N-cadherina selectiva (Exherin, ADH-1) ha demostrado recientemente ser eficaz en la estabilización de la progresión de la enfermedad en dos pacientes Ovča en una pequeña fase I estudio clínico, que evaluó pacientes con diversos tumores sólidos [79 ]. Aquí, mostramos que en relación con ES-2 células, la migración y la invasión de ES-2-SHN-cad transfectantes se redujeron en un 65% y 68%, respectivamente. Además, derribando N-cadherina era mucho más eficaz en la reducción de la migración y la invasión de expresar E-cadherina en ES-2 células. Del mismo modo, mientras que la expresión de E-cadherina tenía muy poco efecto (5%) en la disminución de crecimiento, la expresión de PG o knockdown N-cadherina reducido significativamente ES-2 células de crecimiento (20%, 25%, respectivamente)
.
A diferencia cadherinas, se sabe muy poco sobre el papel de PG en OVCA. PG se ha demostrado que tiene la función inhibidora del crecimiento /metástasis, tanto
in vitro
y
in vivo
[19]. Esta función de PG puede estar mediada por la estabilización /secuestrantes N-cadherina y la inducción de la inhibición por contacto del crecimiento y /o interactuar con diferentes proteínas celulares, incluyendo factores de transcripción [17-19, 27,34,40,80-82]. Aquí, la expresión exógena de PG redujo significativamente la migración y la invasión de ES-2 células (58% y 44% respectivamente). El efecto de PG en la inhibición de la migración fue significativamente mayor que la de E-cadherina. Dado que la expresión PG es necesario para la formación tanto de uniones adherentes y desmosomas [19,33], esto puede sugerir que PG reduce la migración a través de la asociación con N-cadherina y formación de uniones, así como la interacción con factores de transcripción y regulación de la expresión génica. Interacción de PG con varios factores de transcripción tales como TCF /LEF, CBP, SOX4 y p53 se ha informado anteriormente [17, 22 a 26, 81]. Hemos demostrado que PG interactuó con MP53 en varias líneas de células de carcinoma y los dos asociados con los promotores de una serie de genes diana de p53, incluyendo supresores tumorales
SFN
(14-3-3s) y
NME1
y el genoma organizador oncogénico
SATB1
. Por otra parte, estas asociaciones fueron concurrentes con la reducción del crecimiento, la migración y la invasión [17,18]. PG también regula la expresión de HAI-1 y redujo la migración de una manera dependiente de p53 en células de NSCLC [27]. Aquí, mostramos que PG interactuó con p53 en las células WT IOSE y con MP53 en las células ES-PG-2. p53 regula la expresión de marcadores de EMT como Twist, caracoles y babosas [82-86]. Se detectaron bajos niveles de E-cadherina en células ES-2-PG PG partir de su expresión. Si esta expresión de E-cadherina se debe a la regulación por disminución de la E-cadherina represores de la transcripción a través de la interacción PG-p53 o la estabilización de la proteína E-cadherina a través de su interacción con PG merece estudios adicionales.
En resumen, este es el primera demostración del papel de PG en las células Ovča. Nuestros datos mostraron que la expresión exógena de PG o desmontables de N-cadherina fueron más efectivos que la expresión de E-cadherina en la inhibición del crecimiento, propiedades migratorias e invasivas de las células ES-2. Estos resultados sugieren que la expresión PG secuestrado tumor /metástasis promoción de las actividades de N-cadherina. La inducción de la expresión de E-cadherina en ES-2 células que expresan exógeno PG, que interactuaba con la MP53 endógeno, plantea la posibilidad de que PG también pueden estar involucrados en la regulación de genes diana de p53 que participan en la migración y la invasión. En conjunto, los resultados sugieren que PG puede actuar como un supresor de tumores /metástasis en OVCA, como se ha demostrado para otros tipos de cáncer. La implicación más grande de nuestros estudios es el potencial de PG como una diana terapéutica para la mayoría de OVCAs con MP53 y N-cadherina expresión.
Reconocimientos
Agradecemos al canadiense tejido ovárico en el Banco BC Cancer Agency para proporcionar células IOSE-364. Nuestro trabajo es apoyado por la Fundación Canadiense del Cáncer de Mama Praderas /TNM Capítulo (MP) y por la Beca de la Fundación del Cáncer de Alberta Licenciado (MA). GD fue apoyado por una beca de verano del Instituto de Investigación de la Salud de la Infancia (WCHRI) Las mujeres y.